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摘要

在这里，我们提出了一个协议，用于准备和培养血脑屏障转移肿瘤微环境，然后使用共体成像和人工智能（机器学习）量化其状态。

摘要

脑转移是最致命的癌症病变;10-30%的癌症转移至大脑，平均存活期只有+5-20个月，取决于癌症类型。为了减少大脑转移性肿瘤负担，需要解决基本和转化知识方面的差距。主要挑战包括缺乏可重复的临床前模型和相关工具。脑转移的三维模型可以生成相关的分子和表型数据，用于满足这些需求，结合专用分析工具。此外，与穆林模型相比，患者肿瘤细胞穿过血脑屏障进入大脑微环境的细胞器官模型产生快速的结果，并且更可解释定量方法，从而适合高通量测试。在这里，我们描述并演示了一种新的3D微流体血脑利基（μmBBN）平台的使用，其中利基的多个元素可以培养很长一段时间（几天），荧光成像由共和显微镜，并使用创新的共体断层扫描技术重建的图像;所有旨在了解微转移的发展以及肿瘤微环境（TME）的变化，以可重复和定量的方式。我们演示如何使用这个平台制造、播种、图像和分析癌细胞和 TME 细胞和体液成分。此外，我们展示人工智能 （AI） 如何用于识别能够通过模型 μmBBN 传递的癌细胞的内在表型差异，并为它们分配一个脑转移潜力的客观索引。此方法生成的数据集可用于回答有关转移、治疗策略的疗效以及 TME 在两者中的作用的基本和转化问题。

引言

脑转移是最致命的癌症病变;10-30%的癌症转移至大脑，平均存活期只有+5-20个月，取决于癌症类型,1，2。研究癌症转移时出现的一个主要问题是亚克隆如何从血液的幽默环境迁移到大脑3、4,等器官。这个问题导致了许多迁移、入侵和外向分析的变体。所有这些方法都共享计数或测量细胞属性的关键步骤，这些细胞会根据刺激从一个位置移动到另一个位置。大多数现成的迁移测定都用于研究癌细胞的二维（2D）迁移。这些都阐明了丰富的知识;然而，它们并没有概括体内系统的三维性质，其他方法可以提供5。因此，有必要研究三维（3D）系统中的肿瘤微环境（TME），但可用于三维结构的分析方法有限，而且往往不一致。

最流行的3D工具之一是博伊登腔室，它由悬浮在井底的膜组成，将两个不同的区域隔开。博伊登介绍了研究白细胞化疗的测定方法。底部区域可以通过化学或其他方法6、7,来变化，以诱导上部区域的细胞迁移到下部区域。量化迁移的细胞数的最常见方法是使用缓冲液从膜底部释放细胞，对它们进行解，然后根据溶液7中的DNA含量量进行计数。这种间接方法由于技术变异性而容易出现操作者错误，该过程会破坏有关癌症表型和微环境的信息。博伊登腔室测定的变化涉及固定留在膜上的迁徙细胞，但只提供不再可行的细胞计数，以继续研究6，8，9。,8,9

由于博伊登腔室的局限性和微流体社区创新的增长，迁移测定芯片已经开发出来，观察细胞的运动，以响应一个方向的刺激，而不是三个10，11，12。,11,12这些迁移测定有助于控制诸如流动或单细胞分离等因子13、14，14从而更好地解释结果;13然而，它们的2D格式不可避免地会丢失一些动态信息。最近的研究集中在3D环境中的外在（即细胞从循环运动到组织，如血脑屏障）14，15。,15与使用博伊登腔室或2D微流体迁移装置16收集的测量结果，在细胞屏障/膜上发生的组织外向距离和探测行为更为精细。因此，能够对 3D 外创进行适当成像和分析的设备对于捕获这些复杂的测量值至关重要，但缺乏文献。

独立于迁移测定，已经开发出强大的成像技术，用于磁共振成像（MRI）和断层扫描，能够识别和准确地重建组织在3D空间17，18。,18这些技术根据组织的属性获取 z 堆栈中的图像和分割部分图像，然后将分割的图像转换为三维网格 19、20、21。19,20,21这使得医生能够可视化在3D个别器官，骨骼和血管，以帮助手术规划或协助诊断癌症或心脏病22，23。22,在这里，我们将展示这些方法可以适用于显微标本和3D外创装置。

为此，我们开发了创新的共声断层扫描技术，该技术提供了灵活性，通过调整现有的断层扫描工具，研究肿瘤细胞在膜上外向。这种方法能够研究癌细胞行为与细胞屏障（如内皮细胞层）相互作用时的全部范围。癌细胞表现出探测行为;有些可能入侵，但保持接近膜，而其他人很容易穿过屏障。这项技术能够产生关于细胞在所有维度24中的表型的信息。与更复杂的体内穆林模型相比，使用这种方法研究TME既相对便宜，易于解释，又可重复。提出的方法应该为通过适应肿瘤区域来研究许多类型的肿瘤和微环境提供强有力的基础。

我们描述并演示了3D微流体血脑利基（μmBBN）平台（图1），其中屏障和利基的关键元素（脑微血管内皮细胞和星形细胞）可以培养一个较长的时间（大约9天），由共和显微镜荧光成像，并使用我们的共体断层扫描技术重建的图像（图2）;都旨在以可重复和定量的方式了解微转移的发展以及肿瘤微环境的变化。血脑屏障与大脑利基的界面由脑微血管内皮细胞组成，这些细胞通过地下室膜、星形细胞脚和百分细胞25加强。我们选择性地关注星细胞和内皮成分，因为它们在血脑屏障的形成和调节中的重要性。我们演示如何利用这个平台制造、播种、图像和分析癌细胞和肿瘤微环境细胞和体液成分。最后，我们展示如何使用机器学习来识别能够通过模型μmBBN传递的癌细胞的内在表型差异，并赋予它们大脑转移电位24的客观索引。此方法生成的数据集可用于回答有关转移、治疗策略和 TME 在这两者中的作用的基本和转化问题。

研究方案

1. 准备血脑屏障利基模具

注:这个平台中使用的培养设备是基于PDMS的脚手架，我们建立一个细胞血脑屏障利基。它由两部分由多孔膜隔开。准备血脑屏障利基两个SU-8模具使用光刻是必要的26，27。26,将首先为100μm厚的模具描述协议，然后为200μm厚的模具提供注释。

  1. 要准备模具，请用丙酮用挤压瓶清洁 4 英寸硅片，然后用氮气枪擦干。
    1. 在200°C下将硅晶片在加热盘上烘烤10分钟，以去除所有残留溶剂。
    2. 反过来，将硅晶片居上旋转涂布机的夹头，为顶部模具分配 1 mL 的 SU8-2075。在 500 rpm（加速 300 rpm/s）下旋转 5 s 以分散光圈，然后在 2200 rpm（加速 300 rpm/s）时旋转 30 秒以获得 100 μm 厚的 SU-8 涂层。可能需要优化才能实现指定的厚度。
  2. 在65°C下将晶圆软烤至2分钟，然后在98°C下立即烘烤20分钟。
  3. 将晶圆放入光刻灯中，按照标准程序将面罩居中。以 230 mJ/cm 2 的 UVB（360 nm 和 10nm） 的辐射暴露 SU-8 ± 涂层晶圆。可进行暴露矩阵实验以确定最佳剂量。掩码设计可在补充 文件 1 中提供。
  4. 在65°C下进行曝光后烘烤2分钟，然后在98°C下立即烘烤10分钟，以提高粘附性。将晶圆冷却至50°C。
  5. 使用 SU-8 照片开发人员移除未暴露的电阻。在浴缸中冲洗晶圆 5 分钟，然后在化学罩中使用装满 SU-8 的喷雾瓶搅拌并清除剩余的未处理 SU-8。4x 显微镜可用于观察是否已移除所有未治愈的 SU-8。光印特征边缘的白线表示 SU-8 尚未完全移除。
  6. 在 110 °C 的烤箱中进行最后的硬烤，60 分钟。
  7. 使用 SU-8 2075 对 200 μm 厚模具遵循相同的步骤，但将协议调整为以下内容:
    1. 旋转涂布机设置:在 500 rpm（加速 300 rpm/s）时旋转 5 秒以分散光圈，然后在 1300 RPM（加速度 300 rpm/s）时旋转 30 秒以获得 200 μm 厚涂层。
    2. 在65°C下软烘烤2分钟，然后在98°C下软烘烤40分钟。
    3. 曝光时间 340 mJ/cm2.
    4. 曝光后烘烤:65°C下烘烤2分钟，98°C烘烤15分钟。
  8. 最后，将每个晶圆放入化学罩内的真空室中，并放入一个塑料容器中，将3滴（±150μL）硅化溶液（三氯全氟辛烷值辛烷青烷）放入其中。拉一个真空，离开过夜，让蒸汽覆盖晶圆。此步骤可减少 SU-8 和 PDMS 之间的粘附，从而缩短模具的使用寿命。
    注意:三氯全氟烷基硅烷应始终在烟罩中处理，并远离水源。
  9. 使用两条双面胶带将单个晶圆模具放入 150 mm 培养皿中。确保晶圆是平的。另一种选择是制造铝模，在其中可以放置晶圆。由于铝制模具是封闭的，因此会产生厚度均匀的铸件，而培养皿方法对表面的倾斜度非常敏感。PDMS 铸件的平整度得到改善，可缩短下游共声成像时间。

2. 形成并组装PDMS血脑屏障（BBB）装置

  1. 在塑料杯中按重量混合 75 g PDMS，比重为 1:10（交叉链接器:基地）。
  2. 将 PDMS 倒入模具上（200 μm 厚模具为 1 毫米厚，100 μm 厚模具为 4 mm），并在真空干燥器中脱气一小时，或直到清除所有气泡。放入65°C烤箱过夜。1 mm 厚度可根据共合显微镜中 10 倍目标的工作距离进行调整。
  3. PDMS 固化后，使用刀片通过边缘周围的 PDMS 轻轻切割晶圆。剥去 PDMS，然后使用刀片沿矩形导轨切割，并采用 1.5 mm 活检冲头打开设备上的入口和插座。用 48 mm 宽的包装胶带盖住 PDMS 设备部件，防止灰尘和碎屑。
  4. 接下来使用解剖剪刀切割一个5毫米x50毫米长方形的聚碳酸酯膜与5μm毛孔，并将其存储在培养皿内供以后使用。
  5. 收集以下:200 μL移液器尖端，2 mL的1:10 PDMS与甲苯混合，在玻璃瓶的重量为2:3，巴斯德移液器与挤压灯泡，准备的PDMS上下部分，膜，三个50毫米x75毫米玻璃滑梯，并运送到旋转涂布机。图 1 中描述了设备组装和单元种子的 以下步骤。
  6. 使用巴斯德移液器将 1 mL 的 PDMS:甲苯胶水溶液转移到旋转涂布器夹头上的 50 mm x 75 mm 玻璃滑轨中。在 100 rpm（加速 300 rpm/s）下旋转 5 秒，在 2000 rpm（加速 300 rpm/s）时旋转 30 秒。
  7. 将幻灯片放在桌子上，用一个 PDMS 上腔室和一个下腔盖住它，使具有模制特征的 PDMS 面接触幻灯片，将胶水转移到 PDMS 面，勾勒出所有特征的周长。
  8. 将 PDMS 上腔翻转到另一张幻灯片上，将胶水涂层朝上，小心地将膜放在设备之间的入口和插座之间。将 200 μL 尖端放入 PDMS:甲苯胶水溶液中，直到它将一些尖端恶狠狠地放入尖端。触摸每个入口和出口之间的尖端，在膜边缘附近放置一小滴，靠近 PDMS。
  9. 拆下设备的另一半，将其与胶水涂层向下放置，同时对齐两部分上的入口和插座。
  10. 将组装的装置在 37 °C 下放入烤箱中过夜，以固化胶水。转移到一个真空钟罐与干燥剂，让脱水两天。这是让甲苯蒸发的关键步骤，通过调节实验室空气中吸收的水蒸气，提高装置播种的一致性。

3. 将大脑微环境播种到设备中

  1. 细胞培养和试剂:在开始此协议之前，获取以下试剂和细胞。在 5% CO2中培养孵化器中所有细胞系，温度为 37 °C。
    1. 在DMEM中保持人类三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC HTB-26）和MDA-MB-231-BR-GFP细胞（从帕特里夏·斯蒂格（Patricia Steeg，PhD）中，用4.5克/升葡萄糖补充2mM L-谷氨酰胺、10%FBS和1x抗生素抗糖。通过用空载体pLL-EV-GFP扁病毒转录MDA-MB-231细胞，创建MDA-MB-231-GFP荧光细胞。在实验前使用荧光激活 细胞分选 （FACS） 对传感器的 GFP + 总体进行排序。
    2. 在EGM-2介质中维持人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3。使用空向量 pLL-3.7-dsRed 扁家病毒转录 hCMEC/D3-D3-Dred 荧光细胞。创建 hCMEC/D3-Dred 荧光细胞。在实验使用前，使用 FACS 从培养中去除所有非转导、非荧光细胞。
    3. 在DMEM中维持正常的人类星细胞（NHA），辅以4.5克/升葡萄糖、10%FBS、2 mM谷氨酸、1mM丙酮酸钠、1x N-2生长补充剂和1x抗生素抗霉菌。通过转发pLOX-TERT-iresTK扁病毒载体（Addgene12245），使星形细胞永生。使用质粒 psPAX2 和包络质粒 pMD2.G（Addgene 12260 和 12259）创建载体。
  2. 从真空干燥器上拆下 μmBBN 设备，并放置到金属或纸张（即胶带）表面上，入口朝下，将其放入等离子室。还要将 50 mm x 75 mm 玻璃滑入等离子室。拉真空，然后在80W下用等离子体处理30 s。
  3. 快速从等离子室中卸下玻璃滑梯和设备，并使用导轨将入口朝上，与玻璃幻灯片对齐（补充文件 2）。这将在 PDMS 和玻璃幻灯片之间形成永久的粘结，并且无法重新定位。
  4. 接下来切断 16， 200 μL 移液器尖端， 2 毫米从尖端。将移液器尖端插入所有入口和插座。如果此时未准备好为细胞播种，则设备可以放回真空干燥器中。
  5. 将设备放回等离子室，在 200 W 下用等离子体处理 8 分钟。设备冷却后（5 分钟）从血浆处理处，它放在无菌的二次容器内，就像透明移液器尖端盒一样。在 +15 分钟内执行下一步，否则血浆处理效果可能会降低，从而导致堵塞。
  6. 实验前几天培养1 x 106 内皮细胞（hCMEC/D3-DSRed）和1 x 106 星形细胞（NHA）的培养皿。当该器件进行8分钟血浆处理时，制备一种胶原蛋白溶液，包括0.5 mL的3mg/mL PureCol型牛胶原蛋白，其中64μL为0.8 M NaHCO3 和20μL的10x高葡萄糖（250 mM）MEM。在胶原蛋白溶液中悬浮5.0 x10 5 NHA细胞。不使用时在冰上保持溶液。
  7. 通过底部腔室的移液器尖端将120μL的胶原蛋白/星细胞/微胶质溶液转移到器件中（图1红色箭头）。让溶液穿过腔室进入相反的移液器尖端。在设备的所有四个通道都已填充后，将芯片以 37 °C 和 5% CO2 在 37 °C 和 5% CO2 中放置，为 1 小时，或直到胶原蛋白设置。
  8. 胶原蛋白集后，用完整介质的混合物填充所有移液器尖端，以填充底部腔室。对于含有内皮细胞和星细胞的芯片，使用50:50的内皮:星细胞介质组合。
  9. 使用上室移液器尖端（图1蓝色箭头）在完整的内皮介质中用2%的生长因子减少Matrigel，并在培养箱中放置1小时。
  10. 用指示的介质混合物冲洗上腔，并用内皮细胞（图1绿色箭头）交替使用哪个尖端播种。将 1 x 106 内 皮细胞悬浮在 1 mL 的内皮介质中，每 15 分钟将种子 30 μL 悬浮到交替的上室尖端中，以均匀覆盖。种子内皮细胞进入每个上室尖两次，每个腔室共4次。
  11. 内皮细胞最终播种后，用培养基混合物填充所有尖端，并在37°C和5%CO 2下将设备放入培养箱中，每12小时更换两室的培养基。

4. 监测内皮层形成进展

  1. 内皮层对通道的完整覆盖在3天后观察到。使用两种方法之一来监控内皮屏障的覆盖范围:荧光或TEER。hCMEC/D3-DSRed荧光和通道区域的覆盖率百分比可以使用 ImageJ 进行量化。
    1. 打开 hCMEC/D3-DSRed 屏障代表的 ImageJ 中的 TIFF 文件。在 ImageJ 软件中，单击 "文件 > 打开 "以选择文件。
    2. 按照这些关键命令和选项使用最大强度合并图像的所有 Z 层: 图像 > 堆栈 > Z 项目 > 所有 Z 切片，最大强度。
    3. 在使用此方法评估的所有微流体芯片中执行相同的颜色阈值。在这项研究中，我们采用了450的阈值。使用 ImageJ 中的阈值菜单: 图像 > 调整 > 阈值。
    4. 使用以下命令和选项设置要记录的测量值:分析 > 设置测量值 > 阈值限制，区域分数。
    5. 选择微流体通道的代表性区域，通过绘制框进行测量。箱体工具位于 ImageJ 的主菜单上。测量位于每个微流体通道的开始、中间和端端的 3 个技术复制，使用相同的盒大小。
    6. 分析每个通道并记录面积分数，表示内皮覆盖率百分比。将这些测量值导出为电子表格文件，使用以下命令绘制和可视化数据: 分析 > 测量。
  2. 作为替代方案，使用基于阻抗光谱的TEER测量每个区域的内皮紧结。使用 TEER 对内皮屏障进行量化是内皮层作为屏障完整性的代理。
    1. 将两个电极放在上腔和下腔的入口和出口中。
    2. 根据Srinivasan等人提出的,模型，将内皮单层阻抗量化为芯片中电阻、电感和电容的组合。

5. 将癌细胞种子放入设备

  1. 内皮层成熟后，将癌细胞种子进入设备。在完整的癌细胞介质中准备 1 mL 1 x10 6 癌细胞溶液。
  2. 在芯片中交换介质以补充细胞培养营养。
  3. 将每个顶部腔室通道与30μL的癌细胞悬浮，然后将设备放回孵化器15分钟。始终将癌细胞播种在单个设备内所有四个顶部腔室通道的同一侧。
  4. 将设备与新介质交换一次，每 12 小时重新填充一次提示，直到设备被成像为转移行为。

6. 通过共体成像成像肿瘤微环境

  1. 在所需的实验时间点（1、2 或 9 天），使用共声成像捕获通道的 3D 图像。我们使用此处描述的设置在尼康 A1 上执行此步骤。此步骤是自动化的，每个通道需要 20-40 分钟的图像，具体取决于包含的荧光通道数和覆盖所有细胞位置所需的 Z 深度。
  2. 打开显微镜，打开软件，将培养箱盖放在显微镜上。
  3. 将显微镜级加热器设置为 37 °C 和 CO2 至 5%（如果可用）。
  4. 显微镜培养箱稳定后，使用 50 mm x 75 mm 安装将设备放入显微镜阶段。
  5. 将目标集中在设备的一侧（如果与提供的分析软件一起使用，则左侧）以 10 倍的目标将 Z 高度设置为零。在 z 堆栈设置下，包括高于 100 μm 的范围和对焦平面下方的 200 μm 范围。然后使用拼接设置将 X 和 Y 字段的数量分别设置为 1 和 9，并重叠 15%。将针孔设置为建议的最小值，将 z 层高度设置为 9 μm。调整明亮的场曝光，使多孔膜可见。打开 dsRed （561 nm） 和 GFP （488 nm） 通道的激发激光器，并调整荧光激光器的功率和截止，使每个通道都可见，而不会过度曝光像素。
  6. 在跨过时验证所有字段是否都的焦点。如果是这样，请为图像输入输出文件名 （001.nd2），然后开始实验以自动捕获 3D 共和图像。

7. 通过共声断层扫描测量肿瘤微环境

  1. 使用共声断层扫描方法估计一组指标和测量值，这些指标和测量值描述了设备中的单个细胞和肿瘤微环境。共体断层分析（图2）将共和 z 堆栈转换为细胞的三维表示形式。在Jupyter笔记本/实验室环境中使用自定义的python脚本，然后平面与形成血脑屏障的细胞层（如膜30）进行匹配。最后，对癌细胞群进行表型测量（表1）。
    1. 在实验结束时或时间课程中执行此分析。根据引用的软件指南安装 python 和相应的库，然后通过运行命令"conda 激活"，然后运行"jupyter 实验室"，从 Windows 命令提示符打开软件。Jupyter 环境将在默认浏览器中加载。
    2. 从 Jupyter 文件资源管理器双击 Jupyter 笔记本"contom.ipynb"打开它。运行标题"导入库 、自定义类/函数"下方的单元格，然后单击笔记本 单元格，然后单击播放按钮来设置笔记本。下面的所有笔记本单元格都使用相同的方法执行。请注意，此处的笔记本"cell"是指 Jupyter 笔记本中的 python 代码块。
  2. 准备数据。该算法使用可视化工具包 （VTK） 操作和显示 z 堆栈和三维数据17。
    1. 放置提供的 。XLSX 文件（"实验跟踪器.xlsx"）与 Jupyter 笔记本在同一窗口文件夹中。该文件跟踪实验和接口与Jupyter笔记本。将第 6 节中的 ND2 文件放入 Jupyter 笔记本位置下方名为"[Experiment_XXX[Confocal]"的子文件夹。通过将"XXX"调整到分配给新文件夹的数字 ID 中，可以添加其他实验文件夹。
    2. 将第一个实验文件夹Experiment_001"和 ND2 文件"001.nd2"。首先，将 ND2 成像文件转换为由颜色通道分隔的拼接多图像 TIFF 文件。通过执行标题"将共和 z 堆栈读入内存"下方的笔记本单元格，Save_tiff_from_ND2 （） 函数未注释 30。ND2 文件是尼康的专有成像格式，因此有必要将其转换为开源软件兼容的格式。
      注意:使用TIFF（标签图像文件格式）是因为它无处不在，16位兼容，很容易导入到VTK，多个图像可以存储在一个文件中，这是适用于z堆栈图像。执行笔记本单元将从 ND2 文件中读取图像，提取颜色和 XYZ 位置的信息，然后根据预先确定的结构将该图像存储在数字数组中。然后，它使用 python 库 tifffile 将数组保存为 TIFF 文件。
  3. 将成像数据转换为 3D 模型
    1. 使用 3D 渲染将 TIFF 文件导入 VTK （vtkTIFFReader） 以可视化单元格（图 2）。根据图像中单元格的颜色选择阈值。为了澄清这一点，VTK 对象表示空间（体积）中的像素块（X、Y、Z），但只有某些像素（绿色或红色）表示单元格，其余为背景或杂色（黑色）。
    2. 因此，在删除背景的体积上设置不透明度过滤器，确认荧光仅是细胞。使用名为"通过调整值变量（即"Channel_alpha值Change opacity values for each microscope channel变量Channel_alpha的 Jupyter 笔记本单元格GFP_alpha。使用名为"查看3D 渲染"的笔记本单元格可视化效果，以验证阈值设置是否正确。
    3. 将电子表格中的不透明度值保存，以在下一步中使用。将体积数据转换为单独的 3D 对象，每个对象使用称为行进立方体31的技术表示图像中的单元格。该算法从体素的三维离散标量场中提取等值面的多边形网格。
    4. 使用行进立方体算法中的不透明度值将每个单元格与背景分开。通过运行将体美图像转换为三角形网格并保存 为笔记本中的 VTK 文件，完成每个显微镜通道中标识的所有荧光 细胞的此步骤。
  4. 将平面安装到膜上
    1. 通过首先定位细胞质心（笔记本细胞:分析 RFP 通道（内皮屏障），将平面拟合到内皮屏障。通过卷中的列表网格进行迭代，并使用 VTK 中的多数据连接筛选器提取未连接的区域。计算每个网格的质心，并将测量添加到太大或过小的网格的质心筛选列表中（<50，>1000000 体素）。
    2. 使用误差最小化方法将平面拟合到内皮细胞的质心列表中（笔记本单元格:将平面拟合到 RFP质心（内皮屏障））（图2，图3）32。通过绘制平面和质心来检查平面的拟合，必要时（使用 theta、beta 和 z）通过运行名为"可视化 RFP 质心"的笔记本单元和平面拟合手动调整。
    3. 正确安装平面后，将平面的法线保存到实验跟踪器文件中。XLSX 文件供将来使用。
  5. 分析以下描述符个别癌细胞的描述特征（表1）。
    注:如果执行分析的计算机滞后，则选择通过高性能计算进行高吞吐量分析。此算法在标准笔记本电脑上可用于分析少量细胞，但 VTK 不适合大量单个对象 （>1000）。因此，使用调整算法在高性能计算群集上运行是可选的。这样可以快速分析许多细胞的实验（图2）。所有7.5是通过运行笔记本单元，标题为分析 剩余的显微镜 通道的表型描述符 和阅读Experiment_tracker信息，并分析存在的通道。
    1. 测量癌细胞的外创:用平面对内皮层进行特征化后，测量通过膜迁移的每个癌细胞的体积。夹住每个细胞（布尔），以便保持膜下方的网格，并去除膜上方的部分33。然后关闭打开的网格（vtk 填充孔）。
      1. 重新计算剪切网格的法线和新的质心。测量每个被夹住的癌细胞的体积和位置进行分析。体积等效于每个单个单元格的网格填充的体素数。计算每个癌细胞的内皮平面和位置之间的距离。
    2. 测量细胞表型:通过考虑其形状、体积和位置来计算每个癌细胞的形态。
  6. 验证测量值并保存到电子表格或绘图中。运行名为"检查"的笔记本单元格"检查重心测量准确，并弹出一个渲染图，显示按单元格类型在图像卷顶部标识的质心。完成所有实验后，通过键入名为"将数据导出为单个数据"的笔记本单元格中要包含的实验.XLSX将完整的数据集导出为单个电子表格文件，以替换给定的实验 ID。如果验证已完成的数据集，则使用名为"距离外创条图"的笔记本单元格绘制它。绘图将显示在笔记本环境中并保存到文件中。

8. 利用人工智能分析相关特征

注:使用人工智能算法识别转移性表型特征。

  1. 根据图 5 和补充文件 3 中所示的方案使用橙色执行二进制分类。通过键入"conda 激活"，后键入"python -m Orange.canvas"，然后从提示符中单击"新"，从第二个 Windows 命令提示符开始橙色。Orange 是基于拖放的软件，因此通过将左侧菜单中的每个项目拖到画布上以匹配补充文件3 来排列函数。完成后，双击"文件"图标并选择"数据.XLSX文件。
  2. 筛选数据以删除错误测量值，定义为使用"选择行"图标在已知边界之外提供参数变量值的测量值。双击图标并设置与筛选器对应的条件，例如"球体介于 0 和 1 之间"。为 8.2.1、8.2.2 和 8.2.3 创造条件。
    1. 过滤距离外创测量范围为 -100-200 μm。
    2. 将细胞形状的球度测量范围从 0-1 过滤。
    3. 过滤癌细胞体积测量范围为0-2000体素。
    4. 使用所有参数变量 （表 1） 对脑转移 MDA-MB-231-BR-GFP 和非脑转移 MDA-MB-231-GFP 进行分类。双击从画布中选择列图标。使用>按钮将可用变量移动到要素、目标变量或元属性中。唯一应该是目标变量的变量是转移性标签，它定义数据集中的单元格是否被视为转移 （1） 或不 （0）。实验变量可以放置在元属性部分中。
  3. 将数据采样到培训中 （80%）和测试集 （20%）。双击"数据采样器"图标并选择"固定数据比例"的采样类型:设置为 80%，然后选择可复制和分层复选框。使用每个模型/分类器使用 10 个折叠对训练集进行分层和交叉验证。双击"测试和分数"，然后选择"交叉验证"与折叠数:设置为 10 并分层选中。将目标类设置为 1。
  4. 在此方法中，使用神经网络和随机林学习算法，因为它们对数据健壮。在"随机林"图标中，选择树数为 50，不选择任何其他选项。在神经网络图标中，选择神经元每个隐藏的布局r: 100，激活: ReLu，解算器: 亚当 ， Alpha: 0.0001，和最大迭代: 200。但是，这些设置会因研究而有很大差异，在申请前应充分理解。
  5. 设置画布后，双击每个图标从"文件"到 " 示例 数据"， 然后点击"应用 "或" 发送 数据"。双 击测试和评分 以及训练数据将开始用于使用算法开发模型。训练机器学习模型后，重新打开 测试和分数 并选择测试 数据测试 ，并关闭弹出窗口，根据芯片中的细胞从 0 到 1 的概率对芯片中的细胞进行分类，以对模型的性能进行评分。
  6. 将机器学习模型性能保存到文件中（表2）。包括 ROC 曲线 （AUC） 下的区域、精度和 F1 分数。保存包含单个转移索引和分类概率的第二个文件。双击" 保存" 图标， 然后单击"保存到 写入"以提交分类概率。同样，可以通过双击 ROC 分析图标查看 ROC 曲线 ，也可以通过双击"混淆矩阵"图标计算 模型 性能。

结果

利用这种技术，我们分析了标有不同荧光蛋白或染料的细胞类型。我们演示了使用使用 μmBBN 芯片与 hCMEC/D3-DSRed 和非荧光星形细胞一起使用这种方法。脑微血管内皮细胞被播种到多孔膜（5μm轨道蚀刻毛孔），并在37°C下放置在37°C低于5%CO 2的培养箱34中。三天后，通过显微镜确认内皮层的汇合，然后将癌细胞放置在内皮层的顶部。两个乳腺癌细胞系，一个称为MDA-MB-231-BR-GF...

讨论

我们开发并提出了一种新方法，可以调整临床成像分析中经常使用的工具，以测量癌细胞通过内皮屏障进入脑组织外创和迁移。我们认为这种方法对体内和体外测量都很有用;我们已经证明了它在3D微流体系统上重新验证脑血管的用途。癌细胞测量，包括距离外创，体积外创百分比，球面和体积使用这种技术进行量化。距离外在和体积外加百分比允许用户重建芯片中癌细胞的位置，以评估跨越屏障?...

披露声明

没有要申报的披露。

致谢

我们感谢国家癌症研究所的斯蒂格实验室慷慨捐赠MDA-MB-231-BR-GFP细胞。在密歇根大学生物接口研究所（BI）进行了共生显微镜。在密歇根大学流细胞学核心进行流细胞学。病毒载体是由密歇根大学病媒核心创建。我们还感谢凯利·基德威尔对这些数据的统计分析提供指导。

资金:

C.R.O.部分得到国家卫生和三十二培训研究金（T32CA009676）和1R21CA245597-01的支助。T.M.W. 部分得到 1R21CA245597-01 和国家卫生研究院国家促进转化科学中心的支持，奖励编号为 UL1TR002240。国家卫生研究院国家癌症研究所根据奖号1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018、AI116482、METAvivor基金会和乳腺癌研究基金会提供了材料和表征的资助。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

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