Cuantificación del microambiente del tumor metastásico cerebral mediante un modelo 3D de chip organ-on-A, aprendizaje automático y tomografía confocal

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para preparar y cultivar un microambiente tumor metastásico de barrera hematoencefálica y luego cuantificar su estado mediante imágenes confocales e inteligencia artificial (aprendizaje automático).

Resumen

Las metástasis cerebrales son las lesiones de cáncer más letales; 10-30% de todos los cánceres hacen metástasis en el cerebro, con una mediana de supervivencia de sólo 5-20 meses, dependiendo del tipo de cáncer. Para reducir la carga tumoral metastásica del cerebro, es necesario abordar las brechas en el conocimiento básico y traslacional. Los principales desafíos incluyen una escasez de modelos preclínicos reproducibles y herramientas asociadas. Los modelos tridimensionales de metástasis cerebral pueden producir los datos moleculares y fenotípicos relevantes utilizados para abordar estas necesidades cuando se combinan con herramientas de análisis específicas. Además, en comparación con los modelos murinos, los modelos de órgano en chip de células tumorales de pacientes que atraviesan la barrera hematoencefálica hacia el microambiente cerebral generan resultados rápidamente y son más interpretables con métodos cuantitativos, por lo que son susceptibles de pruebas de alto rendimiento. Aquí describimos y demostramos el uso de una novedosa plataforma de nicho cerebral de sangre microfluídica 3D ('mBBN') donde múltiples elementos del nicho pueden ser cultivados durante un período prolongado (varios días), imágenes fluorescentes por microscopía confocal, y las imágenes reconstruidas utilizando una innovadora técnica de tomografía confocal; todo tenía como objetivo entender el desarrollo de la micro-metástasis y los cambios en el microambiente tumoral (TME) de una manera repetible y cuantitativa. Demostramos cómo fabricar, semillar, imagen y analizar las células cancerosas y componentes celulares y humorales TME, utilizando esta plataforma. Por otra parte, mostramos cómo se utiliza la inteligencia artificial (IA) para identificar las diferencias fenotípicas intrínsecas de las células cancerosas que son capaces de transitar a través de un modelo de mBBN y para asignarles un índice objetivo del potencial metastásico cerebral. Los conjuntos de datos generados por este método se pueden utilizar para responder preguntas básicas y traslacionales sobre la metástasis, la eficacia de las estrategias terapéuticas y el papel del TME en ambos.

Introducción

Las metástasis cerebrales son las lesiones de cáncer más letales; 10-30% de todos los cánceres metástasis en el cerebro, con una mediana de supervivencia de sólo 5-20 meses, dependiendo del tipo de cáncer^1,,2. Una pregunta principal que surge al estudiar la metástasis del cáncer es cómo los sub clones migran del ambiente humoral del torrente sanguíneo a un órgano como el cerebro^3,,4. Esta pregunta ha dado lugar a muchas variaciones de los ensayos de migración, invasión y extravasación. Todos estos métodos comparten el paso crítico de contar o medir las propiedades de las células que se mueven de una ubicación a otra en respuesta a un estímulo. La mayoría de los ensayos de migración fácilmente disponibles se utilizan para estudiar la migración bidimensional (2D) de células cancerosas. Estos han aclarado una gran cantidad de conocimiento; sin embargo, no recapitulan la naturaleza tridimensional del sistema in vivo que otros métodos pueden proporcionar⁵. Por lo tanto, es necesario estudiar el microambiente tumoral (TME) en sistemas tridimensionales (3D), pero los enfoques de análisis disponibles para las estructuras 3D son limitados y a menudo inconsistentes.

Una de las herramientas 3D más populares es una cámara Boyden que consiste en una membrana suspendida en la parte inferior de un pozo, separando dos regiones distintas. Boyden introdujo el ensayo para estudiar la quimiotaxis de leucocitos⁴. Las regiones inferiores pueden variar por química u otros medios^6,7 para inducir a las células de la región superior a migrar a la región inferior. El enfoque más común para cuantificar el número de células que han migrado es liberar las células de la parte inferior de la membrana utilizando una solución tampón, anlicerlas y luego contarlas en función de la cantidad de contenido de ADN en la solución^7. Este enfoque indirecto es propenso a errores del operador debido a la variabilidad de la técnica y el procedimiento destruye información sobre el fenotipo de cáncer y el microambiente. Las variaciones del ensayo de la cámara boyden implican la fijación de células migratorias que permanecen en la membrana, pero sólo proporciona un recuento de células que ya no son viables para el estudio continuo^6,,8,,9.

Debido a las limitaciones de la cámara Boyden y al crecimiento de las innovaciones en la comunidad microfluídica, se han desarrollado chips de ensayo de migración que observan el movimiento de las células en respuesta a un estímulo en una dirección en lugar de tres^10,,11,,12. Estos ensayos de migración facilitan el control sobre factores como el flujo o la separación de una sola célula^13,14 que permiten una mejor interpretación de los resultados; sin embargo, su formato 2D inevitablemente pierde cierta información dinámica. Estudios recientes se han centrado en la extravasación (es decir, el movimiento de las células de la circulación a un tejido, como la barrera hematoencefálica) en un entorno 3D^14,,15. La distancia de extravasación en el tejido y el comportamiento de sondeo que se produce en la barrera celular / membrana es más refinado que las mediciones obtenidas utilizando la cámara Boyden o un dispositivo de migración microfluídica 2D¹⁶. Por lo tanto, los dispositivos que permiten la creación de imágenes y el análisis adecuados de la extravasación 3D son fundamentales para capturar estas mediciones sofisticadas, pero carecen de literatura.

Independientemente de los ensayos de migración, se han desarrollado técnicas de imagen robustas para la resonancia magnética (RM) y la tomografía que son capaces de identificar y reconstruir con precisión el tejido en el espacio 3D^17,,18. Estas técnicas adquieren imágenes en pilas z y partes de segmentos de la imagen basadas en las propiedades del tejido y luego convierten las imágenes segmentadas en mallas tridimensionales^19,,20,,21. Esto permite a los médicos visualizar en 3D órganos individuales, huesos y vasos para ayudar en la planificación quirúrgica o ayuda en el diagnóstico de cáncer o enfermedades del corazón^22,,23. Aquí, mostraremos que estos enfoques se pueden adaptar para su uso en muestras microscópicas y dispositivos de extravasación 3D.

Para ello, desarrollamos la innovadora técnica de tomografía confocal, presentada en el presente documento, que ofrece flexibilidad para estudiar la extravasación de células tumorales a través de una membrana mediante la adaptación de las herramientas de tomografía existentes. Este enfoque permite el estudio de la gama completa de comportamientos de las células cancerosas a medida que interactúan con una barrera celular, como una capa celular endotelial. Las células cancerosas exhiben comportamientos de sondeo; algunos pueden invadir pero permanecer cerca de la membrana, mientras que otros atraviesan la barrera fácilmente. Esta técnica es capaz de producir información sobre el fenotipo de la célula en todas las dimensiones^24. El uso de este enfoque para estudiar el TME es relativamente barato, fácil de interpretar y reproducible, en comparación con modelos murina in vivo más complejos. La metodología presentada debe proporcionar una base sólida para el estudio de muchos tipos de tumores y microambientes mediante la adaptación de la región estromal.

Describimos y demostramos el uso de una plataforma de nicho de cerebro encefádico microfluídico 3D(Figura 1) donde los elementos críticos de la barrera y el nicho (células endoteliales microvasculares cerebrales y astrocitos) pueden ser cultivados durante un período prolongado (aproximadamente hasta 9 días), imágenes fluorescentes por microscopía confocal, y las imágenes reconstruidas utilizando nuestra técnica de tomografía confocal(Figura 2); todo tenía como objetivo entender el desarrollo de la micro-metástasis y los cambios en el microambiente tumoral de una manera repetible y cuantitativa. La interfaz de barrera hematoencefálica con el nicho cerebral se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales que se fortalecen mediante membrana de sótano, pies de astrocito y pericitos^25. Nos centramos selectivamente en los componentes astrocitos y endoteliales dada su importancia en la formación y regulación de la barrera hematoencefálica. Demostramos cómo fabricar, semilla, imagen y analizar las células cancerosas y los componentes celulares y humorales del microambiente tumoral, utilizando esta plataforma. Por último, mostramos cómo se puede utilizar el aprendizaje automático para identificar las diferencias fenotípicas intrínsecas de las células cancerosas que son capaces de transitar a través de un modelo de bBBN y para asignarles un índice objetivo del potencial metastásico cerebral²⁴. Los conjuntos de datos generados por este método se pueden utilizar para responder preguntas básicas y traslacionales sobre metástasis, estrategias terapéuticas y el papel del TME en ambos.

Protocolo

1. Preparar el molde de nicho de barrera hematoencefálica

NOTA: El dispositivo de cultivo utilizado en esta plataforma es un andamio basado en PDMS sobre el que construimos un nicho de barrera hematoencefálica celular. Está hecho de dos partes separadas por una membrana porosa. Para preparar el nicho de barrera hematoencefálica dos sumo-8 moldes hechos con fotolitografía son necesarios^26,,27. El protocolo se describirá primero para el molde de 100 m de espesor y luego se darán notas para el molde de 200 m de espesor.

1. Para preparar el molde, limpie una oblea de silicio de 4" usando acetona con una botella de compresión y luego séquela con una pistola de nitrógeno.
   1. Hornee la oblea de silicio en una placa caliente durante 10 minutos a 200 oC para eliminar todo el disolvente residual.
   2. A su vez, centra la oblea de silicio en el mandril de una recubridora de centrifugado y dispensa 1 mL de SU8-2075 para el molde superior. Gire durante 5 s a 500 rpm (aceleración 300 rpm/s) para dispersar el fotorresistente y luego 30 s a 2200 rpm (aceleración 300 rpm/s) para obtener un recubrimiento SU-8 de 100 m de espesor. La optimización puede ser necesaria para alcanzar el espesor especificado.
2. Hornee suavemente la oblea en una placa caliente a 65 oC durante 2 min y luego inmediatamente a 98 oC durante 20 min.
3. Coloque la oblea en una lámpara de fotolitografía y coloque la máscara centrada en la oblea de acuerdo con los procedimientos estándar. Exponga las obleas recubiertas SU-8 con un resplandor de 230 mJ/cm² de UVB (360 nm ± 10 nm). Se puede realizar un experimento de matriz de exposición para determinar la dosis óptima. Los diseños de máscaras están disponibles en el archivo suplementario 1.
4. Realizar un horneado post-exposición a 65 oC durante 2 min y luego inmediatamente a 98 oC durante 10 minutos para mejorar la adherencia. Enfríe la oblea a 50 oC.
5. Retire la resistencia no expuesta con el foto-desarrollador SU-8. Enjuague la oblea en el desarrollador durante 5 minutos en un baño y luego use una botella de spray llena de SU-8 desarrollador en una capucha química para agitar y eliminar el SU-8 no curado restante. Se puede utilizar un microscopio 4x para observar si se ha eliminado todo el SU-8 no curado. Una línea blanca en los bordes de las características fotorresistentes indica que el SU-8 no se ha eliminado completamente.
6. Realizar un último horneado duro en un horno a 110 oC durante 60 min.
7. Siga el mismo procedimiento para el molde de 200 m de espesor utilizando SU-8 2075, pero ajuste el protocolo a lo siguiente:
   1. Ajustes de la recubridora de centrifugado: Gire durante 5 s a 500 rpm (aceleración 300 rpm/s) para dispersar el fotorresistente y luego 30 s a 1300 RPM (aceleración 300 rpm/s) para obtener un recubrimiento de 200 m de espesor.
   2. Hornee suave a 65oC durante 2 min y luego a 98oC durante 40 min.
   3. Tiempo de exposición de 340 mJ/cm².
   4. Post exposición al horno: 2 min a 65oC y 98oC durante 15 min.
8. Por último, silanice cada oblea colocándolas en una cámara de vacío dentro de una campana química con un recipiente de plástico en el que se han colocado 3 gotas (150 l) de solución silanizante (Trichloro perfluoro octyl silane). Tire de un vacío y deje durante la noche para permitir que el vapor cubra la oblea. Este paso reduce la adherencia entre el SU-8 y PDMS, aumentando la vida útil del molde.
   ADVERTENCIA: El perfluoroctilo de tricloro siano debe manipularse siempre en la campana de humos y mantenerse alejado de las fuentes de agua.
9. Coloque moldes de obleas individuales en platos Petri de 150 mm utilizando dos tiras de cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de que las obleas estén planas. Una alternativa es fabricar un molde de aluminio dentro del cual se puede colocar la oblea. Debido a que el molde de aluminio está cerrado, producirá moldes con un grosor uniforme, mientras que el método de la placa Petri es sensible a la inclinación de la superficie en la que se coloca. La planitud mejorada de las conversiones PDMS reduce el tiempo de imagen confocal aguas abajo.

2. Forme y ensamble el dispositivo de barrera hematoencefálica (BBB) de PDMS

1. Mezclar 75 g de PDMS en una proporción de 1:10 (Crosslinker:Base) en peso en una taza de plástico.
2. Vierta el PDMS sobre los moldes (1 mm de espesor para el molde de 200 m de espesor y 4 mm para el molde de 100 m de espesor) y degaste en un desecador de vacío durante una hora o hasta que se hayan eliminado todas las burbujas. Colocar en un horno de 65oC durante la noche. El espesor de 1 mm puede ajustarse en función de la distancia de trabajo del objetivo 10x en el microscopio confocal.
3. Una vez curado el PDMS, utilice una hoja para cortar suavemente contra la oblea a través de PDMS alrededor de los bordes. Pele los PDMS y utilice una hoja para cortar a lo largo de las guías rectangulares y un punzón de biopsia de 1,5 mm para abrir las entradas y salidas del dispositivo. Cubra las piezas del dispositivo PDMS con cinta adhesiva de 48 mm de ancho para mantenerla limpia del polvo y los desechos.
4. A continuación, utilice tijeras de disección para cortar un rectángulo de 5 mm x 50 mm de membrana de policarbonato con poros de 5 m y guárdelo dentro de una placa Petri para su uso posterior.
5. Reúna lo siguiente: punta de pipeta de 200 l, 2 ml de 1:10 PDMS mezclados con tolueno en una proporción de 2:3 en peso en un vial de vidrio, una pipeta Pasteur con una bombilla de compresión, las partes superior e inferior de PDMS preparadas, la membrana, tres diapositivas de vidrio de 50 mm x 75 mm y transportarlo todo a una recubridora de centrifugadora. Los pasos siguientes para el ensamblaje y la siembra de celdas del dispositivo se muestran en la Figura 1.
6. Utilice la pipeta Pasteur para transferir 1 ml de la solución de pegamento PDMS:toluene a un portaobjetos de vidrio de 50 mm x 75 mm en el mandril de la recubridora de espín. Gire durante 5 segundos a 100 rpm (aceleración 300 rpm/s) y 30 segundos a 2000 rpm (aceleración 300 rpm/s).
7. Coloque la diapositiva en una mesa y cúbrala con una cámara superior PDMS y una cámara inferior para que las caras de PDMS con entidades moldeadas en ella entren en contacto con la diapositiva y el pegamento se transfiera a la cara de PDMS, delineando el perímetro de todas las entidades.
8. Voltee la cámara superior PDMS a otra diapositiva con el recubrimiento de pegamento hacia arriba y coloque cuidadosamente la membrana a través del dispositivo entre las entradas y las salidas. Coloque la punta de 200 l en la solución de pegamento PDMS:toluene hasta que tenga algunos perversos en la punta. Toque la punta entre cada entrada y salida para colocar una pequeña gota cerca del borde de la membrana donde entra en contacto con el PDMS.
9. Retire la otra mitad del dispositivo y colóquelo con el recubrimiento de pegamento hacia abajo mientras alinea las entradas y salidas en las dos partes.
10. Colocar el dispositivo montado en un horno a 37 oC durante la noche para curar el pegamento. Transfiera a un frasco de campana de vacío con desecante y deje deshidratarse durante dos días. Este es un paso crucial para permitir que el tolueno se evapore y para mejorar la consistencia de la siembra del dispositivo mediante la regulación del vapor de agua absorbido en el aire de laboratorio.

3. Sembrar el microambiente cerebral en el dispositivo

1. Cultivo celular y reactivos: Antes de comenzar este protocolo, obtenga los siguientes reactivos y células. Cultivar todas las líneas celulares en una incubadora situada a 37oC en un 5% de CO_2.
   1. Mantener la línea humana de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) y MDA-MB-231-BR-GFP (obtenidas de Patricia Steeg, PhD) en DMEM con 4.5 g/L de glucosa, complementadas con 2 mM de L-glutamina, 10% FBS y 1x antibiótico-antimicicótico. Cree células fluorescentes MDA-MB-231-GFP transduciendo la célula MDA-MB-231 con lentivirus pLL-EV-GFP vectorial vacío. Ordene la población transducida de GFP⁺ utilizando la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) antes de la experimentación.
   2. Mantener las células endoteliales microvasculares del cerebro humano hCMEC/D3 en medio EGM-2. Crear células fluorescentes hCMEC/D3-DsRed transduciendo hCMEC/D3 con vector vacío pLL-3.7-dsRed lentivirus. Elimine todas las células no transducidas y no fluorescentes del cultivo utilizando FACS antes del uso experimental.
   3. Mantener astrocitos humanos normales (NHA) en DMEM complementados con 4.5 g/L de glucosa, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM de piruvato sódico, 1x suplemento de crecimiento N-2, y 1x antibiótico-antimicicótico. Inmortalizar los astrocitos transduciendo vector lentiviral pLOX-TERT-iresTK (Addgene 12245). Cree el vector utilizando el plásmido psPAX2 y el plásmido de sobre pMD2.G (Addgene 12260 y 12259).
2. Retire un dispositivo de la bBBN del desecador de vacío y colóquelo en una superficie de metal o papel (es decir, cinta) con las entradas hacia abajo y colóquelo en una cámara de plasma. Coloque también un portaobjetos de vidrio de 50 mm x 75 mm en la cámara de plasma. Tire de un vacío y luego tratar con plasma a 80 W durante 30 s.
3. Retire rápidamente el portaobjetos y el dispositivo de vidrio de la cámara de plasma y coloque el dispositivo con las entradas hacia arriba en la corredera de vidrio alineada con una guía(Archivo suplementario 2). Esto creará un vínculo permanente entre el PDMS y la diapositiva de vidrio y no se puede volver a colocar.
4. A continuación, corte las puntas de las puntas de la pipeta de 16, 200 l, 2 mm de la punta. Inserte las puntas de la pipeta en todas las entradas y salidas. El dispositivo se puede volver a colocar en el desecador de vacío en este punto si no está listo para sembrar las células.
5. Vuelva a colocar el dispositivo en la cámara de plasma y tratarlo con plasma durante 8 minutos a 200 W. Después de que el dispositivo se haya enfriado (5 min) del tratamiento de plasma colóquelo dentro de un recipiente secundario estéril, como una caja de punta de pipeta transparente. Realice el siguiente paso en un plazo de 15 minutos o la eficacia del tratamiento plasmático puede reducirse, lo que puede reducirse provocando obstrucciones.
6. Varios días antes del cultivo del experimento Petri platos de 1 x 10⁶ células endoteliales (hCMEC/D3-DsRed) y 1 x 10⁶ astrocitos (NHA). Mientras el dispositivo se somete al tratamiento plasmático de 8 min, prepare una solución de colágeno que consista en 0,5 ml de colágeno bovino PureCol tipo I de 3 mg/ml con 64 l de 0,8 M de NaHCO₃ y 20 ml de MEM de 10 mg de alta glucosa (250 mM). Suspenda 5,0 x 10⁵ células NHA en la solución de colágeno. Mantenga la solución sobre hielo mientras no esté en uso.
7. Transfiera 120 l de la solución de colágeno/astrocito/microglia al dispositivo a través de la punta de la pipeta para la cámara inferior(Figura 1 Flechas rojas). Deje que la solución se meca a través de la cámara en la punta de pipeta opuesta. Después de que se hayan llenado los cuatro canales del dispositivo, coloque el chip en la incubadora de_CO2 a 37oC y 5% de_CO2 durante 1 h o hasta que el colágeno se haya establecido.
8. Después de los conjuntos de colágeno, llene todas las puntas de pipeta que alimentan la cámara inferior con una mezcla de medios completos. Para las virutas que contienen células endoteliales y astrocitos, se utiliza una mezcla de 50:50 de medios endoteliales: astrocitos.
9. Recubrir la cámara superior con un 2% de factor de crecimiento reducido En Matrigel en medios endoteliales completos utilizando la punta de la pipeta de la cámara superior(Figura 1 Flechas azules)y colocar en la incubadora durante 1 hora.
10. Enjuague la cámara superior con la mezcla de medios indicada y alternar qué punta se siembra con células endoteliales(Figura 1 Flechas verdes). Suspenda 1 x 10⁶ células endoteliales en 1 ml de medios endoteliales y sembrar 30 l cada 15 minutos en puntas alternas de la cámara superior para una cobertura uniforme. Semilla de células endoteliales en cada punta de la cámara superior dos veces, para un total de 4 veces por cámara.
11. Después de la siembra final de células endoteliales, llenar todas las puntas con la mezcla de medios y colocar el dispositivo en la incubadora a 37 oC y 5% CO_2,cambiando los medios en ambas cámaras cada 12 h.

4. Monitorear la progresión de la formación de la capa endotelial

1. La cobertura completa del canal por la capa endotelial se observa después de 3 días. Utilice uno de los dos métodos para monitorear la cobertura de la barrera endotelial: Fluorescencia o TEER. la fluorescencia hCMEC/D3-DsRed y según % de cobertura a través del área del canal se pueden cuantificar utilizando ImageJ.
   1. Abra el archivo TIFF en ImageJ representativo de la barrera hCMEC/D3-DsRed. En el software ImageJ, haga clic en Archivo > Abrir para seleccionar el archivo.
   2. Combina todas las capas Z de la imagen usando la intensidad máxima siguiendo estos comandos y opciones clave: Imagen > Pilas > Proyecto Z > Todos los sectores Z, Intensidad máxima.
   3. Realice un umbral de color que sea el mismo en todos los chips microfluídicos evaluados con este método. Para el estudio presentado empleamos un umbral de 450. Utilice el menú de umbral en ImageJ en: Imagen > Ajustar > Umbral.
   4. Establezca las medidas que se registrarán utilizando los siguientes comandos y opciones: Analizar > Establecer medidas > Límite al umbral, Fracción de área.
   5. Seleccione una región representativa del canal microfluídico para medir dibujando un cuadro. La herramienta box se encuentra en el menú principal de ImageJ. Medir 3 réplicas técnicas colocadas al principio, medio y final de cada canal microfluídico utilizando el mismo tamaño de caja.
   6. Analice cada canal y registre la fracción de área, representando la cobertura endotelial %. Exporte estas mediciones como archivos de hoja de cálculo para trazar y visualizar los datos mediante los siguientes comandos: Analizar > Medir.
2. Como alternativa, utilice TEER basado en espectroscopia de impedancia para medir uniones estrechas endoteliales por área. La cuantificación de la barrera endotelial mediante TEER es un proxy para la integridad de la capa endotelial como barrera.
   1. Coloque dos electrodos en la entrada y salida de las cámaras superior e inferior.
   2. Cuantificar la impedancia de la monocapa endotelial como una combinación de resistencias, inductancias y capacitancias en el chip según un modelo propuesto por Srinivasan et al.^28,29.

5. Sembrar células cancerosas en el dispositivo

1. Después de que la capa endotelial haya madurado, las células cancerosas de las semillas se han convertido en el dispositivo. Preparar una solución de 1 ml de 1 x 10⁶ células cancerosas en medios celulares cancerosos completos.
2. Intercambie los medios en el chip para reponer los nutrientes del cultivo celular.
3. Siembra cada canal de la cámara superior con 30 ml de células cancerosas en suspensión y luego vuelve a colocar el dispositivo en la incubadora durante 15 minutos. Siempre sembrar las células cancerosas en el mismo lado de los cuatro canales de cámara superior dentro de un solo dispositivo.
4. Intercambie el dispositivo con nuevos medios y rellene las sugerencias cada 12 horas hasta que el dispositivo sea imán para obtener un comportamiento metastásico.

6. Imagen del microambiente tumoral por imágenes confocales

1. En el punto de tiempo experimental deseado (1, 2 o 9 días), utilice imágenes confocales para capturar una imagen 3D del canal. Realizamos este paso en una Nikon A1 utilizando los ajustes descritos aquí. Este paso es automatizado, y cada canal requiere 20-40 minutos de imagen dependiendo de cuántos canales fluorescentes se incluyen y la profundidad Z necesaria para cubrir las posiciones de todas las celdas.
2. Encienda el microscopio, abra el software y coloque la cubierta de la incubadora en el microscopio.
3. Ajuste el calentador de etapa del microscopio a 37 oC y CO₂ a 5% si está disponible.
4. Después de que la incubadora del microscopio se haya estabilizado, coloque el dispositivo en la etapa del microscopio utilizando el soporte de 50 mm x 75 mm.
5. Concéntrese en un lado del dispositivo (izquierda si se va a utilizar con el software de análisis proporcionado) con un objetivo de 10x y establezca la altura Z como cero. En la configuración de la pila z, incluya un rango de 100 m por encima y 200 m por debajo del plano de enfoque. A continuación, utilice el ajuste de costura para establecer el número de campos X e Y en 1 y 9 respectivamente con una superposición del 15%. Establezca el agujero en el mínimo recomendado y la altura de la capa z a 9 m. Ajuste la exposición de campo brillante para que la membrana porosa sea visible. Encienda los láseres de excitación para los canales dsRed (561 nm) y GFP (488 nm) y ajuste las potencias y cortes láser fluorescentes para que cada canal sea visible sin sobreexponer los píxeles.
6. Compruebe que todos los campos estén enfocados cuando se interpasen. Si es así, introduzca un nombre de archivo de salida (001.nd2) para la imagen e inicie el experimento para capturar automáticamente la imagen confocal 3D.

7. Mida el microambiente tumoral a través de una tomografía confocal

1. Utilice la tomografía confocal un enfoque para estimar un conjunto de métricas y mediciones que describan las células individuales y el microambiente tumoral dentro del dispositivo. El análisis tomográfico confocal (Figura 2) convierte una pila z confocal en una representación tridimensional de las celdas. Usando una secuencia de comandos pitón personalizada dentro del entorno de cuaderno/laboratorio de Jupyter, un plano se empareja con la capa de células que forman la barrera hematoencefálica como la membrana³⁰. Por último, realice mediciones fenotípicas de las poblaciones de células cancerosas(Tabla 1).
   1. Realice este análisis al final de un experimento o durante un curso de tiempo. Instale python y las bibliotecas adecuadas de acuerdo con la guía de software a la que se hace referencia, luego abra el software desde el símbolo del sistema de Windows ejecutando el comando "conda activate", seguido de "jupyter lab". El entorno de Jupyter se cargará en el explorador predeterminado.
   2. Desde el explorador de archivos Jupyter haga doble clic en el bloc de notas de Jupyter "contom.ipynb" para abrirlo. Ejecute la celda debajo del título Importar bibliotecas, clases/funciones personalizadas y configure el bloc de notas haciendo clic en la celda del bloc de notas y, a continuación, haciendo clic en el botón Reproducir. Todas las celdas de bloc de notas a continuación se ejecutan utilizando el mismo enfoque. Tenga en cuenta que aquí el bloc de notas "célula" se refiere a un bloque de código python dentro del cuaderno de Jupyter.
2. Prepare los datos. Este algoritmo utiliza el kit de herramientas de visualización (VTK) para manipular y mostrar los datos z-stack y tridimensionales¹⁷.
   1. Coloque el archivo . XLSX ("Experiment Tracker.xlsx") en la misma carpeta de Windows que el bloc de notas de Jupyter. El archivo realiza un seguimiento de los experimentos y las interfaces con el bloc de notas de Jupyter. Coloque el archivo ND2 de la sección 6 en una subcarpeta llamada "Experiment_XXX-Confocal" debajo de la ubicación del bloc de notas de Jupyter. Se pueden agregar carpetas de experimentos adicionales ajustando el "XXX" al ID numérico asignado a las nuevas carpetas.
   2. Etiquete la primera carpeta de experimento "Experiment_001" y el archivo ND2 "001.nd2". En primer lugar, convierta el archivo de imágenes ND2 en un archivo TIFF de varias imágenes cosido separado por canal de color. Para ello, ejecute la celda del bloc de notas debajo del título "Leer la pila z confocal en la memoria" con la función Save_tiff_from_ND2 () sin comentar³⁰. El archivo ND2 es un formato de imagen patentado de Nikon, por lo que es necesario convertirlo a un formato con el que el software de código abierto sea compatible.
      NOTA: El TIFF (Formato de archivo de imagen de etiqueta) se utiliza porque es omnipresente, compatible con 16 bits, se importa fácilmente en VTK, y varias imágenes se pueden almacenar en un solo archivo, lo que es adecuado para imágenes de pila z. La ejecución de la celda del bloc de notas leerá una imagen del archivo ND2, extraerá información del color y las posiciones XYZ y luego almacenará esa imagen en una matriz numpy de acuerdo con una estructura predeterminada. A continuación, guardará la matriz como un archivo TIFF utilizando el tifffile de la biblioteca python.
3. Convertir datos de imagen en modelo 3D
   1. Importe el archivo TIFF a VTK (vtkTIFFReader) utilizando una representación 3D para visualizar las celdas (Figura 2). Seleccione un umbral basado en el color de las celdas de la imagen. Para aclarar, el objeto VTK representa un bloque de píxeles (X, Y, Z) en el espacio (volumen) pero solo ciertos píxeles (verde o rojo) representan celdas, el resto son de fondo o ruido (negro).
   2. Por lo tanto, establecer un filtro de opacidad en el volumen que elimina el fondo confirme que lo que queda de fluorescencia son sólo las celdas. Haga esto usando la celda del cuaderno Jupyter titulada, Cambiar valores de opacidad para cada canal del microscopio ajustando las variables de valor Channel_alpha (es decir, GFP_alpha). Visualice el efecto mediante la celda del bloc de notas titulada Ver una representación 3D para comprobar que el umbral se ha establecido correctamente.
   3. Guarde los valores de opacidad en la hoja de cálculo para utilizarlos en el paso siguiente. Convierta los datos de volumen en objetos 3D individuales, cada uno de los cuales representa una celda de la imagen mediante una técnica denominada marching cubes³¹. Este algoritmo extrae una malla poligonal de una isosuperficie de campos escalares discretos tridimensionales de vóxeles.
   4. Utilice el valor de opacidad en el algoritmo de cubos de marcha para separar cada celda del fondo. Complete este paso para todas las celdas fluorescentes identificadas en cada canal del microscopio ejecutando Convertir imagen de voxel en una malla triangular y guárdelo como un archivo VTK en el portátil.
4. Montaje de un plano a la membrana
   1. Coloque un plano en la barrera endotelial localizando primero los centroides de la celda (celda del cuaderno: Analizar el canal RFP (barrera endotelial)). Recorra en iteración las mallas de lista del volumen y extraiga las regiones que no están conectadas mediante PolyDataConnectivityFilter de VTK. Calcule el centroide de cada malla y agregue la medida a una lista de centroides que filtran mallas demasiado grandes o demasiado pequeñas (<50, >1000000 voxels).
   2. Ajuste un plano a la lista de centroides para las celdas endoteliales utilizando una minimización del método de error (celda de libro de notas: Ajuste un plano a los centroides RFP (barrera endotelial)) ( Figura2, Figura 3)³². Inspeccione el ajuste del plano trazando el plano y los centroides y ajuste manualmente si es necesario (usando theta, beta y z) ejecutando la celda del portátil titulada Visualizar centroides RFP y ajuste de plano.
   3. Después de que el plano esté correctamente instalado, guarde la normal del plano en el archivo de seguimiento de experimentos . XLSX para uso futuro.
5. Analizar las características descriptivas de las células cancerosas individuales para los siguientes descriptores (Tabla 1).
   NOTA: Si el equipo que realiza el análisis está retrasado, es una opción realizar análisis de alto rendimiento a través de la informática de alto rendimiento. Este algoritmo es útil en portátiles estándar para el análisis de un pequeño número de celdas, sin embargo VTK no es adecuado para un gran número de objetos individuales (>1000). Por lo tanto, es opcional utilizar el algoritmo adaptado para funcionar en un clúster informático de alto rendimiento. Esto permite un análisis rápido de experimentos con muchas células(Figura 2). Todo el 7.5 se logra ejecutando las celdas del cuaderno titulada Analizar los canales restantes del microscopio para los descriptores fenotípicos y Leer en la Experiment_tracker información y analizar los canales que existen.
   1. Medir la extravasación de las células cancerosas: Después de caracterizar la capa endotelial con un plano, mida el volumen de cada célula cancerosa que ha migrado a través de la membrana. Recorte cada celda (booleana) para que la malla debajo de la membrana se mantenga y la porción por encima de la membrana se retire³³. A continuación, cierre la malla abierta (vtkFillHoles).
      1. Vuelva a calcular la normal y el nuevo centroide de la malla recortada. Mida el volumen y la posición de cada célula cancerosa recortada para su análisis. El volumen es equivalente al número de vóxeles que rellena la malla de cada celda. Calcular la distancia entre el plano endotelial y la posición de cada célula cancerosa.
   2. Medir el fenotipo celular: Calcular la morfología de cada célula cancerosa factorizando su forma, volumen y posición.
6. Valide las mediciones y guárdelas en una hoja de cálculo o trazado. Ejecute la celda del bloc de notas titulada Compruebe que los centroides se midieron con precisión y aparecerá un renderizado que mostrará los centroides identificados en la parte superior del volumen con imágenes por tipo de celda. Después de que todos los experimentos se realizan exportar el conjunto de datos completo como un único archivo de hoja de cálculo escribiendo los experimentos que se incluirán por ID en la celda del bloc de notas titulada Exportar los datos como un único archivo de datos.XLSX para los experimentos de variables que reemplazan los identificadores de experimento dados. Si verifica el conjunto de datos completado, establézcalo utilizando la celda del bloc de notas titulada Trazado de tiras extravasadas Distancia. El trazado aparecerá en el entorno del bloc de notas y se guardará en el archivo.

8. Analizar las características relacionadas utilizando Inteligencia Artificial

NOTA: Identificar características fenotípicas metastásicas utilizando algoritmos de inteligencia artificial.

1. Realice la clasificación binaria utilizando Naranja según el esquema que se muestra en la Figura 5 y el Archivo Suplementario 3. Inicie Orange desde un segundo símbolo del sistema de Windows escribiendo "conda activate" seguido de "python -m Orange.canvas" y haga clic en Nuevo en el símbolo del sistema. Orange es un software basado en arrastrar y soltar, así que organice las funciones arrastrando cada elemento desde el menú de la izquierda hasta el lienzo para que coincida con el archivo suplementario 3. Una vez completado, haga doble clic en el icono Archivo y seleccione el archivo .XLSX datos.
2. Filtre los datos para eliminar las mediciones incorrectas, definidas como aquellas que fallaron en una operación booleana o dando valores de variables paramétricas fuera de los límites conocidos mediante el icono "Seleccionar filas". Haga doble clic en el icono y establezca las condiciones que corresponden al filtro como "La esfericidad está entre 0 y 1". Cree condiciones para 8.2.1, 8.2.2 y 8.2.3.
   1. Filtrar medidas extravastadas a distancia para que van desde -100-200 m.
   2. Filtrar las mediciones de esfericidad de la forma de la célula para que osciles entre 0-1.
   3. Filtre las mediciones del volumen de las células cancerosas para que osciles entre 0 y 2000 vóxeles.
   4. Utilice todas las variables paramétricas (Tabla 1) para clasificar MDA-MB-231-BR-GFP metastásico cerebral y MDA-MB-231-GFP no cerebral. Haga doble clic en el icono Seleccionar columnas del lienzo. Con el botón > para mover Variables disponibles a Entidades, Variables de destinoo Atributos meta. La única variable que debe ser una variable de destino es una etiqueta metastásica que define si las celdas del conjunto de datos se consideran metastásicas (1) o no (0). Las variables de experimento se pueden colocar en la sección Atributos de meta.
3. Muestree los datos en un entrenamiento (80%) y conjunto de pruebas (20%). Haga doble clic en el icono Muestreador de datos y seleccione un Tipo de muestreo de Proporción fija de datos: establezca en 80% y seleccione las casillas de verificación Replicables y estratificar. Estratificar y validar el conjunto de entrenamiento utilizando 10 pliegues contra cada modelo/clasificador. Haga doble clic en Prueba y puntuación y seleccione Validación cruzada con número de pliegues: establecido en 10 y Activado marcado. Establezca la clase de destino en 1.
4. En este método, utilice redes neuronales y algoritmos de aprendizaje de bosque aleatorio, ya que son robustos para los datos. En el icono Bosque aleatorio, elija el número de árboles que será 50 y no seleccione ninguna otra opción. Dentro del icono de red neuronal elija Neurons per hidden layer: 100, Activation: ReLu, Solver: Adam, Alpha: 0.0001, y Max Iterations: 200. Sin embargo, estos ajustes variarán significativamente según el estudio y deben entenderse bien antes de la aplicación.
5. Después de configurar el lienzo, haga doble clic en cada icono de Archivo a Datos de ejemplo y pulse Aplicar o Enviar datos. Haga doble clic en Test & Score y los datos de entrenamiento comenzarán a utilizarse para desarrollar un modelo utilizando los algoritmos. Después de entrenar el modelo de aprendizaje automático, vuelva a abrir Test & Score y seleccione Test on Test Data y cierre la ventana emergente para puntuar el rendimiento del modelo clasificando las celdas en el chip de acuerdo con la probabilidad de que sean metastásicas cerebrales de 0 a 1.
6. Guarde el rendimiento del modelo de aprendizaje automático en un archivo(Tabla 2). Incluya el área debajo de la curva (AUC) del ROC, la precisión y la puntuación F1. Guarde un segundo archivo que contenga los índices metastásicos individuales y las probabilidades de clasificación. Haga doble clic en el icono Guardar y haga clic en Guardar como para escribir para archivar las probabilidades de clasificación. Del mismo modo, la curva ROC se puede ver haciendo doble clic en el icono Análisis ROC y el rendimiento del modelo se puede calcular haciendo doble clic en el icono Matriz de confusión.

Resultados

Usando esta técnica, analizamos tipos de células etiquetadas con diferentes proteínas fluorescentes o tintes. Demostramos el uso de este enfoque con un chip de ámBBN formulado con hCMEC/D3-DsRed y astrocitos no fluorescentes. Las células endoteliales microvasculares cerebrales se sembraron sobre una membrana porosa (poros grabados de vía de 5 m) y se colocaron en una incubadora³⁴ a 37 oC por debajo del 5% de CO₂. Después de tres días la confluencia de la capa endotelial se confi...

Discusión

Hemos desarrollado y presentado un nuevo método que adapta las herramientas que a menudo se utilizan en los análisis de imágenes clínicas para la medición de la extravasación y la migración de las células cancerosas a través de una barrera endotelial en el tejido cerebral. Planteamos que este enfoque puede ser útil para mediciones in vivo e in vitro; hemos demostrado su uso en un sistema microfluídico 3D recapitulando la vasculatura cerebral. Las mediciones de células cancerosas, incluida la distancia extrava...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger	Integra LifeSciences Corporation	33-31A-P/25
10x MEM	Thermo Fisher Scientific	11430030
150 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg	Thermo Fisher Scientific	14190144
200uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-411
4 inch silicon wafer	University Wafer	452
48 mm wide packing tape	Fisher Scientific	19-072-097
50 x 75 mm glass slide	Fisher Scientific	12-550C
A1 confocal microscope	Nikon
acetone	Fisher Scientific	A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)	Gibco	15240062
box cutter blade	Fisher Scientific	NC1721575
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose	Thermo Fisher Scientific	11960-044
double sided tape	Fisher Scientific	NC0879005
EGM-2	Lonza	CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated	Corning	MT35011CV
Fiji software	ImageJ
glass vial	Fisher Scientific	03-341-25D
glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
hCMEC/D3	EMD Millipore	SCC066
Jupyter notebook	Anaconda
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol red	Corning	CB-40230A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP	Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
normal human astrocytes (NHA)	Lonza	CC-2565
Orange software	University of Ljubljana
Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-711-9AM
Photolithography masks	Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed	University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP	University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK	Addgene	12245
pMD2.G	Addgene	12259
polycarbonate membrane, 5um pore size	Millipore	TMTP04700
psPAX2	Addgene	12260
PureCol, 3 mg/mL	Advanced Biomatrix	5005	Type I bovine collagen
sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	25080094
sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
Solo cup	Fisher Scientific	NC1416545
SU-8 2075	MicroChem Corporation	Y111074 0500L1GL
SU8 developer	MicroChem Corporation	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184	Ellsworth Adhesive Company	NC0162601
Toluene	Sigma-Aldrich	179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane	Sigma-Aldrich	448931-10G