使用最近邻模型对新生小鼠心脏进行克隆分析

摘要

这里介绍的是一种使用多色谱系追踪和最近邻建模来识别小鼠生长和再生过程中克隆衍生的心肌细胞的方案。这种方法是客观的，适用于不同的标记条件，并且可以适应整合各种图像分析管道。

摘要

通过替代丢失或功能失调的心肌，组织再生是治疗心力衰竭的一种很有前途的方法。然而，检测真正的心脏再生的挑战限制了潜在再生因子的验证。检测新心肌细胞的一种方法是使用克隆分析进行多色谱系追踪。克隆分析实验可能难以进行，因为过于稀疏的标记条件对心肌细胞增殖等罕见事件缺乏敏感性，而弥散标记限制了分离克隆的能力。这里介绍的是一种通过使用最近邻分布的统计模型来解析心肌细胞克隆来对新生小鼠心脏进行克隆分析的方案。这种方法能够在一系列标记条件下分离克隆，并为定量心肌细胞增殖和再生提供了一种可靠的分析方法。该方案可适用于其他组织，可广泛用于研究组织再生。

引言

心力衰竭的组织学标志是心肌细胞 （CM） 的丢失，无论是在损伤、衰老还是细胞凋亡¹ 后。通过组织再生补充丢失或功能失调的心肌是治愈心力衰竭患者的潜在治疗策略。在过去的几十年里，发育和再生生物学的开创性进展发现，哺乳动物心脏补充丢失的 CM 的能力有限 2,3,4,5。这项令人兴奋的工作提出了先天生长机制可用于再生的可能性。由于成年哺乳动物心脏在功能上不存在先天再生反应，因此需要提高内源性修复稳健性的方法才能实现治疗性心脏再生。

先天心脏再生的机制似乎在物种之间是保守的。损伤后，预先存在的 CM 增殖，在斑马鱼 ^6,7、蝾螈 ^8,9、小鼠 ^4,10、大鼠¹¹ 和猪^12,13 中产生新的 CM。因此，许多小组正在寻求鉴定能够促进心肌生成的有丝分裂原。然而，这样的工作是具有挑战性的。不仅让成年哺乳动物 CM 增殖的任务令人生畏，而且能够识别罕见的增殖事件也很困难 ^1,14。识别罕见的循环 CM 的挑战因成年哺乳动物 CM 优先接受有丝分裂的趋势而变得更加复杂。例如，在小鼠心脏受伤后，边界区近 25% 的 CM 重新进入细胞周期，但只有 3.2% 的 CM 分裂⁴。因为大多数循环 CM 复制了它们的基因组，但未能进行胞质分裂，所以简单地检测循环 CM 数量的增加对于真正的心肌生成是模棱两可的。因此，CM 核苷掺入或 CM 上存在增殖标志物的测定可能并不完全表明再生。随着更多心脏再生候选因素的出现，需要检测来更好地识别 CM 增生。

通过谱系追踪进行克隆分析是检测心肌生成的一种有价值的方法，因为它可以直接观察细胞及其后代。传统的克隆分析方法涉及使用报告基因对单细胞进行罕见标记。然而，稀有细胞的单色谱系追踪对于 CM 增殖等不常见事件的价值可能有限，因为标记增殖 CM 的几率很低¹⁵。或者，多色谱系示踪可以提高克隆分析的灵敏度¹⁶。简而言之，单个细胞用几种荧光蛋白中的一种随机进行基因标记，这样增殖的细胞将产生颜色均匀的细胞簇，这些细胞簇可以从相邻的荧光细胞中分辨出来。这种方法已被用于追踪各种器官的生长，最近已应用于哺乳动物心脏再生的研究^17,18。虽然多色谱系追踪可以检测胚胎和新生儿阶段 CM 的克隆扩增，但在心脏损伤后的成年小鼠心脏中不容易检测到先天再生反应^17,19。提高多色谱系追踪灵敏度的一种方法是提高标记水平并增加可视化罕见事件的可能性。然而，更广泛的标记是无法区分相似标记的细胞来自共同祖先，而不是用相同荧光团独立标记的细胞。这里介绍的是一种协议，它使用最近邻建模来识别新生小鼠心脏中的克隆相关 CM。这种方法是无偏倚的、定量的，并且适用于一系列标记条件。

研究方案

处理小鼠、进行生存手术和采集心脏的所有程序都需要得到当地机构动物使用委员会的批准。

1. 用于 CMs 克隆分析的小鼠

1. Myh6-MerCreMer 小鼠²⁰ 与 Gt（ROSA）26Sor^{tm1（CAG-EGFP，-mCerulean，-mOrange，-mCherry）Ilw} 小鼠²¹ 杂交生成 Myh6-MerCreMer;R26R-Rainbow 双转基因小鼠。
   1. 维持 R26R-Rainbow 等位基因纯合子的小鼠库存，并与 Myh6-MerCreMer 等位基因杂合子小鼠杂交，使得所有实验都在 R26R-Rainbow 等位基因杂合子小鼠中进行。或者，使用 R26R-Rainbow 等位基因的纯合子小鼠来增加颜色多样性，但这需要一个能够忠实区分 EGFP、mCerulean、mOrange 和 mCherry 荧光团的成像系统。
2. 在心脏采集时进行基因分型。
   注：Myh6-MerCreMer 小鼠在 CMs 中表达他莫昔芬诱导的 Cre 重组酶，可以使用 PCR 引物 CGTACTGACGGTGGGAGAAT （Cre-F） 和 GTGGCAGATGGCGCGGCAACA （Cre-R） 进行基因分型，以产生 200 个碱基对 （bp） 产物。R26R-Rainbow 小鼠组成型表达 EGFP，但在 Cre 介导的重组后会随机表达 mCerulean、mOrange 或 mCherry。R26R-Rainbow 可以用 PCR 引物 CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT （R26-F）、CGAGGCGGATCACAAGCAATA （R26-R） 和 TCAATGGGCGGGGGTCGTT （Rainbow-R） 进行基因分型。野生型等位基因产生 350 bp 的产物，Rainbow 等位基因产生 250 bp 的产物。

2. 冷冻损伤和心肌细胞标记

1. 如前所述进行冷冻损伤，并稍作修改^22,23。小心地将一日龄小鼠 （P1） 放在碎冰床上 3 分钟以诱导心脏骤停。通过进行脚趾捏合而没有反射性撤退来确认充分麻醉。
   注意：麻醉时机至关重要。如果小鼠冷却时间过长，生存会受到影响。此外，小鼠的年龄也很关键。再生能力在出生后的第一周急剧减弱¹⁰.
2. 将麻醉的幼崽放在冷袋上和手术解剖显微镜的目标下。使用 6 毫米微型剪刀在第 4 和第 5 肋骨之间进行开胸手术，以暴露心脏的前表面。
3. 使用在液氮中冷却的冷冻探针，将探针放在左心室上 1-2 秒。对于假损伤，在没有冷冻损伤的情况下进行开胸手术。
   注意：冷冻损伤的持续时间决定了损伤的程度。长期受伤会降低生存率。
4. 用 6-0 聚丙烯缝合线连接到直径为 0.15 毫米的针头上闭合切口。
5. 快速加热幼犬并手动刺激以恢复血液流动。一旦幼犬自发移动，就放在加热垫上。
6. 腹膜内注射 20 μ 克他莫昔芬的回收幼仔。此时，如果需要，沿缝合线注射镇痛药，例如 0.25% 布比卡因。将幼崽送回母马。
   注意：一窝幼崽一起回收并一起送回母猪。此工作流程提高了母马对垃圾的存活率和重新接受度。

3. 采集心脏并进行组织学分析

1. 在受伤后 20 天 （dpi） 或出生后 （P21） 收获心脏，因为可以在该时间点¹⁰ 观察到再生反应。首先在 CO₂ 吸入室中对小鼠实施安乐死，然后转移到手术显微镜中。
   注意：安乐死应按照动物使用的机构指南进行。
2. 一旦确认有足够的麻醉，使用手术显微镜进行双开胸手术以暴露心脏。然后，用 1 mL 1 M KCl、1 mL 4% 多聚甲醛和 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 灌注心脏。
   注意：需要充分清洗以限制脑室内血栓，这些血栓在图像采集过程中会导致自发荧光。
3. 灌注后，解剖心脏并放入含有至少 1 mL PBS 的试管中。
4. 使用解剖显微镜修剪心脏以优化包埋。中庭下方的水平切片为嵌入短轴截面的心脏提供了良好的表面。
   注意：或者，如果需要长轴截面，可以横向切割心形。
5. 将修剪过的心脏放入 1 mL 30% （wt/vol） 蔗糖中，在 4 °C 下放置 12-18 小时。从蔗糖溶液中取出样品。使用组织冷冻培养基将修剪过的组织包埋到块中。
6. 在干冰上快速冷冻包埋的组织，并将块储存在 -80 °C。
7. 用低温恒温器将冷冻的全心块切成 10 μm 切片，安装在带电载玻片上，并将载玻片储存在 -20 °C。在 10 张载玻片上连续切片心形。这是通过在 10 张幻灯片中的每张幻灯片上安装一个部分来完成的，然后再返回到第一张幻灯片以添加另一个部分。这种策略限制了在给定幻灯片的多个部分上捕获相同 CM 的机会。
   注意：小心限制暴露在光线下，以防止荧光损失。
8. 准备好成像时，解冻玻片并在 PBS 中再水化。在应用 #1.5 玻璃盖玻片之前添加抗褪色封固剂。将盖玻片存放在 4 °C 的有盖容器中。
   注意：对于冷冻损伤的预期结果，读者将参考有关此主题的先前工作²³。心脏切片有高水平的自发荧光。在应用盖玻片之前使用淬灭剂，例如 Sudan Black 有助于减少自发荧光。但是，应谨慎避免淬灭感兴趣的荧光团。

4. 成像

注：以下步骤适用于使用商用显微镜（参见 材料表），该显微镜具有正置宽场荧光系统，带有滤光片立方体，可区分 mCerulean、EGFP、mOrange 和 mCherry 荧光团，以及与此设置相关的软件（参见 材料表）。其他步骤将根据所使用的确切成像系统而有所不同。

1. 仅使用 GFP 滤镜以 5 倍放大倍率对整个幻灯片进行成像，以创建幻灯片图。
2. 在玻片图上选择完整且自发荧光有限的切片进行成像。由于以 10 张载玻片为一组进行连续切片，相邻切片将相距至少 100 μm，从而阻止相同 CM 的成像。
3. 使用 mCerulean、mOrange、mCherry 和 EGFP 滤光片的 20 倍物镜对各个切片进行平铺扫描成像。代表性图像如图 1 所示。
4. 以允许检索单个通道信息的格式保存图像。小心地以允许识别心脏、荧光团和心脏内切片位置的格式命名文件。以下计算步骤需要系统命名方法。

5. 分析图像以识别标记的 CM

1. 从每组中选择完好无损的成像切片，并随机分配给所有筛选者。确保屏蔽人员对每张图片都遵循以下步骤。
2. 对于每个通道（mCerulean、mOrange 和 mCherry），使用 ImageJ²⁴ 上的“色彩平衡”工具调整图像的亮度和对比度，以帮助用户识别标记的细胞。
   注意：ImageJ 是一款免费的图像分析工具，可从 https://imagej.net 下载。该协议使用版本 2.0.0-rc-69/1.52i。
3. 在 ImageJ 中，从 'Analyze' 下拉菜单中选择 'Set Measurements'。在打开的窗口中，选择 “Area |质心 |边界矩形 |限制为阈值”。
   注意：图像减法模块有时可用于改善相对于背景自发荧光的荧光团信号。但是，如果执行，则应系统地对数据集中的所有图像进行减法。
4. 打开感兴趣的图像后，选择“工具”，然后从“分析”下拉菜单中选择“ROI 管理器”。这将打开“ROI 管理器”窗口。
5. 从 ImageJ 工具栏中选择“手绘选择”工具并跟踪感兴趣的单元格（图 2A）。追踪后，按 't' 或使用 'ROI 管理器' 窗口中的 '添加 [t]' 按钮（图 2B）。对单个通道的所有单元格重复此作。
   注意：应分别针对每个渠道进行细分和 ROI。
6. 选择给定渠道的所有单元格后，将 ROI 另存为 .zip 文件。首先在 'ROI Manager' 窗口中选择 'Deselect' 以确保没有突出显示单个 ROI。然后，单击“ROI 管理器”窗口中的“更多”选项卡，然后选择“保存”选项。这将打开桌面导航器，其中 ROI 将保存为 .zip 文件。
7. 将每个 ROI 的测量值导出为 .csv 文件。为此，请确保没有突出显示单个 ROI，再次选择“取消选择”，然后在“ROI 管理器”窗口中选择“测量”。这将打开一个新的 'Results' 窗口，其中包含之前选择的所有测量值。
8. 在“结果”窗口中选择“文件”，然后从下拉菜单中选择“另存为”（图 2C）。这将再次打开 desktop navigator，以便可以.csv格式保存文件。
   注意：在继续细分下一个渠道之前，请确保保存 ROI 和测量结果。
9. 请小心地以允许识别心脏、通道和心脏中部分位置的格式命名文件。例如，'HeartType#_Set#_Section#_Channel' （例如，'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' 表示 ROI，'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' 表示相应的度量）。
   注意：下面的代码假定上述命名约定。不同的命名约定将需要修改代码。

6. 统计分析

注：携带相同荧光基团的细胞是克隆来源的细胞 （kin） 和不相关细胞的混合物，它们经历随机重组事件以表达相同的荧光基团 （non-kin）。根据先前的数据¹⁷，假设 kin 细胞比表达相同荧光团的非 kin 细胞具有更近的物理接近度。因此，亲属细胞和非亲属细胞可以根据距离阈值进行区分。但是，为了确定阈值，需要对 kin 单元和非 kin-cell 的最近邻分布进行反卷积。幸运的是，可以通过评估从每个细胞到携带不同荧光团的最近细胞的最近邻值来估计非亲缘细胞的最近邻分布。这里提出了用于统计确定阈值距离以定义克隆性和分配细胞之间亲缘关系概率的方法。

1. 使用从第 5 节获得的 .csv 文件，计算心形切片内每个单元格的最近邻距离。将这些结果编译为通道内（mCerulean-mCerulean、mOrange-mOrange 和 mCherry-mCherry）和通道间（mCerulean-mOrange、mOrange-mCherry 和 mCherry-mCerulean）距离。将结果保存到两个 .csv 文件中：一个用于通道内距离，另一个用于通道间距离。
   1. 安装需要 numpy 和 pandas 库的 Python²⁵ 代码。
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. 使用 python snippet_6_1.py计算通道内距离和通道间距离的距离并导出通道内距离的 .csv 文件。
2. 将通道内和通道间距离读取到 R²⁶ 数据帧中，将心脏标识符转换为分类变量。通过查看最近邻直方图（图 3A、C）来应用临时选择的阈值，以最大限度地减少异常值。确保选择的阈值覆盖超过 90% 的通道间和通道内距离，同时排除长尾，以避免在较大的最近邻距离处对噪声进行过拟合。该协议使用 400 μm 的阈值（图 3）。使用 Rscript snippet_6_2.R 执行此步骤。
   注意：或者，可以将多个切片建模为单个变量。该协议将模型复杂性限制在心脏水平，以便于建模和估计。
3. 获取通道内和通道间距离的自然对数。由于像元是占用空间的非点实体，因此最小最近邻距离分布以非零值为中心，并且具有不对称的尾部，因为像元对之间的最大距离可能大大高于中值（图 3A，C）。使用对数正态分布对此类分布进行建模（图 3B、D）。使用 Rscript snippet_6_3.R 执行此作。
4. 使用以下贝叶斯模型估计亲属 （α₂， σ²₂） 和非亲属 （α₁， σ²₁） 最近邻分布的均值和方差，以及亲属分布产生信道内距离的概率 （π=e^β/（1+e^β））：
   bw.dist_i ~ N（α₁， σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N（α₁， σ²₁| l.limi2， σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁（0,1|σ₁>0）
   σ₂ ~T₁（0,1|σ₂>0）
   α₁ ~ Unif（2,6）
   α₂ ~ Unif（1,5）
   β ~ Unif（-5,0）
   其中 Unif（a，b） 是区间 [a，b] 上的均匀分布，N（μ，σ²|l2 约束在区间 （l，u） 上的正态分布，T₁（0,1|x>0） 是约束在正半线的标准柯西分布（T 具有 1 个自由度）， bw.dist_i 是记录^{的第 i 个} 通道对间距离，wi.dist_i 是记录的^{第 i 个} 通道内对距离。请注意，通道内记录的距离具有双组分混合物分布，反映了亲属和非亲属单元对的混合。
   1. 如果可能，为模型提供信息丰富的先验。例如，该协议期望亲属细胞比非亲属细胞彼此更近，因此这是作为距离分布平均值的先验提供的。然后，使用 runjags²⁷ 和 coda²⁸ R 包以及 JAGS²⁹ 程序进行参数估计 （Rscript snippet_6_4.R）。
5. 使用与可用 CPU 数量相对应的链数执行 JAGS 模型。使用 Rscript snippet_6_5.R 执行此步骤。让软件运行直到收敛。
6. 使用指标来测试算法的收敛性，例如有效样本量（通过 runjags 提供）、Gelman-Rubin 收敛诊断（通过 runjags 提供）及其自相关（autocorr/autocorr.diag 在 coda 中提供）。通过检查 Q-Q 图来验证最近邻距离的估计模型的拟合优度，该图使用 Rscript snippet_6_6.R 绘制最近邻距离的实际值和估计值的分位数级比较（图 4C、F）。此脚本要求用户根据命令 6 的输出编辑 snippet_6_6.R 的第 25-29 行中的值。
   注：理想情况下，对于参数³⁰ 中的每个参数，应获得大于 10,000 的有效样本量 （SSeff）。但是，大于 2,500 的 SSeff 可能适用于某些复杂模型。Gelman Rubin 诊断为 1.00 才能实现完美收敛，必须小于 1.05 才能获得令人满意的收敛。高自相关表示链内混合缓慢，是收敛缓慢的指标。在良好模型的情况下，自相关图必须遵循指数衰减。实际分布和建模的最近邻分布的 Q-Q 图（图 4C、F）应尽可能紧随对角线。
7. 在验证模型的准确性后，获得一对细胞是 kin 的概率，作为它们距离的函数。要确定用于确定通道内细胞是否可能是亲缘关系的阈值距离，请确定亲缘关系的概率降至 0.5 以下的距离。这可以使用 Rscript snippet_6_7.R 来完成。
   注意：可以根据实验目标选择替代阈值。对于某些应用程序，阈值可能无关紧要，并且成为亲缘关系对的概率可能直接用于加权细胞对。

结果

遵循新生儿冷冻损伤方案应产生有损伤和无损伤的 P21 心脏。冷冻损伤的心脏具有界限明确的损伤，而假心脏的表面光滑且均匀。在冷冻损伤的心脏中，受伤区域应从心脏到心脏保持一致。显微镜检查后，应获得类似于图 1 的图像。请注意，图像分辨率允许识别单个 CM，成像条件允许分辨每个荧光团。此外，请注意，损伤不是透壁损伤，因为较大的?...

讨论

多色谱系追踪是一种以单细胞分辨率识别器官生长模式的强大方法。然而，多色谱系追踪的一个主要限制是需要对细胞进行稀疏标记，这会降低识别罕见事件的灵敏度。对于像心脏这样实质细胞更新水平低的器官，这可能导致低估生长反应。这里介绍的是新生小鼠生长和再生过程中 CM 扩增进行克隆分析的分步方案。最重要的是，提供了一个分析框架，用于通过对具有最?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software