重症监护病房型装置在猪模型急性呼吸窘迫综合征中的卤化剂递送

摘要

我们描述了盐酸诱导的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的模型，该模型通过用于吸入重症监护镇静剂的装置接受卤化剂，异氟醚和七氟醚镇静的仔猪。该模型可用于研究卤化剂对肺损伤和修复的生物学机制。

摘要

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是危重患者低氧血症性呼吸衰竭和死亡的常见原因，迫切需要找到有效的治疗方法。临床前研究表明，吸入卤化剂可能对ARDS的动物模型有益。使用现代重症监护病房（ICU）呼吸机管理卤化剂的新设备的开发大大简化了卤化剂向ICU患者的分配。由于先前的实验和临床研究表明卤化挥发物（如七氟醚或异氟醚）对肺泡上皮损伤和炎症（ARDS期间弥漫性肺泡损伤的两种病理生理学标志物）的潜在益处，因此我们设计了一个动物模型来了解卤化剂对肺损伤和修复的影响机制。在全身麻醉、气管插管和开始机械通气后，通过气管内滴注盐酸在仔猪中诱导ARDS。然后，使用ICU型装置用吸入的七氟醚或异氟醚镇静仔猪，并在4 h期间用肺保护性机械通气对动物进行通气。在研究期间，收集血液和肺泡样本以评估动脉氧合，肺泡毛细血管膜的通透性，肺泡液清除率和肺部炎症。在整个实验过程中还收集了机械通气参数。尽管该模型诱导动脉氧合显著降低，肺泡-毛细血管通透性改变，但其可重复性，其特征是起效快、随时间稳定性好且无致命并发症。

我们开发了一种酸吸入仔猪模型，该模型再现了临床ARDS的大部分生理，生物学和病理学特征，这将有助于我们进一步了解通过用于吸入ICU镇静的装置输送的卤化剂的潜在肺保护作用。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是危重患者低氧血症性呼吸衰竭和死亡的常见原因^1。其特征是弥漫性肺泡上皮和内皮损伤，导致通透性和肺水肿增加，肺泡液清除率改变（AFC）和呼吸窘迫恶化²。肺泡水肿的再吸收和ARDS的恢复需要上皮液通过肺泡的运输以保持完整，这表明改善AFC的治疗可能是有用的^3，4。尽管肺保护性通气和静脉输液治疗的限制性策略已被证明有益于改善结局^2，5，但它们仍然与高死亡率和发病率相关^6。因此，迫切需要为该综合征开发有效的治疗方法，并更好地了解这些疗法可能起作用的确切机制。

异氟醚或七氟醚等卤化麻醉剂已被广泛用于手术室的全身麻醉。七氟醚与接受胸外科手术的患者肺部炎症减少以及术后肺部并发症（如ARDS^7）的减少有关。在心脏手术后患者的荟萃分析中也发现了类似的结果^8。卤化挥发物还具有支气管扩张作用^9，10，也许还有一些保护几个器官的特性，如心脏^8，11和肾脏^{12，13，14。}最近，人们对在重症监护病房（ICU）中将吸入麻醉剂作为镇静剂的临床使用越来越感兴趣。动物和人类研究都支持在肝脏^15，大脑^16或心脏11长期缺血之前用卤化剂进行预处理的保护作用。与其他静脉注射药物相比，卤化药物在镇静危重患者方面还具有潜在的药代动力学和药效学优势，包括快速起效和由于组织中积累很少而快速抵消。与接受心脏手术的患者的静脉镇静相比，吸入卤素药物可减少插管时间^17。一些研究支持卤化剂在ICU患者镇静中的安全性和有效性18，19，20。在ARDS的实验模型中，吸入七氟醚改善气体交换^21，22，减少肺泡水肿21，22，并减轻肺部和全身炎症^23。异氟醚还通过维持肺泡 - 毛细血管屏障的完整性来改善损伤后的肺修复，可能是通过调节关键的紧密连接蛋白^24，25，26的表达。此外，与未用异氟醚²⁷处理的巨噬细胞相比，用异氟醚培养和处理的小鼠巨噬细胞对嗜中性粒细胞具有更好的吞噬作用。

然而，迄今为止，解释挥发性麻醉剂的肺保护特性的确切生物学途径和机制仍然在很大程度上是未知的，需要进一步研究¹⁸。还需要进行其他研究，以调查七氟醚对肺损伤的确切影响，并验证实验证据是否可以转化为患者。我们团队的第一项随机对照试验发现，在ARDS患者中吸入七氟醚的给药与氧合作用改善和促炎细胞因子和肺上皮损伤标志物水平降低有关，如晚期糖基化终产物（sRAGE）的血浆和肺泡可溶性受体评估的那样²⁸.由于sRAGE现在被认为是肺泡1型细胞损伤的标志物和肺泡炎症的关键介质，这些结果可能表明七氟醚对肺泡上皮损伤的一些有益作用21，29，30。

使用卤化剂进行吸入性 ICU 镇静长期以来一直需要在 ICU 中部署手术室麻醉呼吸机和气体蒸发器。从那时起，已经开发了适合与现代重症监护呼吸机一起使用的麻醉反射器，用于ICU³¹中的特定用途。这些装置具有经过改良的热和水分交换过滤器，插入呼吸回路的Y形件和气管插管之间。它们允许施用卤化剂，其中异氟醚和七氟醚是最常用的，它们由多孔聚丙烯蒸发器棒组成，通过特定的注射器泵输送的液体剂被释放到其中。卤化剂在过期期间被装置中所含的反射介质吸收，并在下一次吸气期间释放，允许约90%的过期卤化剂^31，32再循环。最近，开发了该设备的微型版本，仪器死区为50 mL，使其更适合在ARDS患者的超保护通气期间使用，潮气量可低至200 mL³¹。这种小型化装置从未在ARDS的实验仔猪模型中进行过研究。

由于先前的研究支持卤化挥发物在ARDS期间肺泡炎症和损伤中的有希望的作用，因此我们设计了一个实验动物模型，以实现对卤化剂对肺损伤和修复作用机制的转化理解33，34，35。在这项研究中，我们开发了一种盐酸（HCl）诱导的猪的ARDS模型，其中可以使用麻醉剂保存装置（ICU型装置）的微型版本进行吸入镇静。这种ARDS的大型动物模型可用于进一步了解吸入卤化剂的潜在肺保护作用。

研究方案

该研究方案由法国 国家教育部 动物伦理委员会批准，批准号为01505.03，然后于 preclinicaltrials.eu（临床前注册标识符 PCTE00000129）注册。所有程序均在法国克莱蒙费朗 克莱蒙奥弗涅大学国际儿童内窥镜中心根据动物研究:报告体内实验（ARRIVE）指南³⁶进行。

1. 动物准备和麻醉

1. 仔猪模式
   1. 确保实验方案符合动物实验指南，包括3R原则（替换，减少和改进）和国家/国际法规。
   2. 在开始协议之前，获得伦理委员会的批准，以便在相关机构中护理和使用实验动物。
   3. 使用雄性白色Landrace仔猪（2-4个月大;体重10-15公斤）。
   4. 使用肌内注射氮杂龙（如1.2.2中所述）在用药前将仔猪置于仰卧位。
2. 麻醉诱导
   1. 限制动物过夜吃东西，同时允许自由取水。
   2. 在耳后使用肌内注射氮杂松（2 mg.kg^-1）对仔猪进行抗焦虑预用药。
   3. 用手指按压仔猪耳基部的软组织，以识别内侧和外耳静脉。
   4. 在仔猪的内侧或外耳静脉插入外周静脉注射22 G导管。随后以45°的浅角穿过皮肤，然后向前推进，直到血液通过导管出现。
   5. 用静脉注射丙泊酚（3 mg.kg-1）和舒芬太尼（0.3μ g.kg-1）诱导全身麻醉^37。通过对踏板反射缺乏反应来检查麻醉深度。
3. 气管插管^38，39
   1. 使用4号直米勒喉镜刀片准备喉镜。
   2. 将喉镜进入咽腔，用喉镜刀片压低舌头，使会厌可见。
   3. 在口管插管前观察仔猪的喉部开口。
   4. 插入一个内径为 6 mm 的气管插管。
   5. 给气管插管袖带充气，使气囊压力达到 2 O 左右 20–30_cmH。
   6. 用微孔手术胶带将气管插管固定在仔猪的鼻子上。
   7. 连接到呼吸机，并按照第 3 节中描述的设置启动机械通气。
4. 镇静维持
   1. 在酸性肺损伤前，通过连续静脉输注丙泊酚（5 mg.kg^-1.h^-1）来维持麻醉。当卤化剂开始时，丙泊酚的输注将停止。
   2. 加入连续静脉输注瑞芬太尼（10–20 μ g.kg⁻¹.h⁻¹ = 0.15–0.33 μ g.kg⁻¹.min⁻¹）进行疼痛管理。
   3. 加入连续静脉输注西沙曲库铵（0.2 mg.kg^-1.h^-1）进行神经肌肉阻滞。
   4. 使用温暖的毯子将仔猪的体温保持在约38°C。
   5. 使用外部监测仪连续监测心电图活动、外周血氧饱和度 （SpO₂） 和动脉压。
5. 手术
   1. 使用手术暴露右颈内静脉和Seldinger方法插入3腔导管（7法语，16cm）插入中心静脉通路。
      1. 在颈部腹侧做一个皮肤中线切口，距气管2厘米。使用手术钳解剖组织。
      2. 定位颈内静脉（约1-2厘米深，颈内动脉外侧），并使用针头（18 G，6.35厘米）进行颅尾方向的穿刺。
      3. 用手将"J"导丝（直径0.81毫米，60厘米）插入针头。轻轻取出针头，并沿着"J"导丝快速将三条线的静脉导管插入颈内静脉。取出"J"导丝，同时保持静脉导管就位。
      4. 通过静脉导管的每根管路抽吸血液，以除去不同管路中的空气，并用5mL盐水溶液（0.9%NaCl）冲洗三根管路。
      5. 按照连续的Lembert图案，用3.0不可吸收的缝合线缝合皮肤，并在中心静脉导管的每个侧穿孔上用一针和三重结将导管固定在皮肤上。
   2. 通过手术暴露右股动脉插入动脉线，并使用Seldinger方法插入热稀释导管（3-5法国，20厘米）。
      1. 将仔猪的右前肢伸展。
      2. 在仔猪的右腹股沟区域做一个皮肤切口。使用手术钳解剖皮下和肌肉组织。
      3. 通过触诊股动脉脉搏（约3-4厘米深）定位右股动脉，并使用针头（19 G，54mm）进行尾颅方向的穿刺。
      4. 将"J"导丝插入针头。轻轻取出针头，并沿着导丝快速将动脉插入股动脉。取下导丝，同时保持导管就位。
      5. 从动脉导管中取出空气，用生理盐水冲洗以冲洗管路。
      6. 按照连续的Lembert图案，用3.0不可吸收的缝合线缝合皮肤，并在动脉导管的每个侧穿孔上用一针和三重结将导管固定在皮肤上。
      7. 将导管插入动脉管，以便使用脉搏轮廓心输出量监测装置检索连续血液样本和连续血流动力学监测（动脉压、心脏指数和血管外肺水，与体重挂钩）。

2. 酸性急性肺损伤

注意:在此步骤中使用手套和眼镜，以避免酸与皮肤或眼睛接触的任何风险）

1. 在 0.05 M 和 pH 1.4 下制备 100 mL HCl。
2. 使用胸骨最后一段的解剖标志，测量气管插管尖端与仔猪肉眼之间的距离。
3. 用Ch14吸盘上的黑色笔标记此距离。
4. 将吸入导管通过气管插管插入黑色标志。
5. 通过吸痰导管轻轻滴注^{4 mL.kg-1（} 体重）酸超过3分钟。
6. 取出吸管。

3. 机械通气

1. 在重症监护呼吸机上使用容量控制通气。
2. 使用^{6 mL.kg-1}的潮气量，呼气末正压（PEEP）为5 cmH₂O，吸入氧分数（FiO_2）为40%。
3. 调整呼吸频率，将潮末二氧化碳维持在35至45毫米汞柱之间。
   注:根据先前的研究37，40，41，当动脉氧张力（PaO_2）与FiO₂的比例从基线降低到25%时，肺损伤被认为是确定的，大约在气道HCl滴注后1小时。

4. 卤化麻醉剂

注意:一旦达到酸性肺损伤，使用卤化麻醉剂（七氟醚或异氟醚）开始镇静。然后应中断使用丙泊酚的静脉镇静剂。

1. 填充注射器（图1A）:将制造商提供的填充适配器连接到250 mL卤化剂瓶中，将60 mL注射器连接到填充适配器。将瓶子倒置，通过推拉柱塞来填充注射器。将瓶子直立并取出注射器。
2. 清道夫（图1B）
   1. 放置木炭过滤器，用于去除卤代烃麻醉气体，靠近通风机。
   2. 从木炭过滤器上取下保护盖。
   3. 用柔性管将木炭过滤器连接到呼吸机的呼气阀。
3. 使用麻醉保存装置（用于吸入ICU镇静的装置）（图1C），如下所述。
   1. 将离聚膜干燥器管路连接到麻醉保存装置的气体采样口。
   2. 将气体采样管路的一侧连接到离聚膜干燥器管路。
   3. 将气体采样管路的另一侧连接到气体分析仪。
   4. 将麻醉保存装置插入呼吸回路的Y形片和气管插管之间。
   5. 确保麻醉剂保存装置的黑色面朝上，并向下倾斜到仔猪。
4. 通过麻醉保存装置提供吸入镇静剂（图2）。
   1. 将特定的注射器放入注射器泵中。
   2. 将麻醉剂线连接到注射器。
   3. 用1.5 mL卤化剂的推注剂开始剂生产线。
   4. 调整以mL.h^-1 为单位的初始泵速（异氟醚和七氟醚的初始注射器泵速设置分别为3和5 mL / h）以适应目标过期的七氟醚馏分（F_Esevo）或过期的异氟醚馏分（F_Eiso）值，如气体分析仪上所示。
   5. 确保气体分析仪显示 F_Esevo %–F_E等值 % 或等效的最小肺泡浓度值大于零。如有必要，额外追加0.3 mL卤化剂。
   6. 根据分钟体积和目标浓度调整注射器泵速率以达到一定浓度，通常，2-7 mL.h^-1和4-10 mL.h^-1的速率与异氟醚42和七氟醚28，43的0.2%-0.7%和0.5%-1.4%的过期馏分相关。
   7. 在实验过程中，继续施用F_Esevo和F_Eiso靶标分别为0.8-1.1和0.5-0.8的卤化剂。

5. 测量

1. 监测
   1. 收集由外部监护仪测量的不同参数:心率、血压和外周血氧饱和度。
   2. 记录呼吸机测量的参数:潮气量、呼吸频率、设置 PEEP、自动 PEEP（通过在呼吸机上应用 5 s 的呼气保持操作）、呼吸系统的顺应性、气道阻力、吸气平台压力（通过在呼吸机上应用 2 秒的吸气保持操作）、吸气峰值压力和驱动压力。
   3. 如果集成在呼吸机中，则使用氮气冲洗/冲洗方法计算肺功能残余容量。
   4. 使用先前插入股动脉的热指示器测量肺的血管外水量、心脏指数和全身血管阻力。
2. 未稀释的肺水肿液采样以测量净AFC率。
   1. 通过气管插管将柔软的14 Fr吸入导管插入支气管远端的楔形位置。
   2. 通过施加轻柔的吸力将水肿液取样到吸力陷阱中。
   3. 在冷藏离心机中以 240×g 在4°C下离心所有样品10分钟。
   4. 收集上清液。
      注意:未稀释的肺水肿液中的总蛋白浓度用比色法测量。由于水肿液从肺泡间隙的清除率远快于蛋白质去除率，因此净AFC率计算为百分比AFC = 100×[1 - （初始水肿蛋白/最终水肿总蛋白）]，此后报告为%/h^37。未稀释的肺水肿液样本在基线和4小时后从动物中收集，如前所述34，44，45，46，47，48，49。
3. 迷你支气管肺泡灌洗采样。
   1. 将软的14 Fr吸管插入气管管远端支气管的楔形位置。
   2. 将50mL氯化钠溶液滴入吸入导管中。
   3. 立即将流体取样到抽吸疏水阀中。
   4. 收集迷你支气管肺泡灌洗液。
      注意:使用比色法测量mini BAL中的总蛋白质浓度，例如，使用多重免疫测定法测量促炎细胞因子的水平，例如TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-18。在酸性肺损伤后4小时收集样本。
4. 血气分析
   1. 在基线处用 BD Luer-Lok 尖端的 3 mL BD 预设注射器通过动脉线收集动脉血气。使用床旁血气分析仪立即测量_{PaO2/FiO2、PaCO 2、pH}值、血清乳酸和血清肌酐。
   2. 在酸滴注后每小时重复此步骤4小时。
5. 肺部采样
   1. 在实验结束时（酸性肺损伤后4小时）静脉注射戊巴比妥^{（150 mg.kg-1）}牺牲仔猪。
   2. 解剖并切除整个肺部。用酒精乙化福尔马林固定。
   3. 潷入石蜡中，以10μm的厚度切片。
   4. 用苏木精和曙红染色。
      注意:可以使用标准化的组织学损伤评分^50来评估肺损伤的组织学证据。

结果

本实验将25头仔猪麻醉，分为两组:未治疗组（SHAM组）12头仔猪和酸损伤组（HCl组）13头仔猪。在实验结束之前，没有仔猪死亡。双向重复测量方差分析（RM-方差分析）表明，与没有ARDS的假动物相比，组相互作用（P<10^−4）存在显着的时间，HCl诱导的ARDS对PaO₂/ FiO₂具有不利影响（图3）。在机械通气4小时后测量的总蛋白的未稀释肺水肿液水平中，观察到?...

讨论

本文介绍了由小猪气管内滴注HCl诱导的ARDS的可重复实验模型，以研究使用麻醉保存装置输送的卤化挥发物（如七氟醚或异氟醚）的肺保护作用。

本研究的主要目标是开发一种ARDS的实验模型，其中挥发性药物可以通过麻醉剂保存装置（例如ICU患者中使用的装置）输送。虽然卤化剂的一些效应以前已经在动物模型中研究过，但我们模型的优势在于它是一种临床相关的转化模型，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tracheal intubation
Endotracheal tube 6-mm	Covidien	18860
Animal preparation
Central venous catheter 3-lumens catheter (7 French - 16 cm)	Arrow	CV-12703
Pulse contour cardiac output monitor PiCCO catheter (3-5 French - 20 cm)	Getinge Pulsion Medical System	catheter
Warm blankets WarmTouch5300	MedTronic	5300
Monitoring
External monitor IntelliVue MP40	Phillips	MNT 142
Point-of-care blood gas analyzer Epoc® Blood Analysis System	Siemens	20093
Pulse contour cardiac output monitor PiCCO Device PulsioFlex Monitor	Getinge Pulsion Medical System	PulsioFlex
Mechanical ventilation
Ventilator Engström Carestation	General Electrics	Engström
Halogenated anesthetics
Anaconda Syringe	SedanaMedical	26022
Anesthetic conserving device AnaConDa-S	SedanaMedical	26050
Charcoal filter FlurAbsorb	SedanaMedical	26096
Filling Adaptaters	SedanaMedical	26042
Ionomer membrane dryer line Nafion	SedanaMedical	26053
Products
Propofol	Mylan	66617123
Isoflurane	Virbac	QN01AB06
Pentobarbital	PanPharma	68942457
Sevoflurane	Abbvie	N01AB08
Sufentanil	Mylan	62404996