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요약

여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 암 유형에 따라 ~ 5-20 개월의 중간 생존과 함께 뇌로 전이됩니다. 뇌 전이성 종양 부담을 줄이기 위해 기본 및 번역 지식의 격차를 해결해야합니다. 주요 과제는 재현 가능한 전임상 모델 및 관련 도구의 빈약성을 포함합니다. 뇌 전이의 3차원 모델은 전용 분석 도구와 결합될 때 이러한 요구를 해결하는 데 사용되는 관련 분자 및 페노티픽 데이터를 얻을 수 있습니다. 더욱이, 뮤린 모델에 비해, 뇌 마이크로환경으로 혈액뇌 장벽을 통과하는 환자 종양 세포의 장기-온-칩 모델은 결과를 빠르게 생성하고 정량적 방법으로 해석이 가능하므로 높은 처리량 테스트에 의존한다. 여기서 우리는 틈새 시장의 다중 요소가 장기간(며칠) 동안 배양될 수 있는 새로운 3D 미세 유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN) 플랫폼의 사용을 설명하고 시연하며, 공초점 현미경검사에 의해 형광으로 이미지되고, 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 사용하여 재구성된 이미지; 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경(TME)의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 TME 세포 및 유머 성분을 제조, 씨앗, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 인공 지능 (AI)이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위의 객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용되는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이에 대한 기본 및 번역 적 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다, 치료 전략의 효능, 둘 다에서 TME의 역할.

서문

뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 뇌로 전이되고, 암 유형1에따라 5-20개월의 중간생존율로, 1,2. 암 전이를 연구할 때 발생하는 주요 질문은 서브 클론이 혈류의 유머 환경에서 뇌3,,4와같은 기관으로 이동하는 방법입니다. 이 질문은 이주, 침략 및 사치스러운 에세이의 많은 변형으로 이어졌습니다. 이러한 모든 방법은 자극에 대한 응답으로 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 셀의 특성을 계산하거나 측정하는 중요한 단계를 공유합니다. 쉽게 구할 수 있는 대부분의 이주 소는 암세포의 2차원 (2D) 이동을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이들은 풍부한 지식을 해명했다. 그러나, 그들은 다른 방법이 제공할 수 있는 생체 내 시스템의 입체적 특성을 회수하지 않는다5. 따라서 3차원(3D) 시스템에서 종양 미세 환경(TME)을 연구할 필요가 있지만 3D 구조에 사용할 수 있는 분석 접근법은 제한적이고 종종 일치하지 않는다.

가장 인기있는 3D 도구 중 하나는 두 개의 별개의 영역을 분리, 우물의 바닥에 중단 막으로 구성된 보덴 챔버입니다. 보이덴은 백혈구 화학요법4를연구하기 위해 분석법을 도입했다. 상기 하부 영역은 화학 또는 다른수단6,,7이 상부 부위에서 세포를 유도하여 하부 영역으로 이동하도록 유도함으로써 변화될 수 있다. 마이그레이션된 세포의 수를 정량화하는 가장 일반적인 접근법은 완충액을 사용하여 멤브레인의 바닥에서 세포를 방출하고, 이를 lyse한 다음, 용액7에서DNA 함량의 양에 기초하여 세포를 계산하는 것이다. 이러한 간접적인 접근법은 기술 적 변동성으로 인해 운전자 오류가 발생하기 쉬우며 절차는 암 표현형 및 마이크로 환경에 대한 정보를 파괴합니다. 보덴 챔버 분석의 변화는 막에 남아 있는 철새 세포의 고정을 포함하지만, 지속적인 연구를 위해 더 이상 실행 가능한 세포의 수를 제공합니다6,,8,,9.

보덴 챔버의 한계와 미세 유체 지역 사회에서 혁신의 성장으로 인해, 이주 분석 칩은 3개의 10,,11,,12가아닌 한 방향으로 자극에 대응하여 세포의 움직임을 관찰하는 개발되었습니다. 이러한 마이그레이션 해석은 결과의 더 나은 해석을 가능하게 하는 흐름 또는 단세포분리(13,14)와14 같은 요인에 대한 제어를 용이하게 한다. 그러나 2D 형식은 필연적으로 동적 정보를 잃게 됩니다. 최근 연구는 3D 환경에서 사치(즉, 혈액 뇌 장벽과 같은 조직으로 순환에서 세포의 이동)에 초점을 맞추고 있다14,,15. 세포 장벽/멤브레인에서 발생하는 조직 및 프로빙 거동으로의 사치거리는 보덴 챔버 또는 2D 미세 유체 이동장치(16)를사용하여 수집된 측정보다 더 정제된다. 따라서 3D 사치에 대한 적절한 이미징 및 분석을 가능하게 하는 장치는 이러한 정교한 측정을 캡처하는 데 매우 중요하지만 문헌에는 부족합니다.

이주 와 무관하게, 강력한 이미징 기술은 3D 공간17,,18에서조직을 식별하고 정확하게 재구성할 수 있는 자기 공명 영상(MRI) 및 단층 촬영을 위해 개발되었다. 이러한 기술은 조직의 특성에 기초하여 이미지의 z 스택 및 세그먼트 부분에서 이미지를 수집한 다음 분할된 이미지를 3차원 메쉬19,,20,,21로변환한다. 이를 통해 의사는 3D 개별 장기, 뼈 및 혈관을 시각화하여 수술 계획에 도움을 주거나 암 또는 심장 질환 의 진단에 도움을 주거나22,,23을할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 접근이 현미경 견본 및 3D 사치 장치에 사용하기 위해 적응될 수 있다는 것을 보여줄 것입니다.

이를 위해, 우리는 기존의 단층 촬영 도구를 적응하여 멤브레인을 통해 종양 세포의 사치를 연구할 수 있는 유연성을 제공하는 본원에 제시된 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 개발했습니다. 이 접근은 내피 세포 층과 같은 세포 장벽과 상호 작용할 때 암 세포 행동의 전체 영역의 연구를 가능하게 합니다. 암세포는 탐구 행동을 나타낸다; 일부는 침입할 수 있지만 멤브레인에 가깝게 남아 있는 반면, 다른 사람들은 장벽을 쉽게 통과합니다. 이 기술은 모든 차원에서 셀의 표현형에 대한 정보를 산출할 수있다(24). TME를 연구하기 위하여 이 접근법을 사용하는 것은 생체 내 murine 모형에 있는 더 복잡한에 비교될 때, 상대적으로 저렴하고, 해석하기 쉽고, 재현할 수 있습니다. 제시된 방법론은 기질 영역을 적응시킴으로써 많은 유형의 종양 및 미세 환경의 연구를 위한 강력한 기초를 제공해야 합니다.

3D 미세유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN)플랫폼(그림 1)의사용을 설명하고 시연하며, 장벽과 틈새(뇌 미세혈관 내피 세포 및 성상세포)의 중요한 원소가 장기간 배양될 수 있는 곳(약 9일), 공초점 미세검사에 의해 형광을 배양하고, 공초점 마이크로카피에 의해 배양된형광(2)을사용하여 재초점한 이미지를 사용하여 재구성됨); 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 뇌 틈새 와 혈액 뇌 장벽 인터페이스는 지하 막에 의해 강화되는 뇌 미세 혈관 내피 세포로 구성되어, 성상세포 발, 및 pericytes25. 우리는 혈액 뇌 장벽의 형성과 조절에 중요성을 감안할 때 성상 세포및 내피 성분에 선택적으로 집중했습니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 종양 미세 환경 세포 및 유머 성분을 제조, 종자, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 기계 학습이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위24의객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이, 치료 전략 및 둘 다에서 TME의 역할에 대한 기본 및 번역 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 혈액 뇌 장벽 틈새 금형을 준비

참고 : 이 플랫폼에서 사용되는 배양 장치는 우리가 세포 혈액 뇌 장벽 틈새 시장을 구축하는 PDMS 기반의 비계입니다. 다공성 멤브레인으로 분리된 두 부분으로 만들어집니다. 혈액 뇌 장벽을 준비하려면 포토리소그래피를 사용하여 만든 두 개의 SU-8 금형이26,,27이필요하다. 프로토콜은 먼저 100 μm 두께의 금형에 대해 설명된 다음 200 μm 두께의 금형에 대한 메모가 주어집니다.

  1. 금형을 준비하려면 스퀴즈 병으로 아세톤을 사용하여 4" 실리콘 웨이퍼를 청소한 다음 질소 총으로 건조시다.
    1. 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 200 °C에서 10 분 동안 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 구울 수 있습니다.
    2. 차례로 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터의 척에 중앙을 가졌고 상단 금형용 SU8-2075의 1mL을 분배합니다. 500 rpm (가속 300 rpm /s)에서 5 s로 회전하면 포토 레지스트를 분산시키고 2200 rpm (가속 300 rpm /s)에서 30 초로 100 μm 두께의 SU-8 코팅을 얻습니다. 지정된 두께를 달성하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다.
  2. 65°C에서 65°C의 핫플레이트에서 웨이퍼를 2분간 부드럽게 구운 다음 98°C에서 20분 동안 즉시 굽습니다.
  3. 웨이퍼를 포토리소그래피 램프에 넣고 표준 절차에 따라 마스크를 웨이퍼에 배치합니다. UVB의 230mJ/cm 2(360nm ± 10nm)의 광채로 SU-8 코팅 웨이퍼를 노출합니다.2 노출 매트릭스 실험은 최적의 투여량을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 마스크 디자인은 보충 파일 1에서사용할 수 있습니다.
  4. 65°C에서 2분 동안 즉시 98°C에서 10분간 굽는 후 접착력을 개선합니다. 웨이퍼를 50°C로 식힙니다.
  5. SU-8 사진 개발자를 사용하여 노출되지 않은 저항을 제거합니다. 목욕에서 5 분 동안 개발자의 웨이퍼를 헹구고 화학 후드에 SU-8 개발자로 채워진 스프레이 병을 사용하여 나머지 치료되지 않은 SU-8을 교반하고 제거하십시오. 4배 현미경을 사용하여 모든 치료되지 않은 SU-8이 제거되었는지 관찰할 수 있습니다. 포토레지스트 피쳐 의 가장자리에 있는 흰색 선은 SU-8이 완전히 제거되지 않았다는 것을 나타냅니다.
  6. 60 분 동안 110 °C에서 오븐에서 마지막 하드 베이크를 수행합니다.
  7. SU-8 2075를 사용하여 200 μm 두께의 금형에 대해 동일한 절차를 따르지만 프로토콜을 다음과 같은 것으로 조정하십시오.
    1. 스핀 코터 설정 : 500 rpm (가속 300 rpm / s)에서 5 s를 회전하여 포토 레지스트를 분산시키고 1300 RPM (가속 300 rpm /s)에서 30 초를 분산하여 200 μm 두께의 코팅을 얻습니다.
    2. 65°C에서 2분 동안 부드러운 베이킹을 한 다음 98°C에서 40분 동안 굽습니다.
    3. 340 mJ /cm2의노출 시간 .
    4. 노출 후 굽기: 65°C에서 2분, 15분 동안 98°C.
  8. 마지막으로, 실라닉 용액(Trichloro perfluoro octyl silane)의 3방울(~150 μL)을 배치한 플라스틱 용기로 화학 후드 내부의 진공 챔버에 배치하여 각 웨이퍼를 실란화한다. 진공을 당기고 증기가 웨이퍼를 코팅할 수 있도록 밤새 둡니다. 이 단계는 SU-8과 PDMS 사이의 접착력을 감소시켜 금형의 수명을 증가시킵니다.
    주의: 트리클로로 퍼플루오로칭틸 실레인은 항상 연기 후드에서 처리되어야 하며 수원에서 멀리 떨어져 있어야 합니다.
  9. 양면 테이프 2개를 사용하여 개별 웨이퍼 몰드를 150mm 페트리 접시에 넣습니다. 웨이퍼가 평평해 있는지 확인합니다. 대안은 웨이퍼를 배치 할 수있는 알루미늄 금형을 제조하는 것입니다. 알루미늄 금형이 밀폐되어 있기 때문에 균일한 두께의 캐스트를 생성하며, 페트리 접시 방법은 표면의 기울기에 민감하게 배치됩니다. PDMS 캐스트의 평탄도가 개선되면 다운스트림 공초점 이미징 시간이 줄어듭니다.

2. PDMS 혈액 뇌 장벽 (BBB) 장치를 형성하고 조립

  1. 플라스틱 컵의 무게로 1:10 (크로스 링커 : 베이스)의 비율로 PDMS 75 g을 혼합합니다.
  2. PDMS를 금형(두께 200μm 두께의 1mm 두께의 경우 1mm, 두께 100μm 두께의 금형의 경우 4mm)를 1시간 동안 진공 건조기또는 모든 기포가 제거될 때까지 디가스를 붓습니다. 하룻밤 사이에 65 °C 오븐에 놓습니다. 1mm 두께는 공초점 현미경에서 10x 목표의 작동 거리에 따라 조절될 수 있다.
  3. PDMS가 경화 한 후 블레이드를 사용하여 가장자리 주위의 PDMS를 통해 웨이퍼에 대해 부드럽게 자릅니다. PDMS를 벗겨 내고 블레이드를 사용하여 직사각형 가이드와 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 장치의 입구와 콘센트를 엽니다. 48mm 너비의 포장 테이프로 PDMS 장치 부품을 덮어 먼지와 이물질로부터 깨끗하게 유지합니다.
  4. 다음으로 해부 가위를 사용하여 5 μm 모공을 가진 폴리 카보네이트 멤브레인의 5mm x 50mm 직사각형을 자르고 나중에 사용할 수 있도록 페트리 접시 안에 보관하십시오.
  5. 다음 을 수집 : 200 μL 파이펫 팁, 유리 유리 병에서 2 :3의 비율로 톨루엔과 혼합 1:10 PDMS의 2 mL, 압착 전구와 파스퇴르 파이펫, 준비 PDMS 상부 및 하부 부품, 멤브레인, 세 50mm x 75mm 유리 슬라이드및 코팅 스핀에 모든 수송. 장치의 조립 및 셀 시드에 대한 다음 단계는 그림 1에묘사됩니다.
  6. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 1mL의 PDMS:톨루엔 접착제 용액을 스핀 코터의 척에 50mm x 75mm 유리 슬라이드로 옮기세요. 100 rpm (가속 300 rpm /s)에서 5 초 동안 회전하고 2000 rpm에서 30 초 동안 회전하십시오 (가속 300 rpm / s).
  7. 테이블에 슬라이드를 놓고 하나의 PDMS 상부 챔버와 하나의 하부 챔버로 커버하여 PDMS 면이 성형 된 피쳐가 슬라이드에 접촉하고 접착제가 PDMS 면으로 전달되어 모든 피처의 둘레를 간략하게 설명합니다.
  8. PDMS 상부 챔버를 접착제 코팅으로 다른 슬라이드에 뒤집어 입구와 콘센트 사이의 장치에 멤브레인을 조심스럽게 배치합니다. 200 μL 팁을 PDMS:톨루엔 접착제 용액에 넣고 일부 팁을 사악하게 할 때까지 놓습니다. 각 입구와 콘센트 사이의 끝을 터치하여 PDMS에 접촉하는 멤브레인의 가장자리 근처에 작은 방울을 놓습니다.
  9. 장치의 나머지 절반을 제거하고 두 부품의 입구와 콘센트를 정렬하면서 접착제 코팅으로 배치합니다.
  10. 조립된 장치를 밤새 37°C의 오븐에 넣고 접착제를 치료합니다. 건조제와 진공 벨 항아리로 전송하고 이틀 동안 탈수하자. 이는 Toluene이 증발하고 실험실 공기에서 흡수된 수증기를 조절하여 장치를 파종하는 일관성을 향상시키는 중요한 단계입니다.

3. 뇌 마이크로 환경을 장치에 씨앗

  1. 세포 배양 및 시약: 이 프로토콜을 시작하기 전에 다음 시약 및 세포를 얻습니다. 37°C에서 37°C로 설정된 인큐베이터에서 모든 세포주를 5% CO2로육성한다.
    1. 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) 및 MDA-MB-231-BR-GFP 세포 (패트리샤 Steeg에서 얻은, 박사) DMEM에 4.5 g/L 포도당, 2 m M M L-글루타민, 10% FBS 및 1x 항생제 항균제로 보충. 빈 벡터 pLL-EV-GFP 렌티바이러스로 MDA-MB-231 세포를 변환하여 MDA-MB-231-GFP 형광 세포를 생성합니다. 실험 전에 형광 활성화 셀 정렬(FACS)을 사용하여 변환된 GFP+ 인구를 정렬합니다.
    2. EGM-2 배지에서 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포 hCMEC/D3를 유지한다. 빈 벡터 pLL-3.7-dsRed 렌티바이러스로 hCMEC/DsRed 형광 세포를 변환하여 hCMEC/DsRed 형광 세포를 만듭니다. 실험용 사용 전에 FACS를 사용하여 배양에서 모든 비유도 비형광 세포를 제거합니다.
    3. DMEM에서 정상적인 인간 성상세포(NHA)를 유지하여 4.5g/L 포도당, 10% FBS, 2mM 글루타맥스, 1mM 나트륨 피루바테, 1x N-2 성장 보충제, 1x 항생제 항진균제를 보충한다. pLOX-TERT-iresTK 렌티바이러스 벡터(Addgene 12245)를 변환하여 성상세포를 불멸시화한다. 플라스미드 psPAX2 및 봉투 플라스미드 pMD2.G(Addgene 12260 및 12259)를 사용하여 벡터를 만듭니다.
  2. 진공 건조기에서 μmBBN 장치를 제거하고 입구가 아래로 향하고 있는 금속 또는 종이(즉, 테이프) 표면에 놓고 플라즈마 챔버에 놓습니다. 또한 플라즈마 챔버에 50mm x 75mm 유리 슬라이드를 배치합니다. 진공을 당긴 다음 플라즈마로 80W에서 30s로 처리합니다.
  3. 플라즈마 챔버에서 유리 슬라이드 및 장치를 신속하게 제거하고 안내서(보충파일 2)를사용하여 정렬된 유리 슬라이드위에 인렛이 있는 장치를 배치합니다. 이렇게 하면 PDMS와 유리 슬라이드 사이에 영구적인 결합이 생성되며 다시 배치할 수 없습니다.
  4. 다음으로 팁16, 200 μL 파이펫 팁, 팁에서 2mm를 잘라냅니다. 파이펫 팁을 모든 입구와 콘센트에 삽입합니다. 장치를 이 시점에서 진공 건조기에 다시 배치할 수 있습니다.
  5. 장치를 플라즈마 챔버에 다시 놓고 200 W에서 8 분 동안 플라즈마로 치료하십시오. 장치가 플라즈마 처리로부터 5분(5분) 냉각된 후 투명 파이펫 팁 박스와 같은 멸균 보조 용기 내부에 배치한다. ~15분 이내에 다음 단계를 수행하거나 플라즈마 처리의 효과가 감소되어 막힘으로 이어질 수 있다.
  6. 실험 배양 며칠 전에 1 x 106 내피 세포 (hCMEC/D3-DsRed) 및 1 x 106 성상 세포 (NHA)의 Petri 접시. 이 장치는 8분 플라즈마 처리를 진행하는 동안, 0.5mL의 3 mg/mL PureCol 타입 I 소 콜라겐으로 구성된 콜라겐 용액을 준비하여 0.8 M NaHCO3 및 20 μL의 10x 고혈당(250mMMM) MEM을 갖는다. 콜라겐 용액에서 5.0 x 105 NHA 세포를 일시 중단합니다. 사용하지 않는 동안 얼음에 대한 솔루션을 유지합니다.
  7. 콜라겐/성상세포/마이크로글리아 용액의 120μL을 하단 챔버의 파이펫 팁을 통해 장치로 이송한다(그림1 적색 화살표). 용액이 챔버를 가로질러 반대 쪽 파이펫 팁으로 심을 수 있도록 합니다. 장치의 모든 4개의 채널이 채워진 후에 는 CO2 인큐베이터에 칩을 37°C, 5%CO2에서 1h 또는 콜라겐이 설정될 때까지 배치하였다.
  8. 콜라겐 세트 후, 전체 미디어의 혼합물로 하단 챔버를 공급하는 모든 파이펫 팁을 채웁니다. 내피 세포와 성상 세포를 포함하는 칩의 경우 내피 : 성상 세포 의 50:50 혼합이 사용됩니다.
  9. 상부 챔버를 2% 성장인자로 코팅하여 상부 챔버 파이펫 팁(도 1 블루화살표)을사용하여 완전한 내피 질 매체에서 트리겔을 감소시키고 1시간 동안 인큐베이터에 배치한다.
  10. 표시된 미디어 혼합물로 상부 챔버를 헹구고 어떤 팁이 내피 세포로 시드되는 대체(그림 1 녹색 화살표). 내피 성 매체의 1 mL에서 1 x 106 내피 세포를 중단하고 15 분마다 30 μL을 교대로 상부 챔버 팁을 번갈아 하여 균일한 커버리지를 제공합니다. 각 상체 팁에 내피 세포를 두 번, 챔버 당 총 4 회.
  11. 내피 세포의 최종 파종 후, 모든 팁을 미디어 혼합물로 채우고 37°C 및 5%CO2의인큐베이터에 장치를 배치하여 매 12h마다 양 챔버에서 미디어를 변화시다.

4. 내피 층 형성의 진행을 모니터링

  1. 내피층에 의한 채널의 완전한 커버리지는 3일 후에 관찰된다. 내피 장벽의 적용 범위를 모니터링하는 두 가지 방법 중 하나를 사용하십시오: 형광 또는 TEER. hCMEC/D3-DsRed 형광 및 채널 영역 전반에 걸친 % 커버리지는 ImageJ를 사용하여 정량화될 수 있다.
    1. hCMEC/D3-DsRed 장벽의 ImageJ 담당자에서 TIFF 파일을 엽니다. ImageJ 소프트웨어에서 파일 > 열기를 클릭하여 파일을 선택합니다.
    2. 이미지 > 스택 > Z 프로젝트 > 모든 Z 슬라이스, 최대 강도: 이러한 주요 명령 및 옵션다음 최대 강도를 사용하여 이미지의 모든 Z 레이어를 병합합니다.
    3. 이 방법을 사용하여 평가된 모든 미세 유체 칩에서 동일한 색상 임계값을 수행합니다. 제시된 연구 결과에 대 한 우리는 450의 임계값을 사용. ImageJ에서 임계값 메뉴를 사용하십시오: 이미지 > 조정 > 임계값.
    4. 다음 명령 및 옵션을 사용하여 기록할 측정을 설정합니다: 분석 및 gt; 측정 설정 > 임계값제한, 영역 분수.
    5. 마이크로 유체 채널의 대표 영역을 선택하여 상자를 그려 측정합니다. 상자 도구는 ImageJ의 메인 메뉴에 있습니다. 동일한 상자 크기를 사용하여 각 미세 유체 채널의 시작, 중간 및 끝에 위치한 3개의 기술 복제를 측정합니다.
    6. 각 채널을 분석하고 영역 분획을 기록하여 % 내피 커버리지를 나타냅니다. 이러한 측정값을 스프레드시트 파일로 내보내 다음 명령을 사용하여 데이터를 플롯하고 시각화합니다.
  2. 대안으로 임피던스 분광법 기반 TEER을 사용하여 지역당 내피 팽팽한 접합을 측정합니다. TEER를 사용하여 내피 장벽의 정량화는 내피 층의 무결성을 장벽으로 하는 프록시입니다.
    1. 상부 및 하부 챔버의 입구 및 출구에 두 개의 전극을 배치합니다.
    2. 스리니바산 외28,,29에의해 제안된 모델에 따라 칩내내피소 단층의 임피던스를 내피성 단층의 조합으로서 정량화한다.

5. 종자 암세포가 장치에

  1. 내피층이 성숙한 후, 종자 암세포를 장치로 내다한다. 완전한 암세포 매체에서 1 x 106 암세포의 1mL 용액을 준비한다.
  2. 칩내의 미디어를 교환하여 세포 배양 영양소를 보충합니다.
  3. 각 상단 챔버 채널을 현탁액에 30 μL의 암세포로 시드한 다음 장치를 인큐베이터에 15분 동안 다시 놓습니다. 항상 단일 장치 내에서 모든 4 개의 상위 챔버 채널의 동일한 측면에 암 세포를 시드.
  4. 장치를 새 미디어와 교환하고 장치가 전이성 동작으로 이미지될 때까지 12시간마다 팁을 다시 채웁니다.

6. 공초점 영상에 의한 종양 미세 환경을 이미지

  1. 원하는 실험 시점(1, 2 또는 9일)에서 공초점 이미징을 사용하여 채널의 3D 이미지를 캡처합니다. 여기에 설명된 설정을 사용하여 Nikon A1에서 이 단계를 수행합니다. 이 단계는 자동화되며 각 채널은 모든 세포의 위치를 커버하는 데 필요한 형광 채널 수와 Z 깊이에 따라 이미지에 20-40 분이 필요합니다.
  2. 현미경을 켜고 소프트웨어를 열고 인큐베이터 커버를 현미경에 배치합니다.
  3. 현미경 단계 히터를 37°C로 설정하고CO2 ~5%를 사용할 수 있습니다.
  4. 현미경 인큐베이터가 안정화된 후 50mm x 75mm 마운트를 사용하여 장치를 현미경 단계에 배치합니다.
  5. 10배 의 목표와 함께 장치의 한쪽(제공된 분석 소프트웨어와 함께 사용할 경우 왼쪽)에 초점을 맞추고 Z 높이를 0으로 설정합니다. z 스택 설정 에서, 위의 100 μm및 초점 평면 아래 200 μm의 범위를 포함한다. 그런 다음 스티치 설정을 사용하여 X 및 Y 필드 수를 각각 1및 9로 설정하여 15%가 겹칩니다. 핀홀을 권장 최소값으로 설정하고 z 층 높이를 9μm로 설정합니다. 다공성 멤브레인이 보이면 밝은 필드 노출을 조정합니다. dsRed(561nm) 및 GFP(488 nm) 채널에 대한 흥분 레이저를 켜고 형광 레이저 파워와 컷오프를 조정하여 각 채널이 픽셀을 과도하게 노출하지 않고 볼 수 있도록 합니다.
  6. 단계별 모든 필드에 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. 그렇다면 이미지에 대한 출력 파일 이름(001.nd2)을 입력하고 실험을 시작하여 3D 공초점 이미지를 자동으로 캡처합니다.

7. 공초점 단층 촬영을 통해 종양 미세 환경을 측정

  1. 공초점 단층 촬영을 사용하여 장치 내의 개별 세포 및 종양 미세 환경을 설명하는 메트릭 및 측정 세트를 추정합니다. 공초점 지형분석(도 2)은공초점 z-스택을 세포의 3차원 표현으로 변환한다. Jupyter 노트북/실험실 환경 내에서 사용자 지정 파이썬 스크립트를 사용하여 평면은 멤브레인30과같은 혈액 뇌 장벽을 형성하는 세포의 층과 일치합니다. 마지막으로, 암세포 집단의 현상측정(표1)을만든다.
    1. 실험이 끝나거나 시간 과정을 통해 이 분석을 수행합니다. 참조된 소프트웨어 가이드에 따라 파이썬 및 적절한 라이브러리를 설치한 다음 Windows 명령 프롬프트에서 "conda 활성화"라는 명령을 실행한 다음 "jupyter lab"을 실행하여 소프트웨어를 엽니다. Jupyter 환경은 기본 브라우저 내에서 로드됩니다.
    2. Jupyter 파일 탐색기에서 Jupyter 노트북 "contom.ipynb"를 두 번 클릭하여 엽니다. 제목 가져오기 라이브러리 아래 셀을 실행하고, 사용자 지정 클래스/함수를 만들고, 노트북 셀을 클릭한 다음 재생 버튼을 클릭하여 전자 필기장을 설정합니다. 아래의 모든 노트북 셀은 동일한 접근 방식을 사용하여 실행됩니다. 여기서 노트북 "셀"은 Jupyter 노트북 내의 파이썬 코드 블록을 나타냅니다.
  2. 데이터를 준비합니다. 이 알고리즘은 시각화 도구 키트(VTK)를 사용하여 z 스택 및 3차원데이터(17)를조작하고 표시합니다.
    1. 제공된 을 배치합니다. JUpyter 노트북과 동일한 창 폴더에 있는 XLSX 파일("실험 추적기.xlsx"). 파일은 Jupyter 노트북과의 실험 및 인터페이스를 추적합니다. ND2 파일을 섹션 6의 "\Experiment_XXX\Confocal\"라는 하위 폴더에 주피터 노트북 위치 아래에 놓습니다. 새 폴더에 할당된 숫자 ID에 "XXX"를 조정하여 내부의 추가 실험 폴더를 추가할 수 있습니다.
    2. 첫 번째 실험 폴더 "Experiment_001"과 ND2 파일 "001.nd2"에 레이블을 지정합니다. 먼저 ND2 이미징 파일을 컬러 채널로 구분된 스티치다이미지 TIFF 파일로 변환합니다. 제목 아래의 노트북 셀을 실행하여 "공초점 z 스택을 메모리에 읽기"Save_tiff_from_ND2 () 함수 주석이30을실행하여 이렇게하십시오. ND2 파일은 Nikon의 독점 이미징 형식이므로 오픈 소스 소프트웨어와 호환되는 형식으로 변환해야 합니다.
      참고: TIFF(태그 이미지 파일 형식)는 유비쿼터스, 16비트 호환, VTK로 쉽게 가져오고 여러 이미지를 단일 파일에 저장할 수 있으므로 사용되며, 이는 z 스택 이미지에 적합합니다. 노트북 셀을 실행하는 것은 ND2 파일에서 이미지로 읽고, 색상 및 XYZ 위치의 정보를 추출한 다음 미리 결정된 구조에 따라 해당 이미지를 numpy 배열에 저장합니다. 그런 다음 파이썬 라이브러리 티프파일을 사용하여 배열을 TIFF 파일로 저장합니다.
  3. 이미징 데이터를 3D 모델로 변환
    1. 3D 렌더링을 사용하여 TIFF 파일을 VTK(vtkTIFFReader)로 가져와 셀을 시각화합니다(그림2). 이미지의 셀 색상을 기반으로 임계값을 선택합니다. 명확히 하기 위해 VTK 오브젝트는 공간(볼륨)에서 픽셀 블록(X, Y, Z)을 나타내지만 특정 픽셀(녹색 또는 빨간색)만 셀을 나타내고 나머지는 배경 또는 노이즈(black)입니다.
    2. 따라서 배경을 제거하는 볼륨에 불투명도 필터를 설정하면 형광이 남아 있는 것이 세포일 뿐임을 확인합니다. Channel_alpha 값 변수(즉, GFP_alpha)를 조정하여 각 현미경 채널의 불투명도 값을 변경이라는 Jupyter 노트북 셀을 사용하여 이 작업을 수행합니다. 3D 렌더링 보기라는 노트북 셀을 사용하여 효과를 시각화하여 임계값이 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다.
    3. 다음 단계에서 사용할 스프레드시트에 불투명도 값을 저장합니다. 볼륨 데이터를 개별 3D 개체로 변환하고 각 개체는 행진큐브(31)라는기술을 사용하여 이미지의 셀을 나타냅니다. 이 알고리즘은 복셀의 3차원 이산 스칼라 필드에서 등쪽의 다각형 메시를 추출합니다.
    4. 행진 큐브 알고리즘의 불투명도 값을 사용하여 각 셀을 백그라운드에서 분리합니다. 변환 복셀 이미지를 삼각형 메시로 실행하고 노트북에서 VTK 파일로 저장하여 각 현미경 채널에서 식별된 모든 형광 세포에 대해 이 단계를 완료하십시오.
  4. 멤브레인에 평면 피팅
    1. 먼저 셀 중심을 찾아 내피 장벽에 평면을 맞춥니다(노트북 셀: RFP 채널(내피 장벽분석). 볼륨의 목록 메싱을 반복하고 VTK의 PolyDataConnectivityFilter를 사용하여 연결되지 않은 영역을 추출합니다. 각 메시의 센트로이드를 계산하고 너무 크거나 너무 작은 메시에 대한 센트로이드 필터링 목록에 측정값을 추가합니다(&50; >1000000 voxels).
    2. 오류 방법의 최소화를 이용하여 내피 세포에 대한 중도세포 목록에 평면에 맞춥니다(노트북 셀: RFP 중심형 장벽(내피 장벽)에 평면에맞습니다)(도2, 도 3)32. 비행기와 센트로이드를 플로팅하여 평면의 적합성을 검사하고 필요한 경우 수동으로 조정(테타, 베타 및 z 사용) 노트북 셀을 실행하여 RFP 중심및 평면 핏을 시각화합니다.
    3. 평면이 제대로 장착된 후 비행기의 정상을 실험 추적기 파일에 저장합니다. XLSX 파일은 향후 사용.
  5. 다음 설명자(표1)에대한 개별 암세포의 설명적 특징을 분석한다.
    참고: 분석을 수행하는 컴퓨터가 지연되는 경우 고성능 컴퓨팅을 통한 높은 처리량 분석이 옵션입니다. 이 알고리즘은 소수의 셀을 분석하기 위해 표준 랩톱에 유용하지만 VTK는 많은 수의 개별 개체(>1000)에 적합하지 않습니다. 따라서 적응된 알고리즘을 사용하여 고성능 컴퓨팅 클러스터에서 작동하는 것은 선택 사항입니다. 이를 통해 많은 세포를 가진 실험의 신속한 분석을 가능하게한다(그림 2). 7.5의 모든 것은 페노티픽 설명자의 나머지 현미경 채널을 분석하고 Experiment_tracker 정보에서 읽고 존재하는 채널을 분석하는 제목의 노트북 세포를 실행하여 달성된다.
    1. 암세포의 사치를 측정: 평면으로 내피층을 특성화한 후 멤브레인을 통해 이주한 각 암세포의 부피를 측정합니다. 각 셀(Boolean)을 잘라 멤브레인 아래의 메쉬가 유지되고 멤브레인 위의 부분이33을제거되도록 한다. 그런 다음 열린 메시(vtkFillHoles)를 닫습니다.
      1. 잘린 메시의 정상 및 새 중심을 다시 계산합니다. 분석을 위해 각 잘린 암세포의 부피와 위치를 측정합니다. 볼륨은 각 단일 셀의 메시 채우기의 복셀 수와 동일합니다. 각 암세포의 내피 평면과 위치 사이의 거리를 계산합니다.
    2. 세포 표현형을 측정: 모양, 부피 및 위치를 고려하여 각 암세포의 형태를 계산합니다.
  6. 측정을 검증하고 스프레드시트 또는 플롯에 저장합니다. 제목으로 된 노트북 셀을 실행하여 센트로이드를 정확하게 측정하고 렌더링이 셀 유형별로 이미지 된 볼륨 위에 식별 된 센트로이드를 나타내는 팝업됩니다. 모든 실험이 완료된 후 특정 실험 ID를 대체하는 변수 실험에 대해 데이터를 단일 데이터.XLSX 내보내기라는 노트북 셀에 ID에 포함할 실험을 입력하여 전체 데이터 세트를 단일 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 완료된 데이터 집합을 확인하면 [거리 사치] 스트립 플롯이라는노트북 셀을 사용하여 플롯합니다. 플롯이 전자 필기장 환경에 나타나고 파일에 저장됩니다.

8. 인공 지능을 사용하여 관련 특성 분석

참고: 인공 지능 알고리즘을 사용하여 전이성 현상 전이성 피노트피 기능을 식별합니다.

  1. 그림 5 및 보충 파일 3에 표시된 방식에 따라 주황색을 사용하여 이진 분류를 수행합니다. "conda 활성화"를 입력하여 두 번째 Windows 명령 프롬프트에서 주황색을 시작하고 "파이썬 -m Orange.canvas"를 입력하고 프롬프트에서 새를 클릭합니다. 주황색은 드래그 앤 드롭 기반 소프트웨어이므로 각 항목을 왼쪽 메뉴에서 캔버스에 드래그하여 추가 파일 3에맞게 함수를 정렬합니다. 그 후 파일 아이콘을 두 번 클릭하고 데이터를 선택.XLSX 파일을 선택합니다.
  2. 데이터를 필터링하여 Boolean 작업에 실패하거나 "행 선택" 아이콘을 사용하여 알려진 경계 외부에 파라메트릭 변수 값을 제공하는 것으로 정의된 잘못된 측정값을 제거합니다. 아이콘을 두 번 클릭하고 "Sphericity는 0과 1 사이"와 같은 필터에 해당하는 조건을 설정합니다. 8.2.1, 8.2.2 및 8.2.3에 대한 조건을 만듭니다.
    1. 필터 거리 사치 측정은 -100-200 μm범위입니다.
    2. 세포 형상의 구형 측정을 0-1 범위로 필터링합니다.
    3. 0-2000 복셀범위로 암 세포 부피 측정을 필터링합니다.
    4. 모든 파라메트릭변수(표 1)를사용하여 뇌 전이성 MDA-MB-231-BR-GFP 및 비뇌 전이성 MDA-MB-231-GFP를 분류한다. 캔버스에서 열 선택 아이콘을 두 번 클릭합니다. > 버튼을 사용하여 사용 가능한 변수를 피처, 대상 변수또는 메타 특성으로 이동합니다. 대상 변수가 되어야 하는 유일한 변수는 데이터 집합의 셀이 전이성(1) 또는 (0)으로 간주되는지 정의하는 전이성 레이블입니다. 실험 변수는 메타 특성 섹션에 배치할 수 있습니다.
  3. 데이터 샘플은 교육(80%) 및 테스트 세트(20%). 데이터 샘플러 아이콘을 두 번 클릭하고 데이터의 고정 비율의 샘플링 유형을 선택합니다: 80%로 설정하고 복제 및 계층 확인란을 선택합니다. 각 모델/분류기에 대해 10개의 접을 사용하여 교육 세트를 계층화하고 교차 검증합니다. 테스트 및 점수를 두 번 클릭하고 접힌 수와 함께 교차 유효성 검사를 선택합니다: 10으로 설정하고 계층화된 검사를 선택합니다. 대상 클래스를 1로설정합니다.
  4. 이 방법에서는 데이터에 대한 강력한 신경망 및 랜덤 포리스트 학습 알고리즘을 사용합니다. 임의 포리스트 아이콘 내에서 50으로 트리 수를 선택하고 다른 옵션을 선택하지 않습니다. 신경망 아이콘 내에서 숨겨진 평신도 r 당 뉴런을선택 : 100, 활성화 : ReLu, 솔버 : 아담, 알파 : 0.0001,최대 반복 : 200. 그러나 이러한 설정은 연구에 따라 크게 다르며 응용 프로그램 전에 잘 이해해야 합니다.
  5. 캔버스를 설정한 후 파일에서 샘플 데이터로 각 아이콘을 두 번 클릭하고 데이터 적용 또는 전송을누르십시오. 테스트 및 점수를 두 번 클릭하면 교육 데이터가 알고리즘을 사용하여 모델을 개발하는 데 사용됩니다. 기계 학습 모델을 학습한 후, 테스트 및 점수 테스트를 다시 열고 팝업 창을 닫고 0에서 1까지 뇌 전이성 확률에 따라 칩의 세포를 분류하여 모델의 성능을 채점한다.
  6. 파일(표 2)에기계 학습 모델 성능을 저장합니다. ROC의 곡선(AUC) 아래 영역, 정확도 및 F1 점수를 포함합니다. 개별 전이성 지수 및 분류 확률을 포함하는 두 번째 파일을 저장합니다. 저장 아이콘을 두 번 클릭하고 As 저장을 클릭하여 분류 확률을 제출합니다. 마찬가지로 ROC 곡선을 두 번 클릭하여 볼 수 있으며 혼동 매트릭스 아이콘을 두 번 클릭하여 모델 성능을 계산할 수 있습니다.

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결과

이 기술을 사용하여, 우리는 다른 형광 단백질 또는 염료로 표지된 세포 모형을 분석했습니다. 우리는 hCMEC/D3-DsRed 및 비 형광 성상세포로 제조된 μmBBN 칩으로 이 접근법의 사용을 보여줍니다. 뇌 미생물 내피 세포는 다공성 멤브레인 (5 μm 트랙 에칭 모공)에 시드되고 5 % CO2미만의 37 °C에서 인큐베이터34에 배치되었다. 3일 후 내피층의 합류는 현미경검사를 통해 확인되었?...

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토론

우리는 뇌 조직으로내피 장벽을 통해 암세포의 사치화 및 이동측정을 위해 임상 이미징 분석에 자주 활용되는 도구를 적응시키는 새로운 방법을 개발하고 제시했습니다. 우리는 이 접근 방식이 생체 내 및 체외 측정 모두에 유용할 수 있다고 제기합니다. 우리는 뇌 혈관을 재구성하는 3D 미세 유체 시스템에 그것의 사용을 입증했습니다. 암 세포 측정은 이 기술을 사용하여 양화된 거리, 부피, 구?...

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공개

선언할 공개는 없습니다.

감사의 말

MDA-MB-231-BR-GFP 세포의 관대 한 기부에 대 한 국립 암 연구소에서 Steeg 연구소에 감사 합니다. 공초점 현미경 검사는 미시간 대학 생물 인터페이스 연구소 (BI)에서 수행되었다. 흐름 세포측정은 미시간 유동 세포측정 코어 대학에서 수행되었다. 바이러스 벡터는 미시간 벡터 코어 대학에 의해 만들어졌습니다. 우리는 또한 이러한 데이터의 통계 분석에 대한 지침을 켈리 키드웰 감사합니다.

자금:

C.R.O.는 NIH T-32 교육 펠로우십(T32CA0009676) 및 1R21CA245597-01에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.M.W.는 1R21CA245597-01 및 국립 보건원의 번역 과학 발전 센터인 UL1TR002240에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재료 및 특성화에 대한 기금은 수여 번호 1R21CA245597-01, P30CA0046592, 5T32CA0009676-23, CA196018, AI116482, 메타비보르 재단, 메타비보르 재단, 유방암 연구 하에 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 제공되었다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

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