JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для подготовки и культивирования метастатического геммозефалического барьера микро-среды опухоли, а затем количественно его состояние с использованием конфокальных изображений и искусственного интеллекта (машинное обучение).

Аннотация

Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием всего 5-20 месяцев, в зависимости от типа рака. Чтобы уменьшить бремя метастатических опухолей мозга, необходимо решить пробелы в базовых и переводческих знаниях. Основные проблемы включают нехватку воспроизводимых доклинических моделей и связанных с ними инструментов. Трехмерные модели метастазирования мозга могут дать соответствующие молекулярные и фенотипические данные, используемые для удовлетворения этих потребностей в сочетании с специализированными инструментами анализа. Кроме того, по сравнению с моделями мурина, орган-на-чип модели опухолевых клеток пациента, проходящих геммоэнцефалический барьер в микроокноронику мозга генерировать результаты быстро и более интерпретируются с количественными методами, таким образом, под силу высокой пропускной способности тестирования. Здесь мы описываем и демонстрируем использование новой 3D микрофлюидной ниши мозга крови (МКББН), где несколько элементов ниши можно культурировал в течение длительного периода (несколько дней), флуоресцентно изображены конфокальные микроскопии, и изображения реконструированы с использованием инновационной конфокальные томографии техники; все они направлены на то, чтобы понять развитие микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли (TME) в повторяемой и количественной манере. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и TME клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Кроме того, мы показываем, как искусственный интеллект (ИИ) используется для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, способных проходить через модель мБН, и присваивать им объективный индекс метастатического потенциала мозга. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, эффективности терапевтических стратегий и роли TME в обоих.

Введение

Метастазы мозга являются наиболее смертоносными поражениями рака; 10-30% всех раковых метастазов в мозг, со средним выживанием только 5-20 месяцев, в зависимости оттипа рака 1,2. Основной вопрос, который возникает при изучении метастазов рака, как суб клоны мигрируют из гуморальной среды кровотока в орган,такой как мозг 3,,4. Этот вопрос привел к многим вариациям миграции, вторжения и экстравазии анализов. Все эти методы разделяют критический шаг подсчета или измерения свойств клеток, которые перемещаются из одного места в другое в ответ на стимул. Большинство миграционных анализов легко доступны используются для изучения двумерной (2D) миграции раковых клеток. Они прояснены богатство знаний; однако, они не резюмируют трехмерный характер системы in vivo, что другие методы могут обеспечить5. Поэтому необходимо изучать микросреду опухоли (ТМЭ) в трехмерных (3D) системах, но подходы к анализу, доступные для 3D-структур, ограничены и зачастую несовместимы.

Одним из самых популярных 3D-инструментов является камера Boyden, которая состоит из мембраны, подвешенной в нижней части колодеца, разделяющей два отдельных региона. Бойден ввел анализ для изучения лейкоцитов хемотаксис4. Нижние регионы могут быть разнообразны по химии или другимсредствам 6,,7, чтобы побудить клетки в верхнем регионе мигрировать в нижнюю область. Наиболее распространенным подходом к количественной оценке количества клеток, которые мигрировали является освобождение клеток из нижней части мембраны с помощью буферного раствора, подставить их, а затем подсчитать их на основе количества содержания ДНК врастворе 7. Этот косвенный подход подвержен ошибке оператора из-за изменчивости техники и процедура уничтожает информацию о фенотипе рака и микро-среде. Вариации анализа камеры Бойдена включают фиксацию мигрирующих клеток, которые остаются на мембране, но только обеспечивает количество клеток, которые больше не являются жизнеспособными длядальнейшего изучения 6,,8,,9.

Из-за ограничений камеры Бойдена и роста инноваций в микрофлюидном сообществе, были разработаны чипы миграционного анализа, которые наблюдают движение клеток в ответ на стимул в одном направлении, а нетри 10,,11,12. Эти миграционные анализы облегчают контроль над такими факторами, как поток или разделениеодной ячейки 13,14, которые позволяют лучше работать над результатами;, однако их 2D-формат неизбежно теряет некоторую динамическую информацию. Недавние исследования были сосредоточены на экстравазии (т.е. движение клеток из циркуляции в ткани, такие как гемовоградный барьер) в 3Dсреде 14,15. Экстравазия расстояние в ткани и зондирования поведение, которое происходит на клеточном барьере / мембраны более изысканным, чем измерения почерпнутые с помощью либо камеры Бойден или 2D микрофлюидных миграцииустройства 16. Таким образом, устройства, позволяющие осуществлять соответствующую визуализацию и анализ 3D-экстравазии, имеют решающее значение для фиксации этих сложных измерений, но отсутствуют в литературе.

Независимо от миграционных анализов, были разработаны надежные методы визуализации для магнитно-резонансной томографии (МРТ) и томографии, которые способны идентифицировать и точно реконструировать ткани в 3Dпространстве 17,,18. Эти методы приобретают изображения в z-стеках и сегментных части изображения на основе свойств ткани, а затем преобразуют сегментированные изображения втрехмерные сетки 19,,20,,21. Это позволяет врачам визуализировать в 3D отдельных органов, костей и сосудов, чтобы помочь в хирургическом планировании или помощи в диагностикерака или сердечных заболеваний 22,23. Здесь мы покажем, что эти подходы могут быть адаптированы для использования на микроскопических образцах и 3D-устройствах экстравасации.

С этой целью мы разработали инновационный метод конфокальные томографии, представленный в настоящем, который обеспечивает гибкость для изучения экстравазации опухолевых клеток через мембрану путем адаптации существующих томографических инструментов. Этот подход позволяет изучить всю гамму поведения раковых клеток, как они взаимодействуют с клеточным барьером, таких как эндотелиальный слой клеток. Раковые клетки обладают зондирующим поведением; некоторые из них могут вторгнуться, но остаются близко к мембране, в то время как другие пересекают барьер легко. Этот метод способен дать информацию о фенотипе клетки во всех измерениях24. Использование этого подхода для изучения TME является относительно недорогим, простым в интерпретации и воспроизводимым, по сравнению с более сложными моделями in vivo murine. Представленная методология должна обеспечить сильную основу для изучения многих типов опухолей и микро-сред путем адаптации стромальной области.

Мы описываем и демонстрируем использование 3D микрофлюидной ниши мозга крови (мББН) платформы(рисунок 1),где критические элементы барьера и ниши (микрососудистые эндотелиальные клетки мозга и астроциты) могут быть отучены в течение длительногопериода (примерно до 9 дней), флуоресцентно изображены с помощьюконфокальной микроскопии, а изображения реконструированы с использованием нашей конфокалиограммы . все направлено на понимание развития микро-метастазов и изменений в микро-среде опухоли в повторяемой и количественной манере. Интерфейс гемового барьера с нишей мозга состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, которые укрепляются мембраной подвала, астроцитными ногами иперицитами 25. Мы избирательно сосредоточились на астроцитах и эндотелиальных компонентах, учитывая их важность в формировании и регуляции геммоградно-мозгового барьера. Мы демонстрируем, как изготовить, семена, изображения, и анализировать раковые клетки и опухолевые микро-среды клеточных и гуморальных компонентов, используя эту платформу. Наконец, мы показываем, как машинное обучение может быть использовано для выявления внутренних фенотипических различий раковых клеток, которые способны проходить через модель мББН и присвоить им объективный индекс метастатическогопотенциала мозга 24. Наборы данных, генерируемые этим методом, могут быть использованы для ответа на основные и трансляционные вопросы о метастазах, терапевтических стратегиях и роли TME в обоих.

протокол

1. Подготовка гемового барьера нишу плесени

ПРИМЕЧАНИЕ: Культовое устройство, используемое в этой платформе является PDMS основе эшафот, что мы строим клеточной ниши гемового барьера на. Он состоит из двух частей, разделенных пористой мембраной. Для подготовки ниши гемового барьера необходимы две формы СУ-8, сделанныес использованием фотолитографии 26,,27. Протокол будет описан для формы толщиной 100 мкм, а затем заметки будут даны для 200 мкм толщиной формы.

  1. Чтобы подготовить форму, очистить 4 "силиконовая пластина с использованием ацетона с выжать бутылку, а затем высушить его с азотной пушкой.
    1. Выпекать кремниевую пластину на плите в течение 10 минут при температуре 200 градусов по Цельсию, чтобы удалить все остаточные растворителя.
    2. В свою очередь центр кремниевых пластин на патрон спина пальто и обойтись 1 мл SU8-2075 для верхней формы. Спин на 5 с при 500 об/мин (ускорение 300 об/мин/с) для разгона фоторезистаста, а затем 30 с при 2200 об/мин (ускорение 300 об/мин/с) для получения покрытия СУ-8 толщиной 100 мкм. Оптимизация может потребоваться для достижения указанной толщины.
  2. Мягкая выпечка на плите при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем сразу при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
  3. Поместите пластину в фотолитографию лампы и положение маски по центру на пластину в соответствии со стандартными процедурами. Выставить СУ-8 покрытием с сиянием 230 мДж/см 2 UVB (360 нм ± 10 нм). Эксперимент матрицы экспозиции может быть выполнен, чтобы определить оптимальную дозировку. Дизайны масок доступны в дополнительном файле 1.
  4. Выполните пост-экспозиции испечь при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 минут, а затем сразу при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы улучшить адгезию. Охладить до 50 градусов по Цельсию.
  5. Удалите неразоблачейте сопротивление с помощью фото-разработчика СУ-8. Промыть пластину разработчику в течение 5 минут в ванне, а затем использовать распылитель, наполненный разработчиком СУ-8 в химическом капюшоне, чтобы агитировать и удалить оставшиеся неохватимые СУ-8. 4x микроскоп может быть использован для наблюдения, если все uncured Су-8 был удален. Белая линия по краям фоторезистерских объектов указывает на то, что Су-8 не был полностью удален.
  6. Выполните окончательный жесткий выпекать в духовке при температуре 110 градусов по Цельсию в течение 60 минут.
  7. Следуйте той же процедуре для формы толщиной 200 мкм с помощью СУ-8 2075, но отрегулируйте протокол следующим образом:
    1. Настройки спинового пальто: Спин для 5 с при 500 об/мин (ускорение 300 об/мин/с) для разгона фоторезистаста, а затем 30 с при 1300 об/мин (ускорение 300 об/мин/с), чтобы получить покрытие толщиной 200 мкм.
    2. Мягкая выпечка при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 мин, затем при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 40 мин.
    3. Время экспозиции 340 мДж/см2.
    4. Опубликовать экспозицию выпекать: 2 мин при температуре 65 градусов по Цельсию, а затем 98 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
  8. Наконец, иланизируйте каждую пластину, помещая их в вакуумную камеру внутри химического капюшона с пластиковым контейнером, в котором были помещены 3 капли (150 мкл) силанизирующего раствора (Trichloro perfluoro octyl silane). Потяните вакуум и оставить на ночь, чтобы пара, чтобы покрыть. Этот шаг уменьшает адгезию между СУ-8 и PDMS, увеличивая срок службы формы.
    ВНИМАНИЕ: Трихлоро перфтороктил силан должен всегда обрабатываться в дымовой капот и держаться подальше от источников воды.
  9. Поместите отдельные вафельные формы в 150 мм чашки Петри с использованием двух полос односторонней ленты. Убедитесь, что плоские. Альтернативой является изготовление алюминиевой формы, в которой могут быть размещены. Потому что алюминиевая плесень прилагается он будет производить слепки с однородной толщиной, в то время как метод чашки Петри чувствителен к наклону поверхности он помещен на. Улучшенная плоскость отливок PDMS сокращает время конфокального изображения ниже по течению.

2. Форма и сборка устройства геммового мозга PDMS (BBB)

  1. Смешайте 75 г PDMS в соотношении 1:10 (Crosslinker:Base) по весу в пластиковой чашке.
  2. Налейте PDMS на формы (1 мм толщиной для 200 мкм толщиной плесени и 4 мм для 100 мкм толщиной плесени) и дега в вакууме desiccator в течение одного часа или до тех пор, пока все пузырьки были удалены. Поместите в духовку 65 градусов по Цельсию на ночь. Толщина 1 мм может быть скорректирована на основе рабочего расстояния 10x цели в конфокальце.
  3. После того, как PDMS вылечилась использовать лезвие, чтобы аккуратно вырезать против пластины через PDMS по краям. Очистите PDMS и использовать лезвие, чтобы сократить вдоль прямоугольных направляющих и 1,5 мм биопсии удар, чтобы открыть входы и розетки на устройстве. Обложка PDMS части устройства с 48 мм в ширину упаковочной лентой, чтобы держать его в чистоте от пыли и мусора.
  4. Затем используйте ножницы для вскрытия, чтобы вырезать прямоугольник поликарбоната диаметром 5 мм х 50 мм с 5 мкм пор и хранить его внутри чашки Петри для более длительного использования.
  5. Соберите следующее: 200 мкл наконечник пипетки, 2 мл 1:10 PDMS смешивается с толуолом в соотношении 2:3 по весу в стеклянном флаконе, Пастер пипетка с выжимкой лампы, подготовленные PDMS верхней и нижней частей, мембраны, три 50 мм х 75 мм стеклянные слайды и транспортировать все это в шпатель. Следующие шаги для сборки и посева клеток устройства изображены на рисунке 1.
  6. Используйте пипетку Pasteur для передачи 1 мл PDMS: раствор клея толуола в 50 мм х 75 мм стеклянную горку на патроне спинового пальто. Спин в течение 5 секунд при 100 об/мин (ускорение 300 об/мин/с) и 30 секунд при 2000 об/мин (ускорение 300 об/мин/с).
  7. Поместите слайд на стол и накройте его одной верхней камерой PDMS и одной нижней камерой, чтобы лица PDMS с функциями, вылитыми в него, соедкнулись с горкой, а клей был перенесен на лицо PDMS с изложением периметра всех объектов.
  8. Переверните верхнюю камеру PDMS на другую горку с клеем покрытия вверх и тщательно поместите мембрану через устройство между входами и розетками. Поместите наконечник 200 ЗЛ в PDMS: раствор клея толуола, пока он не злой некоторые в кончике. Коснитесь кончика между каждым входом и розеткой, чтобы поместить небольшую каплю вблизи края мембраны, где он контактирует с PDMS.
  9. Удалите другую половину устройства и поместите его на с клеем покрытие вниз при выравниваи входы и розетки на двух частях.
  10. Поместите собранное устройство в духовку при температуре 37 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить клей. Перенесите в банку вакуумного колокола с desiccant и дайте обезвоживания в течение двух дней. Это важный шаг, чтобы позволить Толуол испаряться и улучшить консистенцию посева устройства путем регулирования поглощенного водяного пара в лабораторном воздухе.

3. Семя микро-среды мозга в устройство

  1. Культура клеток и реагенты: Перед началом этого протокола, получить следующие реагенты и клетки. Культивировать все клеточные линии в инкубаторе, установленных при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2.
    1. Поддержание человека тройной отрицательный рак молочной железы клеточной линии MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) и MDA-MB-231-BR-GFP клеток (получено от Патрисия Стик, доктор философии) в DMEM с 4,5 г / л глюкозы, дополненный 2 мМ Л-глутамин, 10% FBS и 1x антибиотик-антикомит. Создание MDA-MB-231-GFP флуоресцентных клеток путем выобразования MDA-MB-231 ячейки с пустым вектором PLL-EV-GFP лентивирус. Сортировать транс-индуцированной GFPи населения с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) до экспериментов.
    2. Поддержание микрососудистых эндотелиальных клеток человеческого мозга hCMEC/D3 в среде EGM-2. Создание hCMEC/D3-DsRed флуоресцентных клеток путем трансдуцирования hCMEC/D3 с пустым вектором pLL-3.7-dsRed лентивирус. Удалите все не трансиндуцированные, нефлуоресцентные клетки из культуры с помощью FACS до экспериментального использования.
    3. Поддерживайте нормальные человеческие астроциты (NHA) в DMEM, дополненные 4,5 г/л глюкозы, 10% FBS, 2 мМ Glutamax, 1 мМ пируват натрия, 1x N-2 добавка роста, и 1x антибиотик-антимикотический. Увековечить астроциты путем трансдуцирования пЛОХ-ТЕРТ-иресТК лентивирусного вектора (Addgene 12245). Создайте вектор с помощью плазмидной psPAX2 и плазмидной плазмиды pMD2.G (Addgene 12260 и 12259).
  2. Удалите устройство МКББН из вакуумного децикатора и поместите на металлическую или бумажную (т.е. ленту) поверхность с входами, обращенными вниз, и поместите ее в плазменную камеру. Кроме того, поместите 50 мм х 75 мм стекла слайд в плазменной камере. Вытяните вакуум, а затем обработать плазмой при 80 Вт на 30 с.
  3. Быстро удалите стеклянную горку и устройство из плазменной камеры и поместите устройство с входами, обращенными вверх на стеклянную горку, выровненную спомощью направляющий выступ (Дополнительный файл 2). Это создаст постоянную связь между PDMS и стеклянным слайдом и не может быть переоеклееном.
  4. Затем отрежьте кончики 16, 200 мкл пипетки советы, 2 мм от кончика. Вставьте пипетки советы во все входы и розетки. Устройство может быть помещено обратно в вакуумный децикатор в этот момент, если не готовы к посеву клеток.
  5. Поместите устройство обратно в плазменную камеру и обработать плазмой в течение 8 минут при 200 Вт. После того, как устройство остынет (5 мин) от плазменной обработки поместите его в стерильный вторичный контейнер, как прозрачная коробка наконечника пипетки. Выполните следующий шаг в течение 15 мин или эффективность лечения плазмы может быть снижена, что приводит к засорения.
  6. За несколько дней до эксперимента культура Петри блюда 1 х 106 эндотелиальных клеток (hCMEC/D3-DsRed) и 1 х 106 астроцитов (NHA). В то время как устройство проходит 8-минутную плазменную обработку, подготовьте коллагеновый раствор, состоящий из 0,5 мл 3 мг/мл бычьего коллагена I типа PureCol с 64 л 0,8 МНаГКО 3 и 20 л 10-х высокохо глюкозы (250 мММ) MEM. Приостановить 5.0 x 105 NHA клеток в коллагеновом растворе. Поддерживайте раствор на льду, не пользуясь при этом.
  7. Передача 120 МКЛ раствора коллагена/астроцита/микроглии в устройство через наконечник пипетки для нижней камеры(рисунок 1 Красные стрелки). Разрешить раствор фитиль через камеру в противоположную наконечник пипетки. После того, как все четыре канала устройства были заполнены место чипа в инкубаторе CO2 при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 1 ч или до тех пор, пока коллаген установлен.
  8. После коллагена наборы, заполнить все пипетки советы кормления нижней камеры со смесью полного средства массовой информации. Для микросхем, содержащих эндотелиальные клетки и астроциты, используется смесь эндотелиальных:астроцитов 50:50.
  9. Пальто верхней палаты с 2% рост-фактор сократил Matrigel в полном эндотелиальных средств массовой информации с помощью верхней камеры пипетки отзыв (Рисунок 1 Голубые стрелки) и место в инкубаторе в течение 1 часа.
  10. Промыть верхнюю камеру с указанной смесью средств массовой информации и альтернативный, который наконечник посеян с эндотелиальными клетками (Рисунок 1 Зеленые стрелки). Приостановить 1 х 106 эндотелиальных клеток в 1 мл эндотелиальных средств массовой информации и семян 30 йл каждые 15 минут в чередующихся верхней камеры советы для равномерного покрытия. Семенные эндотелиальные клетки в каждую верхнюю камеру наконечник дважды, в общей сложности 4 раза на камеру.
  11. После окончательного посева эндотелиальных клеток, заполнить все советы со смесью средств массовой информации и поместить устройство в инкубатор на 37 градусов по Цельсию и 5% CO 2 ,изменение средств массовойинформации в обеих камерах каждые 12 ч.

4. Мониторинг прогрессирования образования эндотелиального слоя

  1. Полное покрытие канала эндотелиальным слоем наблюдается через 3 дня. Используйте один из двух методов мониторинга покрытия эндотелиального барьера: флуоресценция или TEER. hCMEC/D3-DsRed флуоресценция и в соответствии с % охвата по всей области канала могут быть количественно с помощью ImageJ.
    1. Откройте файл TIFF в ImageJ представителя барьера hCMEC/D3-DsRed. В программном обеспечении ImageJ щелкните Файл, чтобы выбрать файл.
    2. Слияние всех слоев изображения, используя максимальную интенсивность после этих ключевых команд и опций: Изображение и стеки
    3. Выполните цветовой порог, который одинаков во всех микрофлюидных чипах, оцениваемых с помощью этого метода. Для представленного исследования мы использовали порог в 450. Используйте пороговое меню в ImageJпо: Изображение
    4. Установите измерения, которые будут записаны с использованием следующих команд и опций: Анализ и установить измерения
    5. Выберите репрезентативную область микрофлюидного канала для измерения, нарисовав коробку. Коробка инструмент находится в главном меню ImageJ. Мера 3 технических репликаций, расположенных в начале, середине и конце каждого микрофлюидного канала с использованием одного и того же размера коробки.
    6. Проанализируйте каждый канал и замитируйте площадь фракции, что представляет собой % эндотелиальный охват. Экспорт этих измерений в виде файлов электронной таблицы для построения и визуализации данных с помощью следующих команд: Анализ и измерение.
  2. В качестве альтернативы используйте Impedance спектроскопии на основе TEER для измерения эндотелиальных жестких соединений в области. Количественная оценка эндотелиального барьера с использованием TEER является прокси для целостности эндотелиального слоя в качестве барьера.
    1. Распоить два электрода в входе и выходе верхней и нижней камер.
    2. Количественная оценка импотенции эндотелиального монослойного как сочетание сопротивлений, индукций и емкостей в чипе в соответствии с моделью, предложенной Srinivasan et al.28,29.

5. Семенные раковые клетки в устройство

  1. После того, как эндотелиальный слой созрел, раковые клетки семян в устройство. Подготовка 1 мл раствор 1 х 10 6 раковыхклеток в полном раковых клеток.
  2. Обмен средствами массовой информации в чипе для пополнения клеточной культуры питательных веществ.
  3. Семя каждого верхнего камерного канала с 30 МЛ раковых клеток в подвеске, а затем поместить устройство обратно в инкубатор в течение 15 минут. Всегда семени раковых клеток на той же стороне всех четырех верхних камерных каналов в одном устройстве.
  4. Обмен устройства с новыми средствами массовой информации и пополнить советы каждые 12 часов, пока устройство не будет изображен для метастатического поведения.

6. Изображение микро-среды опухоли с помощью конфокальных изображений

  1. При желаемой экспериментальной точке времени (1, 2 или 9 дней) используйте конфокальные изображения для захвата 3D-изображения канала. Мы выполняем этот шаг на Nikon A1, используя описанные здесь настройки. Этот шаг автоматизирован, и каждый канал требует 20-40 мин для изображения в зависимости от того, сколько флуоресцентных каналов включены и глубины, необходимой для покрытия положения всех ячеек.
  2. Включите микроскоп, откройте программное обеспечение и поместите крышку инкубатора на микроскоп.
  3. Установите нагреватель стадии микроскопа до 37 градусов по Цельсию и COот 2 до 5%, если таковые имеются.
  4. После того, как микроскоп инкубатор стабилизировался, поместите устройство в стадию микроскопа с помощью 50 мм х 75 мм крепления.
  5. Сосредоточьтесь на одной стороне устройства (слева, если он будет использоваться с предоставленным аналитическим программным обеспечением) с 10-й целью и установите высоту в ноль. Под настройками z-stack, включите диапазон 100 мкм выше и 200 мкм ниже плоскости фокусировки. Затем используйте настройку сшивания, чтобы установить число полей X и Y до 1 и 9 соответственно с 15% перекрытия. Установите пинхол до рекомендуемого минимума, а высоту z-слоя до 9 мкм. Отрегулируйте яркое воздействие поля так, чтобы была видна пористая мембрана. Включите лазеры возбуждения для каналов dsRed (561 нм) и GFP (488 нм) и отрегулируйте флуоресцентные лазерные силы и отрубы так, чтобы каждый канал был виден без перенапряжения пикселей.
  6. Убедитесь, что все поля находятся в центре внимания при перешагии. Если это так, введите имя файла вывода (001.nd2) для изображения и начните эксперимент по автоматическому захвату 3D конфокального изображения.

7. Измерение микро-среды опухоли с помощью конфокальные томографии

  1. Используйте конфокалиографическую томографию для оценки набора метрик и измерений, описывая отдельные клетки и микросреду опухоли внутри устройства. Конфокальный томографическийанализ (рисунок 2)преобразует конфокальный z-стек в трехмерное представление клеток. Используя пользовательский скрипт питона в блокноте Jupyter/лаборатории, плоскость затем соответствует слою клеток, которые образуют геммоградный барьер, какмембрана 30. Наконец, сделать фенотипические измерения популяций раковых клеток (Таблица 1).
    1. Выполните этот анализ в конце эксперимента или в течение некоторого времени. Установите питона и соответствующие библиотеки в соответствии со ссылкой на руководство по программному обеспечению, а затем откройте программное обеспечение от Windows Command Prompt, запуская команду "Conda activate", а затем "джупитер лаборатории". Среда Jupyter будет загружаться в браузере по умолчанию.
    2. Из файла Jupyter исследователь дважды нажмите на записную книжку Jupyter "contom.ipynb", чтобы открыть его. Запустите ячейку под заголовком Импорт библиотек, пользовательских классов / функций и настройки ноутбука, нажав на ячейку ноутбука, а затем нажав кнопку воспроизведения. Все ячейки ноутбука ниже выполняются с использованием одного и того же подхода. Обратите внимание, что здесь блокнот "ячейка" относится к блоку кода питона в ноутбуке Jupyter.
  2. Подготовь данные. Этот алгоритм использует набор инструментов визуализации (VTK) для управления и отображения z-стека и трехмерных данных17.
    1. Место при условии . Файл XLSX ("Экспериментальный трекер.xlsx") в той же папке windows, что и ноутбук Jupyter. Файл отслеживает эксперименты и интерфейсы с ноутбуком Jupyter. Поместите файл ND2 из раздела 6 в субфолдер под названием «Experiment_XXX»Confocal» ниже местоположения ноутбука Jupyter. Дополнительные папки эксперимента могут быть добавлены внутри путем настройки "XXX" на числовой идентификатор, назначенный новым папок.
    2. Наклеить на этикетку первую папку эксперимента "Experiment_001" и файл ND2 "001.nd2". Во-первых, преобразовать файл изображения ND2 в сшитый многообразный файл TIFF, разделенный цветным каналом. Сделайте это, выполняя ячейку ноутбука под заголовком "Читайте конфокальный стек z в память" с функцией Save_tiff_from_ND2 () uncommented30. Файл ND2 является фирменным форматом изображений от Nikon, поэтому необходимо преобразовать его в формат, с помощью которого совместимо программное обеспечение с открытым исходным кодом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TIFF (Формат файла изображения тегов) используется, потому что он вездесущ, 16 бит совместим, легко импортируется в VTK, и несколько изображений могут храниться в одном файле, который подходит для изображений z-stack. Выполнение ячейки ноутбука будет читаться на изображении из файла ND2, извлекать информацию о цвете и позициях XY, а затем хранить это изображение в numpy массиве в соответствии с заранее определяемой структурой. Затем он сохранит массив в качестве файла TIFF с помощью tifffile библиотеки питона.
  3. Преобразование данных изображений в 3D-модель
    1. Импорт файла TIFF в VTK (vtkTIFFReader) с помощью 3D-рендеринга для визуализации ячеек(рисунок 2). Выберите порог в зависимости от цвета ячеек изображения. Чтобы прояснить, объект VTK представляет собой блок пикселей (X, Y, q) в пространстве (объем), но только определенные пиксели (зеленый или красный) представляет ячейки, остальные фон или шум (черный).
    2. Поэтому установите фильтр непрозрачности на том, который удаляет фон, подтверждающий, что флуоресценция остается только клетками. Сделайте это с помощью ячейки ноутбуков Jupyter под названием Change opacity values для каждого канала микроскопа, регулируя переменные Channel_alpha значения (т.е. GFP_alpha). Визуализуйте эффект с помощью ячейки ноутбука под названием Просмотр 3D-рендеринга для проверки правильного набора порога.
    3. Сохраните значения непрозрачности в электронной таблице для использования на следующем этапе. Преобразование данных объема в отдельные 3D-объекты, каждый из которых представляет ячейку на изображении с помощью метода, называемого марширующихкубов 31. Этот алгоритм извлекает многоугольную сетку из изосурфея из трехмерных дискретных масштабарных полей вокелей.
    4. Используйте значение непрозрачности в алгоритме марширующих кубов, чтобы отделить каждую ячейку от фона. Выполните этот шаг для всех флуоресцентных клеток, идентифицированных в каждом канале микроскопа, запуская изображение Конверт вокселя в треугольную сетку и сохраните в качестве файла VTK в блокноте.
  4. Установка плоскости к мембране
    1. Приготовь плоскость к эндотелиалному барьеру, сначала найдя центроиды клеток (ячейка ноутбука: Анализ канала RFP (эндотелиальный барьер)). Итерировать через список сетки в объеме и извлечь регионы, которые не подключены с помощью PolyDataConnectivityFilter из VTK. Рассчитайте центроид каждой сетки и добавьте измерение в список центроидов фильтрации для сеток, которые являются слишком большими или слишком маленькими (Lt;50,
    2. Fit плоскости в список центроидов для эндотелиальных клеток с помощью минимизации метода ошибки (ноутбук ячейки: Fit плоскости RFP центроидов (эндотелиальный барьер)) (Рисунок 2, Рисунок 3)32. Осмотрите припадок плоскости, настроив плоскость и центроиды и при необходимости отрегулируйте вручную (с помощью тета, бета и z), запуская ячейку ноутбука под названием Visualize RFP centroids и плоскостную подгонку.
    3. После того, как самолет правильно установлен, сохранить нормальный плоскости в файл Experiment Tracker . XLSX файл для использования в будущем.
  5. Проанализируйте описательные особенности отдельных раковых клеток для следующих дескрипторов(таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если компьютер, выполняющий анализ отстает, высокий анализ пропускной способности с помощью высокопроизводительных вычислений является вариантом. Этот алгоритм полезен на стандартных ноутбуках для анализа небольшого количества ячеек, однако VTK не очень хорошо подходит для большого количества отдельных объектов .gt;1000). Поэтому необязательно использовать адаптированный алгоритм для работы в высоко производительном вычислительном кластере. Это позволяет быстро проводить эксперименты со многими клетками(рисунок 2). Все 7.5 осуществляется путем запуска клеток ноутбука под названием Анализ оставшихся каналов микроскопа для фенотипических дескрипторов и читать в Experiment_tracker информации и анализировать каналы, которые существуют.
    1. Измерьте экстравазию раковых клеток: После характеристики эндотелиального слоя с плоскости, измерить объем каждой раковой клетки, которая мигрировала через мембрану. Клип каждой клетки (Boolean) так, что сетка ниже мембраны хранится и часть над мембраной удаляется33. Затем закройте открытую сетку (vtkFillHoles).
      1. Пересчитать нормальный и новый центроид обрезанной сетки. Измерьте объем и положение каждой обрезанной раковой клетки для анализа. Объем эквивалентен количеству вокселей, заполненных сеткой каждой ячейки. Рассчитайте расстояние между эндотелиальной плоскости и положение каждой раковой клетки.
    2. Измерьте клеточный фенотип: Рассчитайте морфологию каждой раковой клетки, учитывая ее форму, объем и положение.
  6. Проверка измерений и сохранение электронной таблицы или участка. Запустите ячейку ноутбука под названием Проверка того, что центроиды были измерены точно, и визуализация всплывает, показывая центроиды, идентифицированные поверх изображенного объема по типу ячейки. После того, как все эксперименты будут проведены экспортировать полный набор данных в качестве единого файла электронной таблицы, введя эксперименты, которые будут включены ID в ячейку ноутбука под названием Экспорт данных в качестве единого файла данных.XLSX для экспериментов переменных, заменяющих данные идентификаторы эксперимента. Если проверить завершенный набор данных, участок его с помощью ячейки ноутбука под названием Расстояние экстравагантной полосы участка. Сюжет появится в среде ноутбука и сохранится для файла.

8. Проанализировать связанные характеристики с помощью искусственного интеллекта

ПРИМЕЧАНИЕ: Определить метастатические фенотипические функции с помощью алгоритмов искусственного интеллекта.

  1. Выполните двоичную классификацию с использованием orange в соответствии со схемой, показанной на рисунке 5 и дополнительном файле 3. Начните Оранжевый со второго Windows Command Prompt, введя "conda активировать", а затем "python-m Orange.canvas" и нажмите Новый от подсказки. Оранжевый является перетащить и падение на основе программного обеспечения, так что организовать функции, перетащив каждый элемент из левого меню на холсте, чтобы соответствовать дополнительный файл 3. После этого полное двойное нажатие на значок файла и выберите файл .XLSX данных.
  2. Фильтруйте данные для удаления плохих измерений, определяемых как те, которые не выполнили операцию Boolean или давали параметрические переменные значения за пределами известных границ с помощью значка «Выберите строки». Дважды щелкните значок и установите условия, соответствующие фильтру, такие как "Сферичность составляет от 0 до 1". Создайте условия для 8.2.1, 8.2.2 и 8.2.3.
    1. Расстояние фильтра экстравазированных измерений в диапазоне от -100-200 мкм.
    2. Измерения сферичность фильтра формы клетки в диапазоне от 0-1.
    3. Измерение объема раковых клеток в диапазоне от 0-2000 вокселей.
    4. Используйте все параметрическиепеременные (таблица 1)для классификации мозговых метастатических MDA-MB-231-BR-GFP и немозгомовых метастатических MDA-MB-231-GFP. Двойной клик Выберите значок столбцов с холста. Используя кнопку для перемещения доступных переменных в функции, целевые переменныеили атрибуты Meta. Единственной переменной, которая должна быть целевой переменной, является метастатическая метка, которая определяет, считаются ли ячейки в наборе данных метастатическими (1) или нет (0). Переменные эксперимента могут быть помещены в раздел Мета Атрибуты.
  3. Пример данных в обучении (80%) и тестовый набор (20%). Дважды нажмите значок пробоотборщика данных и выберите тип выборки фиксированной пропорции данных: установите до 80% и выберите реплицируемые и стратификационые чек-боксы. Стратификация и перекрестная проверка учебного набора с использованием 10 складок против каждой модели/классификатора. Двойной клик Тест и Оценка и выберите перекрестную проверку с числом складок: установить до 10 и Стратифицированный проверили. Установите целевой класс до 1.
  4. В этом методе используйте алгоритмы обучения нейронных сетей и случайных лесов, поскольку они являются надежными для данных. В значке Random Forest выберите количество деревьев 50 и не выбирайте другие варианты. В рамках нейронной сети значок выбрать Нейроны за скрытые layer: 100, Активация: ReLu, Solver: Адам, Альфа: 0.0001, и Макс Итерации: 200. Тем не менее, эти настройки будут значительно отличаться в зависимости от исследования и должны быть хорошо поняты перед применением.
  5. После настройки холста дважды щелкните каждый значок из файла в образец данных и либо нажмите Применить или Отправить данные. Двойной клик Тест и Оценка и учебные данные начнут использоваться для разработки модели с использованием алгоритмов. После обучения модели машинного обучения, повторно открыть тест и оценка и выбрать тест на тестовых данных и закрыть всплывающее окно, чтобы оценка производительности модели, классифицируя клетки в чипе в зависимости от вероятности, что они метастатические мозга от 0 до 1.
  6. Сохраните производительность модели машинного обучения в файле(таблица 2). Включите область под кривой (AUC) ROC, точность и F1 оценка. Сохраните второй файл, содержащий отдельные метастатические индексы и вероятности классификации. Дважды нажмите значок Сохранить и нажмите Сохранить Как написать, чтобы подать вероятности классификации. Аналогичным образом, кривую ROC можно просмотреть, дважды нажав значок анализа ROC, и производительность модели может быть рассчитана двойным нажатием значка Матрицы Путаницы.

Результаты

Используя этот метод, мы проанализировали типы клеток, помеченные различными флуоресцентными белками или красителями. Мы демонстрируем использование этого подхода с помощью чипа мББН, сформулированного с помощью hCMEC/D3-DsRed и нефлуоресцентных астроцитов. Микрососудистые эндотелиальны?...

Обсуждение

Мы разработали и представили новый метод, который адаптирует инструменты, часто используемые в клинических анализах изображений для измерения экстравазии и миграции раковых клеток через эндотелиальный барьер в ткани мозга. Мы считаем, что такой подход может быть полезен как для измер...

Раскрытие информации

Нет никаких раскрытий, чтобы объявить.

Благодарности

Мы благодарим лабораторию Steeg в Национальном институте рака за щедрое пожертвование клеток MDA-MB-231-BR-GFP. Конфокальцная микроскопия была проведена в Институте биоинтерфейсов Мичиганского университета (BI). Цитометрия потока была выполнена в Университете Мичигана поток цитометрии ядра. Вирусные векторы были созданы Университетом Мичигана Vector Core. Мы также благодарим Келли Кидвелл за руководство в статистическом анализе этих данных.

Финансирования:

C.R.O. была частично поддержана стипендией NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) и 1R21CA245597-01. T.M.W. была частично поддержана 1R21CA245597-01 и Национальным центром продвижения переводческих наук Национальных институтов здравоохранения под номером UL1TR002240. Финансирование материалов и характеристики было предоставлено Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Фонд METAvivor, и Фонд исследований рака молочной железы. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения Национальных институтов здравоохранения

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

Ссылки

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
  27. Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
  33. Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены