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Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour préparer et cultiver un micro-environnement métastatique de tumeur de barrière de cerveau de sang et puis quantifiant son état utilisant l’imagerie confocale et l’intelligence artificielle (apprentissage automatique).

Résumé

Les métastases cérébrales sont les lésions cancéreuses les plus mortelles; 10-30% de tous les cancers métastasent au cerveau, avec une survie médiane de seulement ~5-20 mois, selon le type de cancer. Pour réduire la charge tumorale métastatique du cerveau, les lacunes dans les connaissances de base et translationnelles doivent être comblées. Parmi les principaux défis, mentionnons le manque de modèles précliniques reproductibles et d’outils associés. Les modèles tridimensionnels de métastase cérébrale peuvent produire les données moléculaires et phénotypiques pertinentes utilisées pour répondre à ces besoins lorsqu’elles sont combinées à des outils d’analyse dédiés. En outre, par rapport aux modèles murins, les modèles d’organe sur puce des cellules tumorales patientes traversant la barrière hémato-encéphalique dans le microenvironnement cérébral génèrent des résultats rapidement et sont plus interprétables avec des méthodes quantitatives, donc utilisables à des tests à haut débit. Ici, nous décrivons et démontrons l’utilisation d’une nouvelle niche du cerveau du sang microfluidique 3D (μmBBN) plate-forme où de multiples éléments de la niche peuvent être cultivés pendant une période prolongée (plusieurs jours), fluorescente imaged par microscopie confocale, et les images reconstruites à l’aide d’une technique de tomographie confocale innovante; tous visaient à comprendre le développement de la micro-métastase et des changements au micro-environnement tumoral (TME) d’une manière répétable et quantitative. Nous démontrons comment fabriquer, semer, image, et analyser les cellules cancéreuses et les composants cellulaires et humoristiques TME, en utilisant cette plate-forme. En outre, nous montrons comment l’intelligence artificielle (IA) est utilisée pour identifier les différences phénotypiques intrinsèques des cellules cancéreuses qui sont capables de transiter par un modèle μmBBN et de leur attribuer un indice objectif du potentiel métastatique du cerveau. Les ensembles de données générés par cette méthode peuvent être utilisés pour répondre à des questions fondamentales et translationnelles sur les métastases, l’efficacité des stratégies thérapeutiques et le rôle du TME dans les deux.

Introduction

Les métastases cérébrales sont les lésions cancéreuses les plus mortelles; 10-30% de tous les cancers métastasent au cerveau, avec une survie médiane de seulement ~5-20 mois, selon le cancer de type1,2. Une question principale qui se pose lors de l’étude de la métastase du cancer est de savoir comment les sous-clones migrent de l’environnement humoristique de la circulation sanguine dans un organe comme le cerveau3,4. Cette question a conduit à de nombreuses variations de la migration, l’invasion, et les tests d’extravasation. Toutes ces méthodes partagent l’étape critique du comptage ou de la mesure des propriétés des cellules qui se déplacent d’un endroit à l’autre en réponse à un stimulus. La plupart des tests de migration facilement disponibles sont utilisés pour étudier la migration bidimensionnelle (2D) des cellules cancéreuses. Ceux-ci ont élucidé une richesse de connaissances; toutefois, ils ne récapitulent pas la nature tridimensionnelle du système in vivo que d’autres méthodes peuvent fournir5. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier le micro-environnement tumoral (TME) dans les systèmes tridimensionnels (3D), mais les approches d’analyse disponibles pour les structures 3D sont limitées et souvent incohérentes.

L’un des outils 3D les plus populaires est une chambre Boyden qui se compose d’une membrane suspendue au fond d’un puits, séparant deux régions distinctes. Boyden a introduit l’essai pour étudier leucocyte chemotaxis4. Les régions inférieures peuvent être variées selon la chimie ou d’autres moyens6,,7 pour inciter les cellules de la région supérieure à migrer vers la région inférieure. L’approche la plus courante pour quantifier le nombre de cellules qui ont migré est de libérer les cellules du fond de la membrane à l’aide d’une solution tampon, de les lyser, puis de les compter en fonction de la quantité de contenu d’ADN dans la solution7. Cette approche indirecte est sujette à l’erreur de l’opérateur en raison de la variabilité de la technique et la procédure détruit l’information sur le phénotype du cancer et le micro-environnement. Les variations de l’essai de chambre Boyden impliquent la fixation des cellules migratrices qui restent sur la membrane, mais fournit seulement un compte des cellules qui ne sont plus viables pour l’étude continue6,8,9.

En raison des limites de la chambre Boyden et de la croissance des innovations dans la communauté microfluidique, des puces d’essai de migration ont été développées qui observent le mouvement des cellules en réponse à un stimulus dans une direction plutôt que trois10,11,12. Ces essais de migration facilitent le contrôle de facteurs tels que le débit ou la séparation à cellule unique13,14 qui permettent une meilleure interprétation des résultats; cependant, leur format 2D perd inévitablement une certaine information dynamique. Des études récentes ont porté sur l’extravasation (c.-à-d. le mouvement des cellules de la circulation dans un tissu, comme la barrière hémato-encéphalique) dans un environnement 3D14,15. La distance d’extravasation dans les tissus et le comportement de sondage qui se produit à la barrière cellulaire / membrane est plus raffiné que les mesures glanées à l’aide de la chambre Boyden ou un dispositif de migration microfluidique 2D16. Ainsi, les dispositifs qui permettent l’imagerie et l’analyse appropriées de l’extravasation 3D sont essentiels pour capturer ces mesures sophistiquées, mais manquent dans la littérature.

Indépendamment des tests de migration, des techniques d’imagerie robustes ont été développées pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la tomographie qui sont capables d’identifier et de reconstruire avec précision les tissus dans l’espace 3D17,18. Ces techniques acquièrent des images dans des piles z et segmentent des parties de l’image en fonction des propriétés du tissu, puis convertissent les images segmentées en mailles tridimensionnelles19,20,21. Cela permet aux médecins de visualiser en 3D des organes individuels, des os et des vaisseaux pour aider à la planification chirurgicale ou aider au diagnostic du cancer ou des maladies cardiaques22,23. Ici, nous montrerons que ces approches peuvent être adaptées pour être utilisées sur des spécimens microscopiques et des dispositifs d’extravasation 3D.

À cette fin, nous avons développé la technique de tomographie confocale innovante, présentée ici, qui offre la flexibilité pour étudier l’extravasation des cellules tumorales à travers une membrane en adaptant les outils de tomographie existants. Cette approche permet l’étude de toute la gamme des comportements des cellules cancéreuses comme ils interagissent avec une barrière cellulaire, comme une couche de cellules endothéliales. Les cellules cancéreuses présentent des comportements de sondage; certains peuvent envahir mais rester près de la membrane, tandis que d’autres traversent facilement la barrière. Cette technique est capable de produire des informations sur le phénotype de la cellule dans toutes les dimensions24. L’utilisation de cette approche pour étudier le TME est à la fois relativement peu coûteuse, facile à interpréter et reproductible, par rapport à des modèles murins in vivo plus complexes. La méthodologie présentée devrait fournir une base solide pour l’étude de nombreux types de tumeurs et de micro-environnements en adaptant la région stromale.

Nous décrivons et démontrons l’utilisation d’une plate-forme de niche du cerveau du sang microfluidique 3D (μmBBN)(figure 1)où des éléments critiques de la barrière et de la niche (cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et astrocytes) peuvent être cultivés pendant une période prolongée (environ jusqu’à 9 jours), par une microscopie confocale et les images reconstruites à l’aide de notre technique de tomographie confocale (Figure 2); tous visaient à comprendre le développement de la micro-métastase et des changements au micro-environnement tumoral d’une manière répétable et quantitative. L’interface de barrière hémato-encéphalique avec la niche de cerveau est composée des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau qui sont renforcées par la membrane de sous-sol, les pieds d’astrocyte, et les péricytes25. Nous nous sommes concentrés sélectivement sur les composants astrocytes et endothéliales étant donné leur importance dans la formation et la régulation de la barrière hémato-encéphalique. Nous démontrons comment fabriquer, semer, image, et analyser les cellules cancéreuses et les composants cellulaires et humoristiques de micro-environnement de tumeur, utilisant cette plate-forme. Enfin, nous montrons comment l’apprentissage automatique peut être utilisé pour identifier les différences phénotypiques intrinsèques des cellules cancéreuses qui sont capables de transiter par un modèle μmBBN et de leur attribuer un indice objectif du potentiel métastatique du cerveau24. Les ensembles de données générés par cette méthode peuvent être utilisés pour répondre à des questions de base et translationnelles sur les métastases, les stratégies thérapeutiques et le rôle du TME dans les deux.

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Protocole

1. Préparer le moule de niche de barrière de cerveau de sang

NOTE : Le dispositif de culture utilisé dans cette plate-forme est un échafaudage basé sur pdms que nous construisons une niche de barrière de cerveau de sang cellulaire sur. Il est fait de deux parties séparées par une membrane poreuse. Pour préparer la niche barrière hémato-encéphalique deux moules SU-8 fabriqués à l’aide de la photolithographie sont nécessaires26,27. Le protocole sera décrit pour le moule de 100 μm d’épaisseur d’abord, puis des notes seront données pour le moule de 200 μm d’épaisseur.

  1. Pour préparer le moule, nettoyez une plaquette de silicium de 4 po à l’aide d’acétone avec une bouteille de compression, puis séchez-la avec un pistolet à azote.
    1. Cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pendant 10 min à 200 °C pour enlever tout solvant résiduel.
    2. À son tour centre la plaquette de silicium sur le mandrin d’un coacker de spin et distribuent 1 mL de SU8-2075 pour le moule supérieur. Tournez pendant 5 s à 500 tr/min (accélération 300 tr/min/s) pour disperser le photorésiste, puis 30 s à 2200 tr/min (accélération 300 tr/min/s) pour obtenir un revêtement SU-8 de 100 μm d’épaisseur. L’optimisation peut être nécessaire pour atteindre l’épaisseur spécifiée.
  2. Cuire la gaufrette à doux sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 2 min, puis immédiatement à 98 °C pendant 20 min.
  3. Placez la plaquette dans une lampe de photolithographie et placez le masque centré sur la plaquette selon les procédures standard. Exposer les plaquettes enduites SU-8 d’un éclat de 230 mJ/cm2 d’UVB (360 nm ± 10 nm). Une expérience de matrice d’exposition peut être effectuée pour déterminer le dosage optimal. Les conceptions de masques sont disponibles dans le fichier supplémentaire 1.
  4. Effectuer une cuisson post-exposition à 65 °C pendant 2 min, puis immédiatement à 98 °C pendant 10 min pour améliorer l’adhérence. Refroidir la gaufrette à 50 °C.
  5. Retirez la résistance non exposée à l’aide du photo-développeur SU-8. Rincez la plaquette dans le développeur pendant 5 min dans un bain, puis utilisez une bouteille de pulvérisation remplie de développeur SU-8 dans une hotte chimique pour agiter et enlever le reste non réparé SU-8. Un microscope 4x peut être utilisé pour observer si tous les SU-8 non réparés ont été enlevés. Une ligne blanche sur les bords des fonctions photorésistes indique que le SU-8 n’a pas été complètement enlevé.
  6. Effectuer une dernière cuisson dure dans un four à 110 °C pendant 60 min.
  7. Suivez la même procédure pour le moule de 200 μm d’épaisseur à l’aide de SU-8 2075, mais ajustez le protocole à ce qui suit :
    1. Réglages du revêtement de rotation : Tournez pendant 5 s à 500 tr/min (accélération 300 tr/min/s) pour disperser le photorésiste, puis 30 s à 1300 tr/min (accélération 300 tr/min/s) pour obtenir un revêtement de 200 μm d’épaisseur.
    2. Cuire au four à 65 °C pendant 2 min puis à 98 °C pendant 40 min.
    3. Temps d’exposition de 340 mJ/cm2.
    4. Cuisson après exposition : 2 min à 65 °C, puis 98 °C pendant 15 min.
  8. Enfin, silaniser chaque plaquette en les plaçant dans une chambre à vide à l’intérieur d’une hotte chimique avec un récipient en plastique dans lequel 3 gouttes (~150 μL) de solution silanisante (Trichloro perfluoro octyl silane) ont été placés. Tirez un vide et laissez-le toute la nuit pour permettre à la vapeur d’enrober la gaufrette. Cette étape réduit l’adhérence entre le SU-8 et le PDMS, augmentant ainsi la durée de vie du moule.
    ATTENTION : Le silane de trichloro perfluoroptyl doit toujours être manipulé dans le capot de fumée et tenu à l’écart des sources d’eau.
  9. Placez les moules à gaufrettes individuels dans des boîtes de Pétri de 150 mm à l’aide de deux bandes de ruban adhésif à double face. Assurez-vous que les gaufrettes sont plates. Une alternative consiste à fabriquer un moule en aluminium dans lequel la plaquette peut être placée. Parce que le moule en aluminium est enfermé, il produira des moulages avec une épaisseur uniforme, tandis que la méthode de la boîte de Pétri est sensible à l’inclinaison de la surface est-il placé sur. L’amélioration de la planéité des moulages PDMS réduit le temps d’imagerie confocale en aval.

2. Former et assembler le dispositif de barrière hémato-encéphalique (BBB) de PDMS

  1. Mélanger 75 g de PDMS à un rapport de 1:10 (Crosslinker:Base) en poids dans une tasse en plastique.
  2. Verser le PDMS sur les moules (1 mm d’épaisseur pour le moule de 200 μm d’épaisseur et 4 mm pour le moule de 100 μm d’épaisseur) et les dégazages dans un desiccateur sous vide pendant une heure ou jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées. Placer dans un four à 65 °C pendant la nuit. L’épaisseur de 1 mm peut être ajustée en fonction de la distance de travail de l’objectif 10x dans le microscope confocal.
  3. Après que le PDMS ait guéri utiliser une lame pour couper doucement contre la plaquette à travers le PDMS autour des bords. Peler le PDMS et utiliser une lame pour couper le long des guides rectangulaires et un poinçon de biopsie de 1,5 mm pour ouvrir les entrées et les prises de l’appareil. Couvrez les pièces de l’appareil PDMS d’un ruban d’emballage de 48 mm de large pour le garder propre à partir de la poussière et des débris.
  4. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection pour couper un rectangle de 5 mm x 50 mm de membrane en polycarbonate avec 5 pores μm et le stocker à l’intérieur d’une boîte de Pétri pour une utilisation ultérieure.
  5. Rassemblez ce qui suit : 200 μL de pipette, 2 mL de 1:10 PDMS mélangés avec du toluène à un rapport de 2:3 en poids dans un flacon en verre, une pipette Pasteur avec une ampoule de compression, les parties supérieures et inférieures préparées pdms, la membrane, trois glissières en verre de 50 mm x 75 mm et le transportant tous à un coaster. Les étapes suivantes pour l’assemblage et l’ensemencement cellulaire de l’appareil sont représentées à la figure 1.
  6. Utilisez la pipette Pasteur pour transférer 1 mL de solution de colle PDMS:toluène dans une lame en verre de 50 mm x 75 mm sur le mandrin du tatelier. Tournez pendant 5 secondes à 100 tr/min (accélération 300 tr/min/s) et 30 secondes à 2000 tr/min (accélération 300 tr/min/s).
  7. Placez la diapositive sur une table et couvrez-la d’une chambre haute PDMS et d’une chambre inférieure de sorte que les faces de PDMS avec des dispositifs moulés en elle entrent en contact avec la glissière et la colle est transférée sur le visage de PDMS, décrivant le périmètre de toutes les caractéristiques.
  8. Retournez la chambre haute pdms sur une autre glissière avec le revêtement de colle orienté vers le haut et placez soigneusement la membrane à travers l’appareil entre les entrées et les sorties. Placez la pointe de 200 μL dans la solution de colle PDMS:toluène jusqu’à ce qu’elle en ait quelques-uns dans la pointe. Touchez la pointe entre chaque entrée et chaque exutoire pour placer une petite goutte près du bord de la membrane où elle entre en contact avec le PDMS.
  9. Retirez l’autre moitié de l’appareil et placez-le avec le revêtement de colle vers le bas tout en alignant les entrées et les sorties sur les deux parties.
  10. Placez l’appareil assemblé dans un four à 37 °C pendant la nuit pour guérir la colle. Transférer dans un bocal à cloches à vide avec dessicant et laisser se déshydrater pendant deux jours. Il s’agit d’une étape cruciale pour permettre au Toluène de s’évaporer et d’améliorer la cohérence de l’ensemencement de l’appareil en régulant la vapeur d’eau absorbée dans l’air de laboratoire.

3. Semer le micro-environnement du cerveau dans l’appareil

  1. Culture cellulaire et réactifs : Avant de commencer ce protocole, obtenez les réactifs et les cellules suivants. Cultiver toutes les lignées cellulaires dans un incubateur fixé à 37 °C en 5% CO2.
    1. Maintenir la lignée de cellules cancéreuses du sein humaines triple-négatives MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) et MDA-MB-231-BR-GFP cellules (obtenue de Patricia Steeg, PhD) dans DMEM avec 4,5 g/L glucose, complétée par 2 mM L-glutamine, 10% FBS et 1x antibiotique-antimycotique. Créez des cellules fluorescentes MDA-MB-231-GFP en transducant la cellule MDA-MB-231 avec le lentivirus vectoriel vide pLL-EV-GFP. Trier la population transduite GFP+ à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avant l’expérimentation.
    2. Maintenir les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain hCMEC/D3 dans le milieu EGM-2. Créez des cellules fluorescentes hCMEC/D3-DsRed en transducant hCMEC/D3 avec le lentivirus vectoriel vide pLL-3.7-dsRed. Retirez toutes les cellules non transduquées et non fluorescentes de la culture à l’aide de FACS avant utilisation expérimentale.
    3. Maintenir les astrocytes humains normaux (NHA) dans DMEM complété avec 4,5 g/L de glucose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM pyruvate de sodium, 1x Supplément de croissance N-2, et 1x antibiotique-antimycotique. Immortaliser les astrocytes en transducant le vecteur lentiviral pLOX-TERT-iresTK (Addgene 12245). Créez le vecteur à l’aide de plasmid psPAX2 et plasmide d’enveloppe pMD2.G (Addgene 12260 et 12259).
  2. Retirez un dispositif μmBBN du désiccateur à vide et placez-le sur une surface métallique ou papier (c.-à-d. du ruban adhésif) avec les entrées orientées vers le bas et placez-le dans une chambre à plasma. Placez également une lame de verre de 50 mm x 75 mm dans la chambre à plasma. Tirez un vide, puis traiter avec du plasma à 80 W pour 30 s.
  3. Retirez rapidement la glissière en verre et l’appareil de la chambre à plasma et placez l’appareil avec les entrées orientées vers le haut sur la glissière en verre alignée à l’aided’unguide ( Fichier supplémentaire 2 ). Cela créera un lien permanent entre le PDMS et la glissière en verre et ne peut pas être repositionné.
  4. Coupez ensuite les extrémités de 16, 200 bouts de pipette de μL, à 2 mm de la pointe. Insérez les pointes de pipette dans toutes les entrées et les prises. L’appareil peut être remis dans le désiccateur sous vide à ce stade s’il n’est pas prêt à semer les cellules.
  5. Remettre l’appareil dans la chambre à plasma et traiter avec du plasma pendant 8 min à 200 W. Une fois que l’appareil a refroidi (5 min) du traitement au plasma, placez-le à l’intérieur d’un récipient secondaire stérile, comme une boîte transparente de pointe de pipette. Effectuer l’étape suivante dans ~15 min ou l’efficacité du traitement plasmatique peut être réduite conduisant à l’engorgement.
  6. Plusieurs jours avant la culture d’expérience Petri plats de 1 x10 6 cellules endothéliales (hCMEC/D3-DsRed) et 1 x 106 astrocytes (NHA). Pendant que l’appareil subit le traitement plasmatique de 8 min, préparez une solution de collagène composée de 0,5 mL de collagène bovin de type I de type 3 mg/mL PureCol avec 64 μL de 0,8 M NaHCO3 et 20 μL de 10x de glucose élevé (250 mM) MEM. Suspendre 5,0 x 105 cellules NHA dans la solution de collagène. Maintenir la solution sur la glace pendant qu’elle n’est pas utilisée.
  7. Transférer 120 μL de la solution collagène/astrocyte/microglie dans l’appareil par la pointe de la pipette pour la chambre inférieure (figure 1 Flèches rouges). Laisser la solution traverser la chambre dans la pointe opposée de la pipette. Après les quatre canaux de l’appareil ont été remplis placent la puce dans l’incubateur de CO2 à 37 °C et 5% de CO2 pendant 1 h ou jusqu’à ce que le collagène a réglé.
  8. Après les ensembles de collagène, remplissez tous les bouts de pipette alimentant la chambre inférieure avec un mélange de support complet. Pour les copeaux contenant des cellules endothéliales et des astrocytes, un mélange de 50:50 de l’endothélial:astrocytes media est utilisé.
  9. Enrober la chambre supérieure d’un facteur de croissance réduit de 2 % de Matrigel dans un support endothélial complet à l’aide de la pointe de la pipette de la chambre supérieure(figure 1 flèches bleues)et placer dans l’incubateur pendant 1 h.
  10. Rincer la chambre supérieure avec le mélange de support indiqué et alterner la pointe ensemencée de cellules endothéliales (figure 1 Flèches vertes). Suspendre 1 x 106 cellules endothéliales dans 1 mL de milieux endothéliales et les graines 30 μL toutes les 15 minutes en alternance conseils chambre supérieure pour une couverture uniforme. Semer les cellules endothéliales dans chaque extrémité de chambre supérieure deux fois, pour un total de 4 fois par chambre.
  11. Après l’ensemencement final des cellules endothéliales, remplissez tous les conseils avec le mélange de médias et placez l’appareil dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2, changeant de support dans les deux chambres tous les 12 h.

4. Surveiller la progression de la formation de couche endothéliale

  1. La couverture complète du canal par la couche endothéliale est observée après 3 jours. Utilisez l’une des deux méthodes pour surveiller la couverture de la barrière endothéliale : fluorescence ou TEER. la fluorescence hCMEC/D3-DsRed et la couverture en % à travers la zone du canal peuvent être quantifiées à l’aide d’ImageJ.
    1. Ouvrez le fichier TIFF dans ImageJ représentant de la barrière hCMEC/D3-DsRed. Dans le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier > Ouvrir pour sélectionner le fichier.
    2. Fusionnez toutes les couches Z de l’image en utilisant l’intensité maximale suivant ces commandes et options clés : Image > Piles > Projet Z > Toutes les tranches Z, Intensité maximale.
    3. Effectuez un seuil de couleur qui est le même dans toutes les puces microfluidiques évaluées à l’aide de cette méthode. Pour l’étude présentée, nous avons utilisé un seuil de 450. Utilisez le menu seuil dans ImageJ à l’adresse suivante : Image > Ajuster > Seuil.
    4. Définissez les mesures à enregistrer à l’aide des commandes et options suivantes : Analyser > Définir les mesures > Limiter au seuil, Fraction de zone.
    5. Sélectionnez une région représentative du canal microfluidique à mesurer en dessinant une boîte. L’outil de boîte est situé sur le menu principal d’ImageJ. Mesurez 3 répliques techniques positionnées au début, au milieu et à l’extrémité de chaque canal microfluidique à l’aide de la même taille de boîte.
    6. Analyser chaque canal et enregistrer la fraction de zone, représentant la couverture endothéliale en %. Exporter ces mesures sous forme de fichiers de feuilles de calcul pour tracer et visualiser les données à l’aide des commandes suivantes : Analyser > Mesurer.
  2. Comme alternative, utilisez teer à base de spectroscopie impédante pour mesurer les jonctions étanches endothéliales par zone. La quantification de la barrière endothéliale à l’aide de TEER est un indicateur de l’intégrité de la couche endothéliale en tant que barrière.
    1. Placer deux électrodes dans l’entrée et la sortie des chambres supérieures et inférieures.
    2. Quantifier l’impédance du monocouche endothélial comme une combinaison des résistances, des inductances et des capacités dans la puce selon un modèle proposé par Srinivasan et al.28,29.

5. Semences de cellules cancéreuses dans l’appareil

  1. Après la couche endothéliale a mûri, les cellules cancéreuses de semence dans l’appareil. Préparer une solution de 1 mL de 1 x 106 cellules cancéreuses dans des cellules cancéreuses complètes.
  2. Échangez les supports dans la puce pour reconstituer les nutriments de la culture cellulaire.
  3. Ensemencez chaque canal de chambre supérieure avec 30 μL de cellules cancéreuses en suspension, puis placez l’appareil dans l’incubateur pendant 15 min. Ensemencez toujours les cellules cancéreuses du même côté des quatre canaux de chambre supérieure au sein d’un seul appareil.
  4. Échangez l’appareil avec de nouveaux supports et remplissez les conseils toutes les 12 heures jusqu’à ce que l’appareil soit photographié pour un comportement métastatique.

6. Image du micro-environnement tumoral par imagerie confocale

  1. Au temps expérimental souhaité (1, 2 ou 9 jours), utilisez l’imagerie confocale pour capturer une image 3D du canal. Nous effectuons cette étape sur un Nikon A1 en utilisant les paramètres décrits ici. Cette étape est automatisée, et chaque canal nécessite 20-40 min à l’image en fonction du nombre de canaux fluorescents sont inclus et la profondeur Z nécessaire pour couvrir les positions de toutes les cellules.
  2. Allumez le microscope, ouvrez le logiciel et placez le couvercle de l’incubateur sur le microscope.
  3. Réglez le chauffe-scène au microscope à 37 °C et au CO2 à 5 % si disponible.
  4. Une fois que l’incubateur de microscope s’est stabilisé, placez l’appareil au stade du microscope à l’aide de la monture de 50 mm x 75 mm.
  5. Concentrez-vous sur un côté de l’appareil (à gauche s’il doit être utilisé avec le logiciel d’analyse fourni) avec un objectif de 10x et définissez la hauteur Z comme zéro. Sous les paramètres de la pile z, inclure une plage de 100 μm au-dessus et de 200 μm en dessous du plan de mise au point. Utilisez ensuite le paramètre de couture pour définir le nombre de champs X et Y à 1 et 9 respectivement avec 15% de chevauchement. Placez le trou d’épingle à son minimum recommandé et la hauteur de la couche z à 9 μm. Réglez l’exposition du champ lumineux de sorte que la membrane poreuse soit visible. Allumez les lasers dsRed (561 nm) et GFP (488 nm) et réglez les puissances et les coupures laser fluorescentes afin que chaque canal soit visible sans surexposer les pixels.
  6. Vérifiez que tous les champs sont mis au point lorsqu’ils sont dépassés. Si c’est le cas, entrez un nom de fichier de sortie (001.nd2) pour l’image et démarrez l’expérience pour capturer automatiquement l’image confocale 3D.

7. Mesurer le micro-environnement tumoral par tomographie confocale

  1. Utilisez la tomographie confocale une approche pour estimer un ensemble de mesures et de mesures qui décrivent les cellules individuelles et le micro-environnement tumoral dans l’appareil. L’analyse tomographique confocale (figure 2) convertit une pile confocale en z-stack en une représentation tridimensionnelle des cellules. À l’aide d’un script python personnalisé dans l’environnement de bloc-notes/laboratoire Jupyter, un plan est ensuite apparié à la couche de cellules qui forment la barrière hémato-encéphalique comme la membrane30. Enfin, effectuer des mesures phénotypiques des populations de cellules cancéreuses (Tableau 1).
    1. Effectuez cette analyse à la fin d’une expérience ou sur un cours de temps. Installez python et les bibliothèques appropriées selon le guide logiciel référencé, puis ouvrez le logiciel à partir de Windows Command Prompt en exécutant la commande « conda activate », suivie par « laboratoire jupyter ». L’environnement Jupyter se charge dans le navigateur par défaut.
    2. De l’explorateur de fichiers Jupyter double cliquez sur le bloc-notes Jupyter « contom.ipynb » pour l’ouvrir. Exécutez la cellule sous le titre Importer des bibliothèques, des classes/fonctions personnalisées et configurer le bloc-notes en cliquant sur la cellule du bloc-notes, puis en cliquant sur le bouton lecture. Toutes les cellules de bloc-notes ci-dessous sont exécutées à l’aide de la même approche. Notez qu’ici le bloc-notes « ill » fait référence à un bloc de code python dans le bloc-notes Jupyter.
  2. Préparer les données. Cet algorithme utilise la boîte à outils de visualisation (VTK) pour manipuler et afficher les données z-stack et tridimensionnelles17.
    1. Placez le fourni . Fichier XLSX (« Experiment Tracker.xlsx ») dans le même dossier Windows que le bloc-notes Jupyter. Le fichier suit les expériences et les interfaces avec le bloc-notes Jupyter. Placez le fichier ND2 de la section 6 dans un sous-dossier appelé « \Experiment_XXX\Confocal\ » sous l’emplacement du bloc-notes Jupyter. Des dossiers d’expérience supplémentaires peuvent être ajoutés à l’intérieur en ajustant le « XXX » à l’ID numérique affecté à de nouveaux dossiers.
    2. Étiquetez le premier dossier d’expérience « Experiment_001 » et le fichier ND2 « 001.nd2 ». Tout d’abord, convertissez le fichier d’imagerie ND2 en un fichier TIFF multi-image cousu séparé par canal couleur. Pour ce faire, exécutez la cellule de bloc-notes sous le titre « Lire la pile confocale z dans la mémoire » avec la fonction Save_tiff_from_ND2 () non déclarée30. Le fichier ND2 est un format d’imagerie propriétaire de Nikon, il est donc nécessaire de le convertir à un format que le logiciel open source est compatible avec.
      REMARQUE : Le TIFF (Tag Image File Format) est utilisé parce qu’il est omniprésent, compatible 16 bits, facilement importé dans VTK, et plusieurs images peuvent être stockées dans un seul fichier, ce qui est approprié pour les images de la pile z. L’exécution de la cellule de bloc-notes se lit dans une image du fichier ND2, extrait des informations de la couleur et des positions XYZ, puis stocker cette image dans un tableau numpy selon une structure prédéterminée. Il enregistrera ensuite le tableau en tant que fichier TIFF à l’aide du tifffile de la bibliothèque python.
  3. Convertir les données d’imagerie en modèle 3D
    1. Importer le fichier TIFF dans VTK (vtkTIFFReader) à l’aide d’un rendu 3D pour visualiser les cellules (Figure 2). Sélectionnez un seuil en fonction de la couleur des cellules de l’image. Pour clarifier, l’objet VTK représente un bloc de pixels (X, Y, Z) dans l’espace (volume) mais seuls certains pixels (vert ou rouge) représentent les cellules, le reste est de fond ou de bruit (noir).
    2. Par conséquent, définissez un filtre d’opacité sur le volume qui enlève l’arrière-plan confirment que ce qui reste de fluorescence n’est que les cellules. Faites-le à l’aide de la cellule de bloc-notes Jupyter intitulée, Modifier les valeurs d’opacité pour chaque canal de microscope en ajustant les variables de valeur Channel_alpha (c.-à-d. GFP_alpha). Visualisez l’effet à l’aide de la cellule de bloc-notes intitulée Afficher un rendu 3D pour vérifier que le seuil est défini correctement.
    3. Enregistrez les valeurs d’opacité dans la feuille de calcul à utiliser à l’étape suivante. Convertir les données de volume en objets 3D individuels, chacun représentant une cellule dans l’image à l’aide d’une technique appelée cubes de marche31. Cet algorithme extrait un maillage polygonal d’une isosurface à partir de champs scalaires discrets tridimensionnels de voxels.
    4. Utilisez la valeur d’opacité dans l’algorithme des cubes de marche pour séparer chaque cellule de l’arrière-plan. Effectuez cette étape pour toutes les cellules fluorescentes identifiées dans chaque canal de microscope en exécutant Convertir l’image voxel en un maillage triangulaire et enregistrer comme un fichier VTK dans le bloc-notes.
  4. Montage d’un plan à la membrane
    1. Placez un plan à la barrière endothéliale en localisant d’abord les centroïdes cellulaires (cellule de bloc-notes : Analyser le canal RFP (barrière endothéliale)). Itérer à travers les mailles de liste dans le volume et extraire les régions qui ne sont pas connectés à l’aide d’un PolyDataConnectivityFilter de VTK. Calculer le centroïde de chaque maille et ajouter la mesure à une liste de centroïdes filtrant pour les mailles trop grandes ou trop petites (<50, >1000000 voxels).
    2. Placez un plan à la liste des centroïdes pour les cellules endothéliales à l’aide d’une méthode de minimisation de l’erreur (cellule de bloc-notes : Adapter un plan aux centroïdes de la DP (barrière endothéliale)) ( Figure2, Figure 3)32. Inspectez l’ajustement du plan en traçant le plan et les centroïdes et ajustez manuellement si nécessaire (en utilisant theta, beta et z) en exécutant la cellule de bloc-notes intitulée Visualize RFP centroids et plan fit.
    3. Une fois que l’avion est correctement installé, enregistrez la normale de l’avion dans le fichier Experiment Tracker . fichier XLSX pour une utilisation future.
  5. Analyser les caractéristiques descriptives des cellules cancéreuses individuelles pour les descripteurs suivants (Tableau 1).
    REMARQUE : Si l’ordinateur qui effectue l’analyse est à la traîne, l’analyse à haut débit via l’informatique haute performance est une option. Cet algorithme est utile sur les ordinateurs portables standard pour l’analyse d’un petit nombre de cellules, mais VTK n’est pas bien adapté à un grand nombre d’objets individuels (>1000). Par conséquent, il est facultatif d’utiliser l’algorithme adapté pour fonctionner sur un cluster informatique haute performance. Cela permet une analyse rapide des expériences avec de nombreuses cellules (Figure 2). Tout 7.5 est accompli en exécutant les cellules de bloc-notes intitulé Analyser les canaux de microscope restants pour les descripteurs phénotypiques et Lire dans les Experiment_tracker informations et d’analyser les canaux qui existent.
    1. Mesurer l’extravasation des cellules cancéreuses : Après avoir caractérisé la couche endothéliale avec un plan, mesurez le volume de chaque cellule cancéreuse qui a migré à travers la membrane. Couper chaque cellule (booléenne) de sorte que la maille sous la membrane soit conservée et que la partie au-dessus de la membrane soit enlevée33. Fermez ensuite le maillage ouvert (vtkFillHoles).
      1. Recalculer le centroïde normal et le nouveau de la maille coupée. Mesurer le volume et la position de chaque cellule cancéreuse coupée pour analyse. Le volume est équivalent au nombre de voxels que le maillage remplit de chaque cellule. Calculer la distance entre le plan endothélial et la position de chaque cellule cancéreuse.
    2. Mesurer le phénotype cellulaire : Calculer la morphologie de chaque cellule cancéreuse en tenant compte de sa forme, de son volume et de sa position.
  6. Validez les mesures et enregistrez-les dans une feuille de calcul ou une parcelle de calcul. Exécutez la cellule de bloc-notes intitulée Vérifier que les centroïdes ont été mesurés avec précision et un rendu apparaîtra montrant les centroïdes identifiés au-dessus du volume imaged par type de cellule. Une fois toutes les expériences effectuées, exportez l’ensemble de données complet en tant que fichier de feuille de calcul unique en tapant les expériences à inclure par ID dans la cellule de bloc-notes intitulée Exporter les données en tant que fichier de données unique.XLSX pour les expériences de variables remplaçant les ID d’expérience donnés. Si vous vérifiez le jeu de données terminé, tracez-le à l’aide de la cellule de bloc-notes intitulée Tracez extravasated strip plot. L’intrigue apparaîtra dans l’environnement du bloc-notes et enregistrera dans le fichier.

8. Analyser les caractéristiques connexes à l’aide de l’intelligence artificielle

REMARQUE : Identifiez les caractéristiques phénotypiques métastatiques à l’aide d’algorithmes d’intelligence artificielle.

  1. Effectuer la classification binaire à l’aide d’Orange selon le schéma indiqué à la figure 5 et au fichier supplémentaire 3. Démarrez Orange à partir d’une deuxième invite de commandes Windows en tapant « conda activate » suivi de « python-m Orange.canvas » et cliquez sur Nouveau de l’invite. Orange est un logiciel basé sur la traînée et la chute, alors arrangez les fonctions en faisant glisser chaque élément du menu gauche sur la toile pour correspondre au fichier supplémentaire 3. Une fois terminé, double cliquez sur l’icône Fichier et sélectionnez le fichier .XLSX données.
  2. Filtrer les données pour supprimer les mauvaises mesures, définies comme celles qui ont échoué à une opération booléenne ou donnant des valeurs variables paramétriques en dehors des limites connues à l’aide de l’icône « Sélectionner des lignes ». Double-cliquez sur l’icône et définissez des conditions qui correspondent au filtre telles que « La sphéricité se situe entre 0 et 1 ». Créer les conditions pour les 8.2.1, 8.2.2 et 8.2.3.
    1. Les mesures de distance de filtre s’étendent de -100-200 μm.
    2. Filtrer les mesures de sphéricité de la forme cellulaire à varier de 0-1.
    3. Les mesures du volume des cellules cancéreuses filtrent pour varier de 0 à 2000 voxels.
    4. Utilisez toutes les variables paramétriques (tableau 1) pour classer le MDA-MB-231-BR-GFP et le MDA-MB-231-GFP métastatique non cérébral. Double-cliquez sur l’icône Sélectionner des colonnes dans la toile. Utilisation du bouton > pour déplacer les variables disponibles dans les fonctionnalités, les variables ciblesou les attributs Meta. La seule variable qui doit être une variable cible est une étiquette métastatique qui définit si les cellules de l’ensemble de données sont considérées comme métastatiques (1) ou non (0). Les variables d’expérience peuvent être placées dans la section Meta Attributes.
  3. Échantillonner les données dans une formation (80 %) et l’ensemble d’essais (20 %). Doublez l’icône Échantillonneur de données et sélectionnez un type d’échantillonnage de la proportion de données fixes : défini à 80 % et activez les cases à cocher reproductibles et stratifis. Stratifier et recouper l’ensemble de formation à l’aide de 10 plis par rapport à chaque modèle/classificateur. Double-cliquez sur Test & Score et sélectionnez Validation croisée avec Nombre de plis : défini sur 10 et stratifié vérifié. Définissez la classe cible sur 1.
  4. Dans cette méthode, utilisez les réseaux neuronaux et les algorithmes d’apprentissage random forest car ils sont robustes aux données. Dans l’icône Forêt aléatoire, choisissez le nombre d’arbres à 50 et ne sélectionnez aucune autre option. Dans l’icône réseau neuronal, choisissez Neurones par laye cachér : 100, Activation : ReLu, Solver : Adam, Alpha : 0,0001, et Itérations Max : 200. Toutefois, ces paramètres varient considérablement selon les études et devraient être bien compris avant l’application.
  5. Après avoir mis en place la toile, double cliquez sur chaque icône du fichier à l’exemple de données, puis sur Appliquer ou envoyer des données. Double clic Test & Score et les données de formation commenceront à être utilisées pour développer un modèle à l’aide des algorithmes. Après la formation du modèle d’apprentissage automatique, ré-ouvrir Test & Score et sélectionner Test sur les données de test et fermer la fenêtre popup pour marquer les performances du modèle en classant les cellules dans la puce en fonction de la probabilité qu’ils sont métastatiques du cerveau de 0 à 1.
  6. Enregistrer les performances du modèle d’apprentissage automatique dans un fichier (Tableau 2). Inclure la zone sous la courbe (AUC) du ROC, la précision et le score de la F1. Enregistrez un deuxième fichier qui contient les indices métastatiques individuels et les probabilités de classification. Doublez l’icône Enregistrer et cliquez sur Enregistrer comme pour écrire pour classer les probabilités de classification. De même, la courbe ROC peut être visualisée en cliquant deux fois sur l’icône ROC Analysis et les performances du modèle peuvent être calculées en cliquant deux fois sur l’icône Confusion Matrix.

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Résultats

En utilisant cette technique, nous avons analysé les types de cellules étiquetés avec différentes protéines fluorescentes ou colorants. Nous démontrons l’utilisation de cette approche avec une puce μmBBN formulée avec des astrocytes hCMEC/D3-DsRed et non fluorescents. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau ont été ensemencées sur une membrane poreuse (5 pores gravés de voie de μm) et placées dans un incubateur34 à 37 °C sous 5% de CO2. Après trois jou...

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Discussion

Nous avons développé et présenté une nouvelle méthode qui adapte les outils souvent utilisés dans les analyses d’imagerie clinique pour la mesure de l’extravasation et la migration des cellules cancéreuses par une barrière endothéliale dans le tissu cérébral. Nous posons cette approche peut être utile pour les mesures in vivo et in vitro; nous avons démontré son utilisation sur un système microfluidique 3D récapitulant la vasculature de cerveau. Les mesures des cellules cancéreuses, y compris la dist...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de divulgation à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Laboratoire Steeg, à l’Institut national du cancer, pour le don généreux de cellules MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopie confocale a été réalisée à l’Institut des biointerfaces de l’Université du Michigan (BI). La cytométrie de flux a été exécutée au noyau de cytométrie de flux de l’université du Michigan. Les vecteurs viraux ont été créés par l’Université du Michigan Vector Core. Nous remercions également Kelley Kidwell pour ses conseils en analyse statistique de ces données.

Financement:

Le C.R.O. a été partiellement appuyé par une bourse de formation T-32 des NIH (T32CA009676) et 1R21CA245597-01. T.M.W. a été partiellement soutenu par 1R21CA245597-01 et le National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health sous le numéro de prix UL1TR002240. Le financement du matériel et de la caractérisation a été fourni par l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de prix 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, et la Fondation de recherche sur le cancer du sein. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

Références

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