JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).

Abstract

גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאם לסוג הסרטן. כדי להפחית את נטל הגידול גרורתי במוח, פערים בידע בסיסי ותרגום צריך להיות מטופל. האתגרים העיקריים כוללים בעיה של מודלים פרה-לקלינליים לשחזור וכלים קשורים. מודלים תלת מימדיים של גרורות במוח יכולים להניב את הנתונים המולקולריים והפנוטיפיים הרלוונטיים המשמשים לטיפול בצרכים אלה בשילוב עם כלי ניתוח ייעודיים. יתר על כן, בהשוואה למודלים מורין, מודלים organ-on-a-שבב של תאים סרטניים המטופל חוצה את מחסום המוח בדם לתוך microenvironment המוח ליצור תוצאות במהירות, הם מתורגמים יותר עם שיטות כמותיות, ולכן ניתן לתפוקה גבוהה. כאן אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת מוח מיקרו-נוזלית תלת-מית-ייחודית רומן (μmBBN), שבה ניתן לתמרץ אלמנטים מרובים של הנישה לתקופה ממושכת (מספר ימים), התמונה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופית קונפוקסלית, והתמונות השיחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה חדשנית וקונספוקלית; כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול (TME) באופן חוזר וכמותי. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת רכיבים תאיים והומוריסטיים TME, באמצעות פלטפורמה זו. יתר על כן, אנו מראים כיצד בינה מלאכותית (AI) משמשת לזיהוי ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאל גרורתי במוח. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, היעילות של אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.

Introduction

גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאםלסוג סרטן 1,,2. שאלה עיקרית המתעוררת בעת לימוד גרורות סרטן היא כיצד שיבוטים משנה לנדוד מהסביבה ההומוריסטית של מחזור הדםלתוך איבר כגוןהמוח 3,4. שאלה זו הובילה לווריאציות רבות של הגירה, פלישה ואסהרנות. כל השיטות הללו חולקות את השלב הקריטי של ספירה או מדידה של מאפיינים של תאים הלעבור ממיקום אחד למתו בתגובה לגירוי. רוב הנדידה זמינה משמשים לחקר הגירה דו מימדית (2D) של תאים סרטניים. אלה התרעו שפע של ידע; עם זאת, הם אינם לסיכום האופי התלת מימדי של מערכת vivo כי שיטות אחרות יכולות לספק5. לכן, יש צורך ללמוד את הגידול מיקרו-סביבה (TME) במערכות תלת מימדיות (3D), אבל גישות הניתוח זמין עבור מבנים 3D מוגבלים ולעתים קרובות לא עקבי.

אחד הכלים התת-מימד הפופולריים ביותר הוא תא ביידן המורכב מממברנה התלויה בתחתית באר, המפרידה בין שני אזורים נפרדים. ביידן הציג את ההסתה כדי ללמוד leukocyte chemotaxis4. האזורים הנמוכים עשויים להיות מגוונים לפי כימיה אואמצעים אחרים 6,7 כדי לגרום לתאים באזור העליון לעבור לאזור התחתון. הגישה הנפוצה ביותר לכמת את מספר התאים שהועברו היא לשחרר את התאים מתחתית הממברנה באמצעות פתרון מאגר, לכמת אותם, ולאחר מכן לספור אותם בהתבסס על כמות תוכן ה-DNAבפתרון 7. גישה עקיפה זו נוטה לשגיאה מפעיל בשל שונות טכניקה וההליך הורס מידע על פנוטיפ הסרטן ואת המיקרו-סביבה. וריאציות של ההסדה התא Boyden כרוכות קיבעון של תאים נודדים שנותרו על הממברנה, אבל רק מספק ספירה של תאים כי הם כבר לא קיימא להמשך מחקר6,,8,9.

בשל מגבלות של תא Boyden וצמיחת חידושים בקהילה microfluidic, שבבי אסיי הגירה פותחו אשר לבחון את תנועת התאים בתגובה לגירוי בכיוון אחד ולאשלוש 10,11,12. העברה זו מקלה על שליטה בגורמים כגון זרימה אוהפרדת תאים בודדים 13,14 המאפשרים פרשנות טובה יותר של התוצאות; עם זאת, פורמט הדו-מיוד שלהם מאבד באופן בלתי נמנע מידע דינמי. מחקרים אחרונים התמקדו בהתפרזרות (כלומר, התנועה של תאים ממחזור לתוך רקמה, כגון מחסום מוח הדם) בסביבה 3D14,15. המרחק ההתרבזרות לתוך רקמה והתנהגות בדיקה המתרחשת במחסום התא / קרום הוא מעודן יותר מאשר מדידות שנאספו באמצעות תא Boyden או מכשיר הגירה מיקרופלויד 2D16. לפיכך, התקנים המאפשרים הדמיה וניתוח מתאימים של 3D מתפשטים הם קריטיים כדי ללכוד מדידות מתוחכמות אלה, אך חסרים בספרות.

ללא תלות בהדמיית הגירה, פותחו טכניקות הדמיה חזקות להדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה שמצליחות לזהות ולחזר במדויק רקמות בחלל תלת-ממדי17,,18. טכניקות אלה לרכוש תמונות z-stacks וחלקים קטע של התמונה בהתבסס על המאפיינים של הרקמה ולאחר מכן להמיר את התמונות מחולקות לתוך רשתות תלתממדיות 19,20,21. זה מאפשר לרופאים לדמיין באיברים, עצמות, וכלי דם בודדים 3D כדי לסייע בתכנון כירורגי או סיוע באבחון של סרטן או מחלותלב 22,23. כאן, נראה כי גישות אלה ניתן להתאים לשימוש על דגימות מיקרוסקופיות והתקני אקסטרפולציה 3D.

בסוף זה פיתחנו את טכניקת טומוגרפיה קונפוקלית חדשנית, המוצגת במסמך זה, אשר מאפשרת גמישות ללמוד את ההתופפות של תאים סרטניים על פני קרום על ידי התאמת כלי טומוגרפיה קיימים. גישה זו מאפשרת לחקור את מגוון רחב של התנהגויות תאים סרטניים כפי שהם אינטראקציה עם מחסום תאי, כגון שכבת תא אנדותל. תאים סרטניים להפגין התנהגויות לחקר; חלקם עלולים לפלוש אך להישאר קרובים לממברנה, בעוד שאחרים חוצים את המחסום בקלות. טכניקה זו מסוגלת להניב מידע על הפנוטיפ של התא בכל הממדים24. שימוש בגישה זו כדי ללמוד את TME הוא גם זול יחסית, קל לפרש, ו לשכפל, בהשוואה מורכב יותר במודלים מורין vivo. המתודולוגיה המוצגת צריכה לספק בסיס חזק למחקר של סוגים רבים של גידולים וסביבות מיקרו על ידי התאמת אזור סטרומה.

אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת דם מיקרו-נוזלית תלת-מיתד (μmBBN)(איור 1)שבה אלמנטים קריטיים של המחסום והנישה (תאי אנדותל מיקווסקול במוח ואסטרוציטים) יכולים להיות תרבותיים לתקופה ממושכת (כ-9 ימים), פלואורסצנטית התמונה על ידי מיקרוסקופית confocal, והתמונות ששוחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה קונקודלית שלנו (איור 2); כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול באופן חוזר וכמותי. ממשק מחסום הדם עם נישת המוח מורכב תאי אנדותל microvascular במוח כי הם מחוזקים על ידי קרום מרתף, רגלי אסטרוציטים, pericytes25. התמקדנו באופן סלקטיבי ברכיבים אסטרוציט אנדותל בהתחשב בחשיבותם בהקמה ורגולציה של מחסום מוח הדם. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת הגידול מיקרו סביבה רכיבים תאיים והומוריסטיים, באמצעות פלטפורמה זו. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בלמידת מכונה כדי לזהות את ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאלגרורתי במוח 24. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.

Protocol

1. להכין את תבנית נישת מחסום הדם

הערה: המכשיר culturing המשמש בפלטפורמה זו הוא פיגומים מבוססי PDMS כי אנו בונים נישה מחסום דם סלולרי על. הוא עשוי משני חלקים המופרדים על ידי קרום נקבובי. כדי להכין את נישת מחסום הדם שתי תבניות SU-8 שנעשו באמצעות פוטוליתוגרפיהנחוצים 26,27. הפרוטוקול יתואר עבור עובש עבה 100 μm הראשון ולאחר מכן הערות ינתן עבור עובש 200 μm עבה.

  1. כדי להכין את התבנית, נקה וופל סיליקון "4 באמצעות אצטון עם בקבוק לסחוט ולאחר מכן לייבש אותו עם אקדח חנקן.
    1. אופים את וופל הסיליקון על פלטה חמה במשך 10 דקות ב-200 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל הממסים הזירית.
    2. בתורו מרכז וופל הסיליקון על צ'אק של מעיל ספין ולחלק 1 מ"ל של SU8-2075 עבור עובש העליון. ספין עבור 5 s ב 500 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לפזר את photoresist ולאחר מכן 30 s ב 2200 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לקבל ציפוי SU-8 עבה 100 μm. ייתכן שיהיה צורך במיטוב כדי להשיג את העובי שצוין.
  2. אופים את הוופל על פלטה ב-65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ומיד ב-98 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
  3. מניחים את הוופל לתוך מנורת פוטוליתוגרפיה וממקמים את המסכה הממרכזת בוופל בהתאם לנוהלי התקן. לחשוף את הוופלים מצופה SU-8 עם זוהר של 230 mJ / ס"מ2 של UVB (360 ננ"± 10 ננ"מ). ניתן לבצע ניסוי מטריצת חשיפה כדי לקבוע את מינון אופטימום. עיצובי מסכות זמינים בקובץ משלים 1.
  4. בצעו אפייה לאחר החשיפה ב-65°C במשך 2 דקות ולאחר מכן מיד ב-98°C למשך 10 דקות לשיפור ההדבקה. מצננים את הוופל ל-50 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את ההתנגדות הלא חשופה באמצעות SU-8 למפתח תמונות. לשטוף את הוופל במפתח במשך 5 דקות באמבטיה ולאחר מכן להשתמש בבקבוק ספריי מלא SU-8 מפתח במכסה מנוע כימי כדי להתסיס ולהסיר SU-8 לא מאובטח הנותרים. מיקרוסקופ 4x יכול לשמש כדי לצפות אם כל SU-8 לא מאובטח הוסר. קו לבן בשולי תכונות הפוטורסיסט מציין ש- SU-8 לא הוסר במלואו.
  6. מבצעים אפייה קשה אחרונה בתנור ב-110 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
  7. בצע את אותו הליך עבור עובש עבה 200 μm באמצעות SU-8 2075 אבל להתאים את הפרוטוקול להודעה הבאה:
    1. הגדרות מעיל ספין: ספין עבור 5 s ב 500 סל"ד (האצה 300 סל"ד / s) כדי לפזר את photoresist ולאחר מכן 30 s ב 1300 סל"ד (האצה 300 סל"ד / קצת) כדי לקבל ציפוי עבה 200 μm.
    2. אופים ב-65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואז ב-98 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
    3. זמן חשיפה של 340 mJ/cm2.
    4. לאחר האפייה בחשיפה: 2 דקות ב-65°C, ולאחר מכן 98°C במשך 15 דקות.
  8. לבסוף, silanize כל וופל על ידי הצבתם בתא ואקום בתוך מכסה מנוע כימי עם מיכל פלסטיק שבו 3 טיפות (~ 150 μL) של פתרון silanizing (Trichloro perfluoro אוקטיל סילאן) הונחו. משוך ואקום ועזוב למשך הלילה כדי לאפשר לאדים לכסות את הוופל. שלב זה מפחית את ההדבקה בין SU-8 ו- PDMS, הגדלת חיי התבנית.
    התראה: טריכלורו perfluoroctyl סילאן תמיד צריך להיות מטופל ב מכסה המנוע אדים והתרחק ממקורות מים.
  9. מניחים תבניות וופל בודדות ב-150 מ"מ של צמי פטרי באמצעות שתי רצועות של סרט הדבקה דו-צדדי. ודא הוופלים שטוחים. חלופה אחרת היא לפברק תבנית אלומיניום שבה ניתן ממוקם הוופל. מכיוון שתבנית האלומיניום מוקפת, היא תייצר יציקות בעובי אחיד, בעוד ששיטת צלחת פטרי רגישה להטיה של פני השטח. השטוחות המשופרת של ה-PDMS מפחיתה את זמן ההדמיה הנואמת במורד הזרם.

2. טופס ולהרכיב את מחסום דם PDMS (BBB) התקן

  1. מערבבים 75 גרם PDMS ביחס של 1:10 (Crosslinker:Base) לפי משקל בספל פלסטיק.
  2. יוצקים את PDMS על התבניות (1 מ"מ עבה עבור עובש 200 μm עבה 4 מ"מ עבור עובש 100 μm עבה) דגה בממזר ואקום במשך שעה אחת או עד כל הבועות הוסרו. מניחים בתנור 65 מעלות למשך הלילה. ניתן לכוונן את עובי 1 מ"מ בהתבסס על מרחק העבודה של המטרה 10x במיקרוסקופ confocal.
  3. לאחר PDMS נרפא להשתמש להב לחתוך בעדינות נגד הוופל דרך PDMS סביב הקצוות. מקלפים את ה-PDMS והשתמשו בלהב כדי לחתוך לאורך המדריכים המלבניים וניקוב ביופסיה של 1.5 מ"מ כדי לפתוח את המפרכים והשקעים בהתקן. כסה את חלקי התקן PDMS עם סרט אריזה ברוחב 48 מ"מ כדי לשמור אותו נקי מאבק ופסולת.
  4. לאחר להשתמש מספריים לנתח לחתוך מלבן 5 מ"מ x 50 מ"מ של קרום פוליקרבונט עם 5 μm נקבוביות ולאחסן אותו בתוך צלחת פטרי לשימוש מאוחר יותר.
  5. לאסוף את הדברים הבאים: 200 μL פיפטה טיפ, 2 מ"ל של 1:10 PDMS מעורבב עם טולואן ביחס של 2:3 על ידי משקל בקבוקון זכוכית, פיפטה פסטר עם נורה לסחוט, PDMS מוכן חלקים על העליון והתחתון, קרום, שלוש 50 מ"מ x 75 מ"מ שקופיות זכוכית ולהעביר את כל זה למעיל מסתובב. השלבים הבאים להרכבה ותא זריעת תאים של ההתקן מתוארים באות 1.
  6. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר 1 מ"ל של PDMS:toluene פתרון דבק לתוך שקופית זכוכית 50 מ"מ x 75 מ"מ על צ'אק של מעיל ספין. סיבוב למשך 5 שניות ב-100 סל"ד (האצה של 300 סל"ד לשנייה) ו-30 שניות ב-2000 סל"ד (האצה של 300 סל"ד לשנייה).
  7. מקם את השקופית על שולחן וכסה אותה בתא PDMS עליון אחד ותא אחד תחתון, כך שה- PDMS פונה עם תכונות מעוצבות לתוכה ליצור קשר עם השקופית והדבק מועבר לפני PDMS, ומתאר את ההיקף של כל התכונות.
  8. הפוך את התא העליון של PDMS לשקופית אחרת עם ציפוי הדבק כלפי למעלה והצב בזהירות את הממברנה על-פני ההתקן בין המבסוף והשקעים. מניחים את קצה 200 μL בתמיסת דבק PDMS:toluene עד שיש לו מרושע כמה לתוך הקצה. גע בקצה שבין כל גורם נכנס לשקע כדי למקם טיפה קטנה ליד קצה הממברנה, שם הוא יוצר קשר עם ה-PDMS.
  9. הסר את החצי השני של ההתקן והניח אותו עם ציפוי הדבק כלפי מטה תוך יישור המברים והשקעים בשני החלקים.
  10. מניחים את ההתקן המורכב בתנור ב-37°C למשך הלילה כדי לרפא את הדבק. מעבירים לצנצנת פעמון ואקום עם מייבש ותנו להתייבש למשך יומיים. זהו צעד מכריע כדי לאפשר Toluene להתאדות ולשפר את העקביות של זריעת המכשיר על ידי ויסות אדי מים נספג באוויר המעבדה.

3. זרעו את המיקרו-סביבה המוחית לתוך המכשיר

  1. תרבות תאים ותרבית תאים: לפני תחילת פרוטוקול זה, השג את הריגנטים והתאים הבאים. לטפח את כל קווי התא באינקובטור להגדיר ב 37 °C ב 5% CO2.
    1. לשמור על קו תאי סרטן השד המשולש שלילי אדם MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) ו MDA-MB-231-BR-GFP תאים (שהושגו פטרישיה סטיג, PhD) ב DMEM עם 4.5 גרם/ L גלוקוז, בתוספת 2 mM L-גלוטמין, 10% FBS ו 1x אנטיביוטי-אנטיקומיטי. צור תאי פלורסנט MDA-MB-231-GFP על-ידי התפתל תא MDA-MB-231 עם נגיף pLL-EV-GFP ריק. מיין את אוכלוסיית GFP+ שהופעלה באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנה (FACS) לפני הניסויים.
    2. לשמור על תאי אנדותל מיגרו-וסקולריים אנושיים hCMEC/D3 במדיום EGM-2. צור תאי פלורסנט hCMEC/D3-DsRed על-ידי התרעה של hCMEC/D3 עם נגיף לנטי-וירוס וקטורי ריק של 3.7-dsRed. הסר את כל התאים שאינם מושרה, שאינם פלורסנט מהתרבות באמצעות FACS לפני השימוש הניסיוני.
    3. לשמור על אסטרוציטים אנושיים נורמליים (NHA) ב DMEM בתוספת 4.5 g/L גלוקוז, 10% FBS, 2 mM גלוטמקס, 1 mM נתרן pyruvate, 1x N-2 תוספת צמיחה, ו 1x אנטיביוטי אנטיביוטי אנטימיקוטי. להנציח את האסטרוציטים על ידי מתן pLOX-TERT-iresTK וקטור lentiviral (Addgene 12245). צור את הווקטור באמצעות psPAX2 פלסמיד ומעטפה פלסמיד pMD2.G (Addgene 12260 ו- 12259).
  2. הסר התקן μmBBN מ מייבש הוואקום והניח על משטח מתכת או נייר (כלומר, סרט הדבקה) כאשר המתפרכים פונים כלפי מטה והכניסו אותו לתא פלזמה. כמו כן, מניחים מגלשת זכוכית של 50 מ"מ x 75 מ"מ לתא הפלזמה. משוך ואקום ולאחר מכן לטפל עם פלזמה ב 80 W עבור 30 s.
  3. הסר במהירות את מגלשת הזכוכית והמכשיר מתא הפלזמה והנח את ההתקן עם ההתכונות כלפי למעלה אל מגלשת הזכוכית המיושרת באמצעותמדריך (קובץ משלים 2). פעולה זו תיצור קשר קבוע בין PDMS ושקופית זכוכית ולא ניתן למקם מחדש.
  4. הבא לחתוך את הטיפים את 16, 200 μL פיפטה טיפים, 2 מ"מ מהקצה. הכנס את קצות הפיפטה לכל הכניסות והשקעים. המכשיר יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מימש ואקום בשלב זה אם לא מוכן לזרוע את התאים.
  5. מניחים את ההתקן בחזרה בתא הפלזמה ולטפל עם פלזמה במשך 8 דקות ב 200 W. לאחר שההתקן התקרר (5 דקות) כתוצאה מתקן הטיפול בפלזמה, מקם אותו בתוך מיכל משני סטרילי, כמו תיבת קצה שקופה של פיפטה. לבצע את השלב הבא בתוך ~ 15 דקות או את היעילות של טיפול פלזמה עשוי להיות מופחת המוביל סתימה.
  6. כמה ימים לפני תרבות הניסוי פטרי מנות של 1 x 106 תאים אנדותל (hCMEC / D3-DsRed) ו 1 x 106 אסטרוקיטים (NHA). בעוד המכשיר עובר טיפול פלזמה 8 דקות, להכין פתרון קולגן המורכב 0.5 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל PureCol סוג אני קולגן בשר עם 64 μL של 0.8 M NaHCO3 ו 20 μL של 10x גבוה גלוקוז (250 mM) MEM. להשעות 5.0 x10 5 תאי NHA בתמיסת קולגן. שמור על הפתרון על קרח בזמן שהוא לא בשימוש.
  7. להעביר 120 μL של פתרון קולגן / astrocyte / microglia לתוך המכשיר דרך קצה פיפטה עבור התא התחתון (איור 1 חצים אדומים). אפשר לפתרון לפתיל על פני התא לתוך קצה פיפטה הנגדי. לאחר שכל ארבעת הערוצים של המכשיר התמלאו, הנח את השבב באינקובטור CO2 ב-37°C ו-5% CO2 לשעה אחת או עד שהכולגן נקבע.
  8. לאחר ערכות הקולגן, מלאו את כל קצות הפיפטה המזינה את התא התחתון בתערובת של מדיה שלמה. עבור שבבים המכילים תאים אנדותל ואסטרוציטים, נעשה שימוש בתמהיל של 50:50 של מדיה אנדותל:אסטרוציט.
  9. ציפוי התא העליון עם 2% גורם גדילה מופחת Matrigel במדיה אנדותל מלאה באמצעות קצה פיפטה התא העליון (איור 1 חצים כחולים) והמקום באינקובטור במשך 1 שעות.
  10. לשטוף את התא העליון עם תערובת מדיה שצוין לסירוגין איזה קצה הוא זרע עם תאים אנדותל (איור 1 חצים ירוקים). להשעות 1 x 106 תאים אנדותל ב 1 מ"ל של מדיה אנדותל זרע 30 μL כל 15 דקות לתוך טיפים תא עליון לסירוגין לכיסוי זוגי. תאי אנדותל זרע לתוך כל קצה תא עליון פעמיים, עבור סך של 4 פעמים לכל תא.
  11. לאחר זריעתם הסופית של תאי אנדותל, מלאו את כל הטיפים בתערובת המדיה והניחתו את ההתקן באינקובטור ב-37°C ו-5% CO 2 ,משנים את המדיהבשני התאים כל 12 שעות.

4. לפקח על ההתקדמות של היווצרות שכבת אנדותל

  1. כיסוי מלא של הערוץ על ידי שכבת אנדותל נצפתה לאחר 3 ימים. השתמש באחת משתי שיטות כדי לפקח על הכיסוי של מחסום ה אנדותל: פלואורסץ או TEER. ניתן לכמת את הפלואורסצנטיות hCMEC/D3-DsRed ובהתאם לכיסוי % על-פני אזור הערוץ באמצעות ImageJ.
    1. פתח את קובץ TIFF בנציג ImageJ של מחסום hCMEC/D3-DsRed. בתוכנה ImageJ, לחץ על קובץ > פתח כדי לבחור את הקובץ.
    2. מזג את כל שכבות ה- Z של התמונה בעוצמה המרבית מתוך פקודות ואפשרויות מפתח אלה: תמונה > ערימות > פרוייקט Z > כל פרוסות Z, עוצמה מרבית.
    3. בצע סף צבע זהה בכל השבבים המיקרו-נוזלים המוערכים בשיטה זו. לצורך המחקר שהוצג העסיקנו סף של 450. השתמש בתפריט הסף ב- ImageJ ב: תמונה > כוונן > סף.
    4. הגדר את המידות שתיוקלטו באמצעות הפקודות והאפשרויות הבאות: ניתוח > הגדרת מידות > הגבל לסף, שבר אזור.
    5. בחר אזור מייצג של הערוץ המיקרו-נוזלים שיש למדוד על-ידי ציור תיבה. כלי התיבה ממוקם בתפריט הראשי של ImageJ. מדוד 3 שכפולים טכניים ממוקמים בהתחלה, באמצע ובסוף של כל ערוץ מיקרו-נוזלים באמצעות אותו גודל תיבה.
    6. נתח כל ערוץ והקליט את שבר האזור, המייצג את הכיסוי הנטוהל %. יצא מדידות אלה כקבצי גיליון אלקטרוני כדי להתוות ולהמחות את הנתונים באופן חזותי באמצעות הפקודות הבאות: נתח > מדידת.
  2. כחלופה, השתמש TEER מבוסס ספקטרוסקופיה מכשול כדי למדוד צמתים הדוקים אנדותל לכל אזור. כימות מחסום אנדותל באמצעות TEER היא פרוקסי לשלמות שכבת ה אנדותל כמחסום.
    1. מקם שתי אלקטרודות בהכנסה ובשקע של התאים העליונים והתונים.
    2. לכמת את המכשול של מונולייטר אנדותל כשילוב של ההתנגדות, השראות, קיבוליות שבב על פי מודל המוצע על ידי Srinivasan ואח '.28,29.

5. זרע תאים סרטניים לתוך המכשיר

  1. לאחר שכבת אנדותל התבגרה, זרע תאים סרטניים לתוך המכשיר. להכין פתרון 1 מ"ל של 1 x 106 תאים סרטניים במדיה תא סרטני מלא.
  2. להחליף את התקשורת בשבב כדי לחדש את חומרים מזינים של תרבות התא.
  3. זרע כל ערוץ תא עליון עם 30 μL של תאים סרטניים בהשעיה ולאחר מכן למקם את המכשיר בחזרה באינקובטור במשך 15 דקות. תמיד לזרוע את התאים הסרטניים באותו הצד של כל ארבעת הערוצים התא העליון בתוך מכשיר יחיד.
  4. החליף את ההתקן במדיה חדשה ואת מילוי הטיפים כל 12 שעות עד להתקן בתמונה עבור התנהגות גרורתית.

6. תמונה מיקרו הסביבה הגידול על ידי הדמיה confocal

  1. בנקודת הזמן הניסיונית הרצויה (1, 2 או 9 ימים), השתמש בהדמיה קונפוקל כדי ללכוד תמונה תלת-ממדית של הערוץ. אנו מבצעים שלב זה ב- Nikon A1 באמצעות ההגדרות המתוארות כאן. שלב זה הוא אוטומטי, וכל ערוץ דורש 20-40 דקות כדי לתמונה בהתאם לכמה ערוצי פלורסנט כלולים ועומק Z הדרוש כדי לכסות את העמדות של כל התאים.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, פתח את התוכנה והניח את כיסוי האינקובטור על המיקרוסקופ.
  3. הגדר את דוד שלב מיקרוסקופ ל 37 °C ו CO2 עד 5% אם זמין.
  4. לאחר חממת המיקרוסקופ התייצבה, למקם את המכשיר לתוך שלב מיקרוסקופ באמצעות 50 מ"מ x 75 מ"מ הר.
  5. התמקד בצד אחד של ההתקן (משמאל אם יש להשתמש בו עם תוכנת הניתוח שסופקה) עם יעד של 10x והגדר את גובה Z כאפס. תחת הגדרות z-stack, כלול טווח של 100 μm מעל ו 200 μm מתחת מישור המוקד. לאחר מכן השתמש בהגדרת התפירה כדי להגדיר את מספר שדות X ו- Y ל- 1 ו- 9 בהתאמה עם חפיפה של 15%. הגדר את חור הסיכה למינימום המומלץ שלו ואת גובה שכבת ה- z ל- 9 μm. כוונן את החשיפה לשדה הבהיר כך שה קרום הנקבובי יהיה גלוי. הפעל את לייזרי העירור עבור dsRed (561 מילימ') ו GFP (488 מילימ') ערוצים ולהתאים את כוחות לייזר פלורסנט חותך כך כל ערוץ גלוי מבלי להגזים את הפיקסלים.
  6. ודא שכל השדות נמצאים במוקד בעת מעבר. אם כן, הזן שם קובץ פלט (001.nd2) עבור התמונה והתחיל בניסוי כדי ללכוד באופן אוטומטי את התמונה ה-3D confocal.

7. למדוד את הגידול מיקרו הסביבה באמצעות טומוגרפיה confocal

  1. השתמש טומוגרפיה confocal גישה כדי להעריך קבוצה של מדדים ומדידות המתארים את התאים הבודדים ואת המיקרו-סביבה הגידול בתוך המכשיר. ניתוח טומוגרפי קונפוקלי(איור 2)ממיר z-stack confocal לייצוג תלת מימדי של התאים. באמצעות תסריט פיתון מותאם אישית בתוך הסביבה מחברת / מעבדה Jupyter, מטוס לאחר מכן מותאם לשכבה של תאים אשר יוצרים את מחסום מוח הדם כמוקרום 30. לבסוף, לעשות מדידות פנוטיפיות של אוכלוסיות תאים סרטניים (טבלה 1).
    1. בצע ניתוח זה בסוף ניסוי או לאורך קורס זמן. התקן פיתון ואת הספריות המתאימות על פי מדריך התוכנה שאליו בוצעה הפניה, ולאחר מכן פתח את התוכנה משורת הפקודה של Windows על-ידי הפעלת הפקודה "conda activate", ולאחריה "מעבדת jupyter". סביבת Jupyter תיטען בתוך דפדפן ברירת המחדל.
    2. מתוך סייר הקבצים Jupyter לחץ פעמיים על המחברת Jupyter "contom.ipynb" כדי לפתוח אותו. הפעל את התא מתחת לכותרת ייבוא ספריות, מחלקות/פונקציות מותאמות אישית והגדר את המחברת על-ידי לחיצה על תא המחברת ולאחר מכן לחיצה על לחצן ההפעלה. כל תאי המחברת שלהלן מבוצעים באותה גישה. שים לב שכאן "תא" מחברת מתייחס בלוק של קוד פיתון בתוך המחברת Jupyter.
  2. הכן את הנתונים. אלגוריתם זה משתמש ערכת הכלים של תצוגה חזותית (VTK) כדי לטפל ולהציג את z-stack ונתונים תלתמימדיים 17.
    1. מקם את המקום שסופק. קובץ XLSX ("מעקב .xlsx") באותה תיקיית חלונות שבה נמצאת מחברת Jupyter. הקובץ עוקב אחר ניסויים וממשקים עם המחברת Jupyter. מקם את קובץ ND2 ממקטע 6 בתיקיית משנה בשם "\Experiment_XXX\Confocal\" מתחת למיקום המחברת של Jupyter. ניתן להוסיף תיקיות ניסוי נוספות בתוך על-ידי התאמת ה- "XXX" למזהה המספרי שהוקצה לתיקיות חדשות.
    2. תייג את תיקיית הניסוי הראשונה "Experiment_001" ואת קובץ ND2 "001.nd2". תחילה, המר את קובץ ההדמיה ND2 לקובץ TIFF מרובה תמונות תפור המופרד באמצעות ערוץ צבע. עשה זאת על-ידי ביצוע תא המחברת מתחת לכותרת "קרא את מחסנית z confocal לזיכרון" עם הפונקציה Save_tiff_from_ND2 () ללאתשלום 30. קובץ ND2 הוא תבנית הדמיה קניינית מתוך Nikon, ולכן יש צורך להמיר אותו לתבנית שתווכנת קוד פתוח תואמת לה.
      הערה: TIFF (תבנית קובץ תמונת תג) משמש מכיוון שהוא בכל מקום, 16 סיביות תואם, מיובא בקלות לתוך VTK, ותמונות מרובות ניתן לאחסן בקובץ יחיד, אשר מתאים עבור תמונות z-stack. ביצוע תא המחברת יקרא בתמונה מקובץ ND2, לחלץ מידע של הצבע ו מיקומי XYZ ולאחר מכן לאחסן תמונה זו במערך numpy בהתאם למבנה שנקבע מראש. לאחר מכן הוא ישכור את המערך כקובץ TIFF באמצעות קובץ ה-tifffile של ספריית פיתון.
  3. המרת נתוני הדמיה למודל תלת-ממדי
    1. יבא את קובץ ה- TIFF לתוך VTK (vtkTIFFReader) באמצעות עיבוד תלת-ממדי כדי להמחש את התאים (איור 2). בחר סף המבוסס על צבע התאים בתמונה. כדי להבהיר, האובייקט VTK מייצג בלוק של פיקסלים (X, Y, Z) בחלל (עוצמת קול) אך רק פיקסלים מסוימים (ירוק או אדום) מייצגים תאים, השאר הם רקע או רעש (שחור).
    2. לכן, הגדר מסנן אטימות על אמצעי האחסון אשר מסיר את הרקע לאשר כי מה פלואורסץ נשאר הוא רק התאים. עשה זאת באמצעות תא המחברת Jupyter שכותרתו, שנה ערכי אטימות עבור כל ערוץ מיקרוסקופ על-ידי התאמת משתני ערך Channel_alpha (כלומר, GFP_alpha). הצג באופן חזותי את האפקט באמצעות תא המחברת שכותרתו הצג עיבוד תלת-ממדי כדי לוודא שהסף מוגדר כראוי.
    3. שמור את ערכי האטימות בגיליון האלקטרוני לשימוש בשלב הבא. המר את נתוני עוצמת הקול לאובייקטים תלת-ממדיים בודדים, שכל אחד מהם מייצג תא בתמונה באמצעות טכניקה הנקראת קוביות צועדות31. אלגוריתם זה מחלץ רשת מצולע של isosurface משדות סקאליים תלת מימדיים של voxels.
    4. השתמש בערך האטימות באלגוריתם קוביות הצעידה כדי להפריד כל תא מהרקע. השלם שלב זה עבור כל תאי הפלורסנט שזוהו בכל ערוץ מיקרוסקופ על-ידי הפעלת המרת תמונת voxel לרשת משולשת ושמור כקובץ VTK במחברת.
  4. התאמת מטוס לממברנה
    1. להתאים מטוס למחסום אנדותל על ידי איתור הראשון של centroids התא (תא מחברת: נתח את ערוץ RFP (מחסום אנדותל)). לעבור על רשתות השינוי של הרשימה באמצעי האחסון ולחלץ את האזורים שלא מחוברים באמצעות PolyDataConnectivityFilter מ- VTK. חשב את מרכז הרשת והוסף את המידה לרשימת הסינון של centroids עבור רשתות שינוי גדולות מדי או קטנות מדי (<50, >1000000 voxels).
    2. התאם מישור לרשימת הצנטרואידים עבור תאי אנדותל באמצעות מזעור שיטת שגיאה (תא מחברת: התאם מישור ל- RFP centroids (מחסום אנדותל) (איור 2, איור 3)32. בדוק את התאמת המטוס על-ידי התוויית המטוס והמנטרואידים והתאם באופן ידני במידת הצורך (באמצעות תטא, בטא ו-z) על-ידי הפעלת תא המחברת שכותרתו Visualize centroids RFP והתאמת מטוס.
    3. לאחר שהמטוס מותאם כראוי, שמור את הנורמלי של המטוס לקובץ מעקב הניסויים . קובץ XLSX לשימוש עתידי.
  5. נתח את התכונות התיאוריות של תאים סרטניים בודדים עבור המתארים הבאים (טבלה 1).
    הערה: אם המחשב המבצע את הניתוח מפגר, ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות מחשוב בעל ביצועים גבוהים הוא אופציה. אלגוריתם זה שימושי במחשבים ניידים סטנדרטיים לניתוח של מספר קטן של תאים, אולם VTK אינו מתאים היטב למספר גדול של אובייקטים בודדים (>1000). לכן, הוא אופציונלי להשתמש באלגוריתם מותאם כדי לפעול באשכול מחשוב בעל ביצועים גבוהים. זה מאפשר ניתוח מהיר של ניסויים עם תאים רבים (איור 2). כל 7.5 מושגת על ידי הפעלת תאי המחברת שכותרתם נתח את ערוצי המיקרוסקופ הנותרים עבור מתארים פנוטיפיים וקריאה במידע Experiment_tracker ולנתח את הערוצים הקיימים.
    1. למדוד את ההתאפזרות של התאים הסרטניים: לאחר אפיון שכבת אנדותל עם מטוס, למדוד את הנפח של כל תא סרטני שהיגר דרך הממברנה. חתוך כל תא (בוליאני) כך רשת מתחת לממברנה נשמר ואת החלק מעל הממברנה מוסר33. לאחר מכן סגור את הרשת הפתוחה (vtkFillHoles).
      1. לחשב מחדש את הנורמלי ואת הסנטרויד החדש של הרשת הקצוע. למדוד את הנפח והמיקום של כל תא סרטניים קצץ לניתוח. אמצעי האחסון שווה ערך למספר voxels מילויי רשת השינוי של כל תא בודד. לחשב את המרחק בין מישור אנדותל ומיקום של כל תא סרטני.
    2. למדוד את הפנוטיפ התאי: לחשב את המורפולוגיה של כל תא סרטני על ידי פקטורינג הצורה שלה, נפח ומיונו.
  6. אמת את המידות ושמור בגיליון אלקטרוני או בהתוות. הפעל את תא המחברת שכותרתו בדוק כי centroids נמדדו במדויק ועיבוד יהיה צץ מראה את centroids שזוהו על גבי אמצעי האחסון התמונה לפי סוג התא. לאחר שכל הניסויים נעשים לייצא את הנתונים המלאים כקובץ גיליון אלקטרוני יחיד על-ידי הקלדת הניסויים שיכללו על-ידי מזהה experiments בתא המחברת שכותרתו יצא את הנתונים כקובץ נתונים יחיד.XLSX עבור ניסויים משתנים המחליף את מזהי הניסוי נתון. אם אמת את מערכת הנתונים שהושלמה, תכנן אותה באמצעות תא המחברת שכותרתו חלק מהתווה רצועה מתפשטת . התווייתו תופיע בסביבת המחברת ותשמור בקובץ.

8. לנתח את המאפיינים הקשורים באמצעות בינה מלאכותית

הערה: זהה תכונות פנוטיפיק גרורתיות באמצעות אלגוריתמים של בינה מלאכותית.

  1. בצע סיווג בינארי באמצעות אורנג' בהתאם לתכונה המוצגת באיון 5 ובקובץ משלים 3. הפעל את Orange משורת הפקודה השנייה של Windows על-ידי הקלדת "conda activate" ולאחר מכן "python -m Orange.canvas" ולחץ על חדש מהבקשה. כתום היא תוכנה מבוססת גרירה ושחרר, לכן לסדר את הפונקציות על ידי גרירת כל פריט מהתפריט הימני אל בד הציור כדי להתאים קובץ משלים 3. לאחר השלמת הרשימה, לחץ פעמיים על סמל הקובץ ובחר את הקובץ .XLSX נתונים.
  2. סנן את הנתונים כדי להסיר מדידות גרועות, המוגדרות כמדידות שנכשלו בפעולה בוליאנית או במתן ערכי משתנה פרמטריים מחוץ לתגבולות מוכרים באמצעות הסמל "בחר שורות". לחץ פעמיים על הסמל והגדר תנאים התואמים למסנן כגון "Sphericity היא בין 0 ל- 1". צור תנאים עבור 8.2.1, 8.2.2 ו- 8.2.3.
    1. מרחק סינון מידות מנומקות לנוע בין -100-200 μm.
    2. מדידות סינון של צורת תא לנוע בין 0-1.
    3. לסנן מדידות נפח תא סרטניים לנוע בין 0-2000 voxels.
    4. השתמש בכל המשתנים הפרמטריים(טבלה 1)כדי לסווג את MDA-MB-231-BR-GFP ו- MDA-MB-231-GFP גרורתי שאינו מוח. לחץ פעמיים על סמל בחירת עמודות מתוך בד הציור. שימוש בלחצן > כדי להעביר משתנים זמינים לתכונות, למשתנייעד או לתכונות Meta. המשתנה היחיד שאמור להיות משתנה יעד הוא תווית גרורתית המגדירה אם תאים ב- data set נחשבים גרורתיים (1) או לא (0). ניתן מיקום משתני ניסוי במקטע תכונות Meta.
  3. דוגמה לנתונים לתוך אימון (80%) ומבחן מוגדר (20%). לחץ פעמיים על סמל דוגמית נתונים ובחר סוג דגימה של חלק קבוע של נתונים: הגדר ל- 80% ובחר תיבות סימון לשכפול ולשכבה. שכבה ואימות צולב של סט האימונים באמצעות 10 קפלים כנגד כל דגם/מסווג. לחץ פעמיים על בדיקה & ציון ובחר אימות הצלב עם מספר קפלים: מוגדר כ- 10 ו- Stratified מסומן. הגדר את מחלקת היעד ל- 1.
  4. בשיטה זו, השתמש ברשתות עצביות ובאלגוריתמים של למידה אקראית של יער מכיוון שהם חזקים לנתונים. בתוך הסמל יער אקראי, בחר את מספר העצים להיות 50 ולא לבחור כל אפשרויות אחרות. בתוך סמל רשת עצבית לבחור נוירונים לכל laye מוסתרr: 100, הפעלה: ReLu, Solver: אדם, אלפא: 0.0001, ומקס איטרציות: 200. עם זאת, הגדרות אלה ישתנו באופן משמעותי על ידי מחקר ויש להבין היטב לפני היישום.
  5. לאחר הגדרת בד הציור לחץ פעמיים על כל סמל מקובץ לנתונים לדוגמה ולחץ על החל או שלח נתונים. לחץ פעמיים על Test & Score ונתוני האימון יתחילו לשמש לפיתוח מודל באמצעות האלגוריתמים. לאחר אימון מודל למידת מכונה, לפתוח מחדש מבחן & ציון ובחר מבחן על נתוני מבחן ולסגור את החלון המוקפץ כדי להבקיע את הביצועים של המודל על ידי סיווג התאים בשבב על פי ההסתברות שהם גרורתיים במוח מ 0 ל 1.
  6. שמור את ביצועי מודל למידת מכונה בקובץ (טבלה 2). כלול את האזור מתחת לעקומה (AUC) של ROC, את הדיוק ואת הציון F1. שמור קובץ שני המכיל את המדדים גרורתיים בודדים והסתברויות סיווג. לחץ פעמיים על הסמל שמור ולחץ על שמירה בשם כדי לכתוב כדי לתייק את הסתברויות הסיווג. באופן דומה, ניתן להציג את עקומת ROC על-ידי לחיצה כפולה על סמל ניתוח ROC ותו לא ניתן לחשב את ביצועי הדגם על-ידי לחיצה כפולה על סמל מטריצת בלבול.

תוצאות

באמצעות טכניקה זו, ניתחנו סוגי תאים המסומנות בחלבונים או צבעים שונים של פלורסנט. אנו מדגימים את השימוש בגישה זו עם שבב μmBBN שפותח עם hCMEC/D3-DsRed ואסטרוציטים שאינם פלורסנט. תאי אנדותל microvascular המוח נזרעו על קרום נקבובי (5 μm מסלול נקבוביות חרוטות) והונחובאינקובטור 34 ב 37 ° C תחת 5% CO2

Discussion

פיתחנו והציגנו שיטה חדשה המתאימה כלים מנוצלים לעתים קרובות בניתוחי הדמיה קלינית למדידת אקסטרווסטרציה והגירה של תאים סרטניים באמצעות מחסום אנדותל לתוך רקמת המוח. אנו מציבים גישה זו יכולה להיות שימושית הן בvio והן במדידות במבחנה; הוכחנו את השימוש בו על מערכת מיקרו-נוזלית תלת-מיודמת המשנה את...

Disclosures

אין גילויים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים למעבדת סטיג, במכון הלאומי לסרטן על תרומתם הנדיבה של תאי MDA-MB-231-BR-GFP. מיקרוסקופית Confocal בוצע המכון הביו-פנים של אוניברסיטת מישיגן (BI). ציתימטריית זרימה בוצעה באוניברסיטת מישיגן זרימה Cytometry Core. וקטורים ויראליים נוצרו על ידי אוניברסיטת מישיגן וקטור Core. אנו גם מודים לקלי קידוול על ההדרכה בניתוח סטטיסטי של נתונים אלה.

מימון:

C.R.O. נתמך חלקית על ידי מלגת הדרכה NIH T-32 (T32CA009676) ו 1R21CA245597-01. T.M.W. נתמך חלקית על ידי 1R21CA245597-01 והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר UL1TR002240. מימון חומרים ואפיון סופק על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, קרן METAvivor, והקרן לחקר סרטן השד. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

References

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
  27. Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
  33. Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162confocal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved