最近傍モデリングを用いた新生児マウス心臓のクローン解析

要約

ここでは、マルチカラー系統追跡と最近傍モデリングを使用して、マウスの成長と再生中にクローン由来の心筋細胞を同定するためのプロトコルを示します。このアプローチは客観的であり、さまざまなラベリング条件で機能し、さまざまな画像解析パイプラインを組み込むように適応させることができます。

要約

失われた心筋や機能不全の心筋を補うことにより、組織再生は心不全の治療に有望なアプローチです。しかし、真正な心臓再生を検出するという課題は、潜在的な再生因子の検証を制限します。新しい心筋細胞を検出する方法の1つは、クローン解析による多色系統追跡です。Clonal解析実験は、標識条件がまばらすぎると心筋細胞の増殖などのまれな事象に対する感度が不足し、拡散標識ではクローンの分離能力が制限されるため、実施が困難な場合があります。ここでは、最近傍分布の統計モデリングを使用して心筋細胞クローンを解決し、新生児マウスの心臓のクローン解析を行うプロトコルを紹介します。このアプローチにより、さまざまな標識条件でクローンを分離でき、心筋細胞の増殖と再生を定量化するための堅牢な分析アプローチが得られます。このプロトコルは他の組織にも適応でき、組織再生の研究に広く使用できます。

概要

心不全の組織学的特徴は、損傷、老化、またはアポトーシスのいずれかに続く心筋細胞(CM)の喪失です¹。失われた心筋や機能不全の心筋を組織再生によって補充することは、心不全患者を治癒するための潜在的な治療戦略を表しています。過去数十年にわたり、発生生物学と再生生物学の独創的な進歩により、哺乳類の心臓が失われたCMを補充する能力は限られていることが明らかになった2,3,4,5。このエキサイティングな研究は、生まれつきの成長メカニズムが再生のために展開できる可能性を提起しました。成体の哺乳類の心臓には自然再生応答が機能的に存在しないため、治療的心臓再生を実現するためには、内因性修復の頑健性を向上させる方法が必要です。

先天的な心臓再生のメカニズムは、種を超えて保存されているようです。損傷後、既存のCMが増殖して、ゼブラフィッシュ^6,7、イモリ^8,9、マウス^4,10、ラット¹¹、およびブタ^12,13で新しいCMを生成します。したがって、多くのグループは、心筋形成を促進することができるマイトジェンを特定しようとしています。しかし、そのような作業は困難です。成体哺乳類のCMを増殖させるのは大変な作業であるだけでなく、まれな増殖イベントを特定できることも困難です^1,14。希少なサイクリングCMを特定するという課題は、成体哺乳類CMが優先的に内分裂を受ける傾向があるため、さらに悪化します。例えば、マウスの心臓が損傷した後、境界ゾーンのCMのほぼ25%が細胞周期に再入しますが、CMの3.2%だけが⁴を分裂させます。ほとんどのサイクリングCMはゲノムを複製しますが、細胞質分裂は起こらないため、サイクリングCMの数の増加を単純にアッセイすることは、正真正銘の心筋形成とは曖昧です。したがって、CMによるヌクレオシドの取り込みまたはCM上の増殖マーカーの存在に関するアッセイは、完全に再生を示すものではない可能性があります。心臓再生の候補因子が増えるにつれて、CM過形成をより正確に特定するためのアッセイが必要になります。

系統追跡によるクローン解析は、細胞とその子孫を直接可視化することができるため、心筋形成のアッセイに有用なアプローチです。クローン解析の従来のアプローチでは、レポーター遺伝子による単一細胞のまれな標識が含まれていました。しかし、希少細胞の単色系統追跡は、増殖するCMを標識する可能性が低いため、CM増殖などのまれなイベントに対しては限定的な価値を持つ可能性がある¹⁵。あるいは、マルチカラー系統追跡は、クローン解析¹⁶の感度を高めることができる。簡単に言うと、個々の細胞は、いくつかの蛍光タンパク質のうちの1つでランダムに遺伝的に標識されるため、増殖する細胞は、隣接する蛍光細胞から分解できる均一な色の細胞クラスターを生成します。この方法は、さまざまな臓器の成長を追跡するために使用されており、最近では哺乳類の心臓再生の研究にも適用されています^17,18。多色系統追跡は、胚期および新生児期におけるCMのクローン増殖を検出することができるが、心臓損傷後の成体マウスの心臓では自然再生応答は容易に検出されない^17,19。マルチカラー系統トレースの感度を高めるための1つのアプローチは、ラベリングのレベルを上げ、まれなイベントを視覚化する確率を高めることです。しかし、より広範な標識には、共通の祖先から生じた細胞と、同じ蛍光色素で独立して標識された細胞とを区別することができないという代償が伴います。ここで紹介するのは、最近傍モデリングを使用して、新生児マウスの心臓のクローン関連 CM を同定するプロトコルです。この方法は、偏りがなく、定量的であり、さまざまなラベリング条件で機能します。

プロトコル

マウスの取り扱い、生存手術の実施、心臓の採取のすべての手順は、地元の施設動物使用委員会の承認が必要です。

1. CMのクローン解析用マウス

1. Myh6-MerCreMerマウス²⁰をGt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw}マウス²¹と交配してMyh6-MerCreMerを生成し、R26R-Rainbowバイトランスジェニックマウス。
   1. R26R-Rainbow対立遺伝子のホモ接合マウスのストックを維持し、Myh6-MerCreMer対立遺伝子のヘテロ接合マウスと交配し、すべての実験がR26R-Rainbow対立遺伝子のマウスヘテロ接合体で行われるようにします。あるいは、R26R-Rainbow対立遺伝子にホモ接合体マウスを使用して色の多様性を高めることもできますが、これにはEGFP、mCerulean、mOrange、およびmCherryの蛍光色素を忠実に識別できるイメージングシステムが必要です。
2. 心臓採取時にジェノタイピングを行います。
   注:Myh6-MerCreMerマウスは、CMでタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼを発現し、PCRプライマーCGTACTGACGGTGGGAGAAT(Cre-F)およびGTGGCAGATGGCGCGGCAACA(Cre-R)を使用して遺伝子型決定を行い、200塩基対(bp)の産物を生成することができます。R26R-RainbowマウスはEGFPを構成的に発現しますが、Creを介した組換え後、mCerulean、mOrange、またはmCherryを確率的に発現します。R26R-Rainbowは、PCRプライマーCTCTGCTGCCTCCTCTTCTCTCTCTT(R26-F)、CGAGGCGGATCACAAGCAATA(R26-R)、およびTCAATGGGCGGGGGTCGTT(Rainbow-R)で遺伝子型決定できます。野生型対立遺伝子は350 bpの産物を与え、レインボー対立遺伝子は250 bpの産物を与えます。

2. 凍結傷害と心筋細胞の標識

1. 軽微な修正^22,23で前に説明したように凍結傷害を行う。生後1日齢のマウス(P1)を砕いた氷のベッドに3分間慎重に置き、心停止を誘発します。.反射的に引き抜くことなくつま先をつまむことにより、適切な麻酔を確認します。
   注:麻酔のタイミングは重要です。マウスを長時間冷却すると、生存が損なわれる可能性があります。さらに、マウスの年齢も重要です。回生能力は生後1週間で急激に低下します¹⁰。
2. 麻酔をかけた子犬をコールドパックの上に置き、外科用解剖顕微鏡の対物レンズの下に置きます。6mmのマイクロハサミを使用して、第4肋骨と第5肋骨の間の開胸術を行い、心臓の前面を露出させます。
3. 液体窒素で冷却したクライオプローブを使用して、プローブを左心室に1〜2秒間置きます。偽の損傷の場合は、凍結損傷なしで開胸術を行います。
   注:凍結傷害の持続時間は、損傷の程度を決定します。怪我が長引くと、生存率が低下します。
4. 直径0.15mmの針に取り付けられた6-0ポリプロピレン縫合糸で切開部を閉じます。
5. 子犬をすばやく温め、手動で刺激して血流を再開します。子犬が自発的に動き始めたら、加熱パッドの上に置きます。
6. 回収した子犬に20μgのタモキシフェンを腹腔内に注射します。.この時点で、必要に応じて、縫合線に沿って0.25%ブピバカインなどの鎮痛薬を注射します。.子犬をダムに戻します。
   注:1匹の子犬は一緒に回収され、一緒にダムに戻されます。このワークフローにより、ダムによるごみの生存率と再受容性が向上します。

3. 心臓の採取と組織学的解析のための加工

1. 損傷後20日(dpi)、または出生後日(P21)に心臓を収穫します。これは、この時点¹⁰までに再生反応が観察されるためです。まず、マウスをCO₂ 吸入チャンバーで安楽死させ、次に手術用顕微鏡に移します。
   注:安楽死は、動物の使用に関する施設のガイドラインに従って実施する必要があります。
2. 十分な麻酔が確認されたら、外科用マイクロハサミを使用して二重開胸術を行い、心臓を露出させます。次に、1 mLの1 M KCl、1 mLの4%パラホルムアルデヒド、および1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で心臓を灌流します。
   注:画像取得中に自家蛍光を引き起こす可能性のある脳室内血栓を制限するには、適切な洗浄が必要です。
3. 灌流後、心臓を解剖し、少なくとも1mLのPBSを含むチューブに入れます。
4. 解剖顕微鏡を使用して心臓をトリミングし、埋め込みを最適化します。アトリウムの下の水平スライスは、短軸セクションのハートを埋め込むのに適した表面を提供します。
   注:あるいは、長い軸部分が必要な場合は、心臓を横方向に切断することもできます。
5. トリミングした心臓を1 mLの30%(wt/vol)スクロースに4°Cで12〜18時間入れます。スクロース溶液からサンプルを取り出します。ティッシュ凍結メディアを使用して、トリミングしたティッシュをブロックに埋め込みます。
6. 埋め込まれた組織をドライアイスで素早く凍結し、ブロックを-80°Cで保存します。
7. 凍結した全心ブロックをクライオスタットで10 μmの切片に切片化し、帯電したスライドにマウントし、スライドを-20°Cで保存します。10枚のスライドでハートを順次セクション化します。これは、10 枚のスライドのそれぞれにセクションを取り付けてから、最初のスライドに戻って別のセクションを追加することによって行われます。このような戦略では、特定のスライドの複数のセクションで同じCMをキャプチャする可能性が制限されます。
   注意: 蛍光の損失を防ぐために、光への露出を制限するように注意してください。
8. イメージングの準備ができたら、スライドを解凍し、PBSで再水和します。#1.5ガラスカバースリップを塗布する前に、退色防止封入剤を添加してください。カバースリップしたスライドは、4°Cの蓋付き容器に保管してください。
   注:凍結傷害の予想される結果については、読者はこのトピック²³に関する以前の研究に向けられています。心臓切片は高レベルの自家蛍光を持っています。カバースリップを塗布する前に、スーダンブラックなどの消光剤を使用すると、自家蛍光を軽減するのに役立ちます。ただし、目的の蛍光色素をクエンチしないように注意する必要があります。

4. イメージング

注:以下の手順は、mCerulean、EGFP、mOrange、およびmCherry蛍光色素を識別するためのフィルターキューブを備えた直立広視野蛍光システムを備えた市販の顕微鏡( 材料の表を参照)と、このセットアップに関連するソフトウェア( 材料の表を参照)の使用に適用されます。追加の手順は、使用する正確なイメージングシステムによって異なります。

1. GFPフィルターのみを使用してスライド全体を5倍の倍率で画像化し、スライドマップを作成します。
2. スライドマップ上で、イメージング用の自家蛍光が制限された無傷の個々の切片を選択します。10枚のスライドのセットで連続切片化されるため、隣接する切片は少なくとも100μm離れており、同じCMのイメージングが防止されます。
3. 20倍対物レンズとmCerulean、mOrange、mCherry、およびEGFPフィルターを使用して、個々の切片のタイルスキャンイメージングを実行します。代表的な画像を 図1に示します。
4. 個々のチャンネル情報を取得できる形式で画像を保存します。ファイルに名前を付けるには、心臓、蛍光色素、および心臓内のセクションの位置を特定できる形式で名前を付けるように注意してください。以下の計算手順では、体系的な命名アプローチが必要です。

5. ラベル付きCMを特定するための画像の解析

1. 各セットから無傷の画像切片を選択し、すべてのスクリーナーにランダムに分配します。スクリーナーが各画像について次の手順を守っていることを確認します。
2. 各チャンネル(mCerulean、mOrange、mCherry)について、ImageJ²⁴の「カラーバランス」ツールを使用して画像の明るさとコントラストを調整し、ユーザーがラベル付けされた細胞を識別できるようにします。
   注:ImageJは、https://imagej.net からダウンロードできる無料の画像分析ツールです。このプロトコルは、バージョン 2.0.0-rc-69/1.52i を使用していました。
3. ImageJで、「分析」ドロップダウンメニューから「測定値の設定」を選択します。開いたウィンドウで、[エリア]を選択します|重心 |境界矩形 |Limit to threshold'.
   注:画像減算モジュールは、バックグラウンドの自家蛍光に対する蛍光色素シグナルを改善するために使用される場合があります。ただし、減算を実行する場合は、データセット内のすべての画像に対して体系的に減算を行う必要があります。
4. 目的の画像を開いた状態で、[ツール]を選択し、[分析]ドロップダウンメニューから[ROIマネージャー]を選択します。「ROI Manager」ウィンドウが開きます。
5. ImageJツールバーから「フリーハンド選択」ツールを選択し、目的のセルをトレースします(図2A)。トレースが完了したら、「t」を押すか、「ROI manager」ウィンドウの「Add [t]」ボタンを使用します(図2B)。1 つのチャネルのすべてのセルに対して繰り返します。
   注:セグメンテーションとROIは、チャネルごとに個別に行う必要があります。
6. 特定のチャネルのすべてのセルを選択したら、ROIを.zipファイルとして保存します。これを行うには、最初に「ROIマネージャー」ウィンドウで「選択解除」を選択して、単一のROIが強調表示されていないことを確認します。次に、「ROIマネージャー」ウィンドウの「その他」タブをクリックし、「保存」オプションを選択します。これにより、デスクトップ ナビゲーターが開き、ROI が .zip ファイルとして保存されます。
7. 各ROIの測定値を.csvファイルとしてエクスポートします。これを行うには、1 つの ROI が強調表示されていないことを確認し、[選択解除] を再度選択し、[ROI マネージャー] ウィンドウで [測定] を選択します。これにより、新しい「結果」ウィンドウが開き、以前に選択したすべての測定値が表示されます。
8. 「結果」ウィンドウで「ファイル」を選択し、ドロップダウンメニューから「名前を付けて保存」を選択します(図2C)。これにより、デスクトップナビゲータが再び開き、ファイルを.csv形式で保存できるようになります。
   注:次のチャネルのセグメント化に進む前に、ROIと測定値を必ず保存してください。
9. ファイルに名前を付けるには、ハート、チャネル、およびハート内のセクションの位置を識別できる形式にしてください。たとえば、「HeartType#_Set#_Section#_Channel」(例: ROI の場合は 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip'、対応する測定値の場合は 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' などです)。
   注: 次のコードは、上記の命名規則を前提としています。名前付け規則が異なると、コードを変更する必要があります。

6. 統計分析

注:同じ蛍光色素を持つ細胞は、クローン由来の細胞(kin)と、同じ蛍光色素を発現するためにランダムな組換えイベントを受けた無関係な細胞(non-kin)の混合物です。先行データ¹⁷に基づくと、血縁細胞は、同じ蛍光色素を発現する非血縁細胞よりも物理的近接性が近いと仮定される。したがって、血縁細胞と非血縁細胞は、距離の閾値に基づいて区別することができる。ただし、しきい値を決定するには、kin セルと非 kin セルの最近傍分布をデコンボリューションする必要があります。幸いなことに、非血縁細胞の最近傍分布は、各細胞から異なる蛍光色素を持つ最も近い細胞までの最近傍値を評価することで推定できます。ここでは、クローン性を定義するための閾値距離を統計的に決定し、細胞間の親族関係の確率を割り当てるための方法論を示します。

1. セクション 5 で取得した .csv ファイルを使用して、ハート スライス内の各セルの最近傍距離を計算します。これらの結果をチャネル内距離(mCerulean-mCerulean、mOrange-mOrange、mCherry-mCherry)とチャネル間距離(mCerulean-mOrange、mOrange-mCherry、mCherry-mCerulean)にまとめます。結果を 2 つの.csvファイル (1 つはチャネル内距離、もう 1 つはチャネル間距離) に保存します。
   1. numpy ライブラリと pandas ライブラリを必要とする Python²⁵ コードをインストールします。
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Python snippet_6_1.py を使用して、距離を計算し、チャネル内距離とチャネル間距離の .csv ファイルをエクスポートします。
2. チャネル内距離とチャネル間距離を R²⁶ データ フレームに読み込み、心臓識別子をカテゴリ変数に変換します。最近傍ヒストグラム (図 3A、C) を見て、アドホックに選択したしきい値を適用し、外れ値を最小化します。チャネル間距離とチャネル内距離の 90% 以上をカバーするしきい値を選択し、ロングテールを除外して、大きな最近傍距離でのノイズへの過剰適合を回避してください。このプロトコルでは、400μmのしきい値を使用します(図3)。この手順を実行するには、Rscript snippet_6_2.R を使用します。
   注: または、複数のスライスを個々の変数としてモデル化することもできます。このプロトコルは、モデリングと推定を容易にするために、モデルの複雑さを心臓レベルに制限します。
3. チャネル内距離とチャネル間距離の自然対数を求めます。セルは空間を占有する非点エンティティであるため、セルのペア間の最大距離が中央値よりも大幅に長くなる可能性があるため、最小近傍距離分布はゼロ以外の値を中心に配置され、非対称の裾があります (図 3A、C)。対数正規分布を使用して、このような分布をモデル化します(図3、B、D)。これを行うには、Rscript snippet_6_3.R を使用します。
4. 次のベイジアン モデルを使用して、親族 (α₂, _{σ 2 2}) と非親族 (α₁, σ²₁) の最近傍分布の平均と分散、および親族分布 (π=e^β/(1+e^β)) から生じるチャネル内距離の確率を推定します。
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ_{2 2}| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ ユニフ(2,6)
   α₂ ~ ユニフ(1,5)
   β ~ ユニフ(-5,0)
   ここで、Unif(a,b) は区間 [a,b] の一様分布、N(μ,σ²|l2 を区間 (l,u) に制約した正規分布、T₁(0,1|x>0) は正の半線に制約された標準コーシー分布 (自由度 1 の T) です。 bw.dist_i はチャネル間のペア距離の i^番目 、wi.dist_i はチャネル ペア内の距離の i^番目 です。チャネル内の記録距離は、血縁細胞と非血縁細胞のペアの混合物を反映した2成分混合物分布を有することに注意してください。
   1. 可能であれば、モデルに有益な事前確率を提供します。例えば、このプロトコルは、親族細胞が非血縁細胞よりも互いに接近すると予想するので、これは、距離の分布の平均についての事前分布として提供される。次に、runjags²⁷ と coda²⁸ の R パッケージと JAGS²⁹ プログラムを使用してパラメータ推定を行います (Rscript snippet_6_4.R)。
5. 使用可能な CPU の数に対応するチェーンの数で JAGS モデルを実行します。この手順を実行するには、Rscript snippet_6_5.R を使用します。ソフトウェアが収束するまで実行できるようにします。
6. 有効なサンプルサイズ (runjags で利用可能)、Gelman-Rubin 収束診断 (runjags で利用可能)、その自己相関 (autocorr/autocorr.diag は coda で利用可能) などのメトリクスを使用して、アルゴリズムの収束をテストします。 Rscript snippet_6_6.R を使用して最近傍距離の実際の値と推定値の分位点レベルの比較をプロットする Q-Q プロットを調べて、最近傍距離に対する推定モデルの適合度を確認します (図 4C、F)。このスクリプトでは、ユーザーはコマンド 6 からの出力に基づいて snippet_6_6.R の 25 行目から 29 行目の値を編集する必要があります。
   注:理想的には、パラメータ³⁰の各々について、10,000を超える有効サンプルサイズ(SSeff)を得るべきである。ただし、2,500 を超える SSeff は、一部の複雑なモデルに適している場合があります。ゲルマン・ルービン診断は、完全な収束のためには1.00であり、満足のいく収束のためには1.05未満でなければなりません。自己相関が高いということは、チェーン内の混合が遅いことを示し、収束が遅いことの指標です。自己相関プロットは、良好なモデルの場合、指数関数的な減衰に従う必要があります。実際の最近傍分布とモデル化された最近傍分布のQ-Qプロット(図4、C、F)は、できるだけ対角線に沿う必要があります。
7. モデルの精度を検証した後、セルのペアが距離の関数として親族である確率を取得します。チャネル内セルが親族である可能性が高いかどうかを判断するための閾値距離を決定するには、親族である確率が 0.5 を下回る距離を特定します。これは、Rscript の snippet_6_7.R を使用して実行できます。
   注:実験の目標に基づいて、代替のしきい値を選択できます。一部のアプリケーションでは、しきい値が関連性がない場合があり、親族ペアである確率がセルのペアの重み付けに直接使用される場合があります。

結果

新生児凍結損傷のプロトコルに従うと、損傷の有無にかかわらずP21心臓が得られるはずです。凍結傷害した心臓は、偽の心臓の表面が滑らかで均質であるのに対し、外接所の損傷は十分に限られています。凍結傷害した心臓では、損傷部位は心臓ごとに一貫している必要があります。顕微鏡観察後、図1と同様の画像が得られるはずです。なお?...

ディスカッション

マルチカラー系統追跡は、単一細胞の分解能で臓器成長のパターンを特定するための強力なアプローチです。ただし、マルチカラー系統追跡の主な制限は、細胞のスパースラベリングが必要であり、まれなイベントを識別するための感度が低下する可能性があることです。心臓のような実質細胞の代謝回転が低すぎることで有名な臓器の場合、これは成長反応の過小...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software