Neonatal Fare Kalbinin En Yakın Komşu Modellemesi Kullanılarak Klonal Analizi

Özet

Burada, farelerde büyüme ve rejenerasyon sırasında klonal olarak türetilmiş kardiyomiyositleri tanımlamak için çok renkli soy izleme ve en yakın komşu modellemesini kullanmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım nesneldir, farklı etiketleme koşullarında çalışır ve çeşitli görüntü analizi işlem hatlarını içerecek şekilde uyarlanabilir.

Özet

Kaybedilen veya işlevsiz miyokardiyumu değiştirerek, doku rejenerasyonu kalp yetmezliğini tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, iyi niyetli kalp rejenerasyonunu tespit etmenin zorluğu, potansiyel rejeneratif faktörlerin doğrulanmasını sınırlar. Yeni kardiyomiyositleri tespit etmenin bir yöntemi, klonal analiz ile çok renkli soy izlemedir. Klonal analiz deneylerinin yapılması zor olabilir, çünkü çok seyrek etiketleme koşulları kardiyomiyosit proliferasyonu gibi nadir olaylar için duyarlılıktan yoksundur ve yaygın etiketleme klonları çözme yeteneğini sınırlar. Burada, kardiyomiyosit klonlarını çözmek için en yakın komşu dağılımlarının istatistiksel modellemesini kullanarak yenidoğan fare kalbinin klonal analizini yapmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, klonların bir dizi etiketleme koşulunda çözülmesini sağlar ve kardiyomiyosit proliferasyonunu ve rejenerasyonunu ölçmek için sağlam bir analitik yaklaşım sağlar. Bu protokol diğer dokulara uyarlanabilir ve doku rejenerasyonunu incelemek için geniş çapta kullanılabilir.

Giriş

Kalp yetmezliğinin histolojik bir işareti, yaralanma, yaşlanma veya apoptozu takiben kardiyomiyositlerin (CM'ler) kaybıdır¹. Doku rejenerasyonu yoluyla kaybedilen veya işlevsiz miyokardın yenilenmesi, kalp yetmezliği olan hastaları tedavi etmek için potansiyel bir terapötik stratejiyi temsil eder. Son birkaç on yılda, gelişimsel ve rejeneratif biyolojideki ufuk açıcı ilerlemeler, memeli kalbinin kayıp CM'leri^yenilemek için sınırlı bir yeteneğini ortaya çıkardı 2,3,4,5. Bu heyecan verici çalışma, doğuştan gelen büyüme mekanizmalarının yenilenme için konuşlandırılabileceği olasılığını artırdı. Yetişkin memeli kalbinde doğuştan gelen rejeneratif yanıtlar işlevsel olarak bulunmadığından, terapötik kalp rejenerasyonunun gerçekleştirilmesi için endojen onarımın sağlamlığını artıracak yöntemlere ihtiyaç vardır.

Doğuştan gelen kalp rejenerasyonu mekanizmaları, türler arasında korunmuş gibi görünmektedir. Yaralanmayı takiben, önceden var olan CM'ler zebra balığı ^6,7, semenderler ^8,9, fareler ^4,10, sıçanlar¹¹ ve domuzlar 12,13'te yeni CM'ler oluşturmak için çoğalır. Buna göre, birçok grup kardiyomiyogenezi teşvik edebilen mitojenleri tanımlamaya çalışmaktadır. Ancak, bu tür işler zordur. Yetişkin memeli CM'lerinin çoğalmasını sağlama görevi sadece göz korkutucu olmakla kalmaz, aynı zamanda nadir proliferatif olayları tanımlayabilmek de zordur ^1,14. Nadir döngüsel CM'leri tanımlamanın zorluğu, yetişkin memeli CM'lerinin tercihen endomitoza maruz kalma eğilimi ile birleşir. Örneğin, fare kalbinin yaralanmasından sonra, sınır bölgesindeki CM'lerin yaklaşık% 25'i hücre döngüsüne yeniden girer, ancak CM'lerin sadece% 3.2'si^4'ü böler. Çoğu döngüsel CM'ler genomlarını kopyaladıklarından, ancak sitokinez geçiremediklerinden, döngüsel CM'lerin sayısındaki bir artış için basitçe tahlil, iyi niyetli kardiyomiyogenez için belirsizdir. Bu nedenle, CM'ler tarafından nükleosit dahil edilmesi veya CM'ler üzerinde proliferatif belirteçlerin varlığı için yapılan deneyler tamamen rejenerasyonu göstermeyebilir. Kalp rejenerasyonu için daha fazla aday faktör ortaya çıktıkça, CM hiperplazisini daha iyi tanımlamak için tahlillere ihtiyaç vardır.

Soy izleme ile klonal analiz, hücrelerin ve soylarının doğrudan görüntülenmesine izin verdiği için kardiyomiyogenez testi için değerli bir yaklaşımdır. Klonal analiz için geleneksel yaklaşımlar, tek hücrelerin bir raportör gen ile nadir olarak etiketlenmesini içerir. Bununla birlikte, nadir hücrelerin tek renkli soy izlemesi, CM proliferasyonu gibi nadir olaylar için sınırlı bir değere sahip olabilir, çünkü çoğalan bir CM'yi etiketleme şansı düşüktür¹⁵. Alternatif olarak, çok renkli soy izleme, klonal analiz için duyarlılığı artırabilir¹⁶. Kısaca, tek tek hücreler genetik olarak rastgele birkaç floresan proteinden biri ile etiketlenir, öyle ki çoğalan hücreler, komşu floresan hücrelerden çözülebilen homojen renkli hücre kümeleri oluşturacaktır. Bu yöntem, çeşitli organlardaki büyümeyi izlemek için kullanılmıştır ve daha yakın zamanda memeli kalp rejenerasyonu çalışmalarına uygulanmıştır^17,18. Çok renkli soy izleme, embriyonik ve neonatal aşamalarda CM'lerin klonal genişlemesini tespit edebilirken, kalp hasarından sonra yetişkin fare kalbinde doğuştan gelen rejeneratif tepkiler kolayca tespit edilemez ^17,19. Çok renkli köken izlemenin hassasiyetini artırmaya yönelik bir yaklaşım, etiketleme düzeyini artırmak ve nadir olayları görselleştirme olasılığını artırmak olacaktır. Bununla birlikte, daha geniş etiketleme, benzer şekilde etiketlenmiş hücreleri, aynı floroforla bağımsız olarak etiketlenmiş hücrelere karşı ortak bir atadan yükseliyor olarak ayırt edememe pahasına gelir. Burada, yenidoğan fare kalbindeki klonal ilişkili CM'leri tanımlamak için en yakın komşu modellemesini kullanan bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem tarafsız, niceldir ve bir dizi etiketleme koşulu üzerinde çalışır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Fareleri idare etmek, hayatta kalma ameliyatları yapmak ve kalpleri toplamak için tüm prosedürler, yerel bir kurumsal hayvan kullanım komitesinin onayını gerektirir.

1. CM'lerin klonal analizi için fareler

1. Myh6-MerCreMer fareleri^20'yi Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw} fareleri²¹ ile çaprazlayarak Myh6-MerCreMer oluşturun; R26R-Gökkuşağı bitransgenik fareler.
   1. R26R-Gökkuşağı aleli için homozigot fare stoklarını koruyun ve Myh6-MerCreMer aleli için heterozigot farelerle çaprazlayın, böylece tüm deneyler R26R-Gökkuşağı aleli için heterozigot farelerde gerçekleştirilir. Alternatif olarak, renk çeşitliliğini artırmak için R26R-Rainbow aleli için homozigot fareler kullanın, ancak bu, EGFP, mCerulean, mOrange ve mCherry floroforlarını aslına uygun olarak ayırt edebilen bir görüntüleme sistemi gerektirecektir.
2. Kalp toplama sırasında genotipleme yapın.
   NOT: Myh6-MerCreMer fareleri, CM'lerde tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre rekombinazı eksprese eder ve 200 baz çifti (bp) ürünü oluşturmak için PCR primerleri CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) ve GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) kullanılarak genotiplenebilir. R26R-Gökkuşağı fareleri yapısal olarak EGFP'yi eksprese eder, ancak Cre aracılı rekombinasyondan sonra stokastik olarak mCerulean, mOrange veya mCherry'yi eksprese eder. R26R-Rainbow, PCR primerleri CTCTGCTGCCTCTCTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) ve TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R) ile genotiplendirilebilir. Yabani tip alel 350 bp'lik bir ürün verir ve Gökkuşağı aleli 250 bp'lik bir ürün verir.

2. Kriyoinjury ve kardiyomiyositlerin etiketlenmesi

1. Küçük değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi kriyoyaralanmalar^{gerçekleştirin 22,23}. Kalp durmasını tetiklemek için bir günlük fareleri (P1) 3 dakika boyunca kırılmış buz yatağına dikkatlice yerleştirin. Refleksif geri çekilme olmadan bir ayak parmağı çimdikleme yaparak yeterli anesteziyi onaylayın.
   NOT: Anestezi zamanlaması çok önemlidir. Fareler çok uzun süre soğutulursa hayatta kalma bozulabilir. Ek olarak, farelerin yaşı kritiktir. Rejeneratif kapasite, yaşamın ilk haftasında keskin bir şekilde azalır¹⁰.
2. Anestezi uygulanmış yavruyu soğuk bir paket üzerine ve cerrahi diseksiyon mikroskobu hedefi altında konumlandırın. Kalbin ön yüzeyini ortaya çıkarmak için 6. ve 4. kaburga arasında torakotomi yapmak için 5 mm'lik mikromakas kullanın.
3. Sıvı nitrojen içinde soğutulmuş bir kriyoprob kullanarak, probu 1-2 saniye boyunca sol ventrikül üzerine yerleştirin. Sahte yaralanmalar için, kriyoyaralanma olmadan torakotomi yapın.
   NOT: Kriyoyaralanma süresi, yaralanmanın derecesini belirler. Uzun süreli yaralanmalar hayatta kalma oranlarını azaltacaktır.
4. Kesi 0.15 mm çapında bir iğneye bağlı 6-0 polipropilen sütür ile kapatın.
5. Yavruyu hızlı bir şekilde ısıtın ve kan akışını sürdürmek için manuel olarak uyarın. Yavru kendiliğinden hareket etmeye başladığında, bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
6. İyileşen yavruları intraperitoneal olarak 20 μg tamoksifen ile enjekte edin. Bu noktada, gerekirse dikiş hattı boyunca% 0.25 bupivakain gibi analjezikler enjekte edin. Yavruları baraja geri getirin.
   NOT: Tek bir çöpten alınan yavrular birlikte geri kazanılır ve birlikte baraja geri gönderilir. Bu iş akışı, çöpün baraj tarafından hayatta kalmasını ve yeniden kabul edilmesini iyileştirir.

3. Kalplerin toplanması ve histolojik analiz için işlenmesi

1. Kalpleri yaralanmadan 20 gün sonra (dpi) veya doğum sonrası günde (P21) hasat edin, çünkü rejeneratif tepkiler bu zaman noktası^10'a kadar gözlemlenebilir. Önce fareleri bir CO₂ inhalasyon odasında ötenazi yapın ve daha sonra cerrahi bir mikroskoba aktarın.
   NOT: Ötenazi, hayvan kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmalıdır.
2. Yeterli anestezi onaylandıktan sonra, kalbi açığa çıkarmak için cerrahi mikromakas kullanarak çift torakotomi yapın. Daha sonra kalbi 1 mL 1 M KCl, 1 mL %4 paraformaldehit ve 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edin.
   NOT: Görüntü alımı sırasında otofloresansa neden olabilecek intraventriküler kan pıhtılarını sınırlamak için yeterli yıkama gereklidir.
3. Perfüzyondan sonra kalbi inceleyin ve en az 1 mL PBS içeren bir tüpe yerleştirin.
4. Gömmeyi optimize etmek için kalpleri kesmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Atriyumun altındaki yatay bir dilim, kısa eksenli bölümler için kalpleri gömmek için iyi bir yüzey sağlar.
   NOT: Alternatif olarak, uzun eksen bölümleri isteniyorsa kalp enine kesilebilir.
5. Kesilmiş kalpleri 1 mL %30 (ağırlıkça/hacimce) sükroz içinde 4 °C'de 12-18 saat yerleştirin. Numuneleri sükroz çözeltisinden çıkarın. Kesilmiş dokuyu doku dondurma ortamı kullanarak bloklara gömün.
6. Gömülü dokuyu kuru buz üzerinde hızlı bir şekilde dondurun ve blokları -80 °C'de saklayın.
7. Donmuş tüm kalp bloklarını bir kriyostat ile 10 μm'lik bölümlere ayırın, yüklü slaytlara monte edin ve slaytları -20 °C'de saklayın. Kalpleri 10 slaytta seri olarak bölümlere ayırın. Bu, başka bir bölüm eklemek için ilk slayta dönmeden önce 10 slaytın her birine bir bölüm monte edilerek yapılır. Böyle bir strateji, belirli bir slayttaki birden çok bölümde aynı CM'leri yakalama şansını sınırlar.
   NOT: Floresan kaybını önlemek için ışığa maruz kalmayı sınırlamaya dikkat edin.
8. Görüntüleme için hazır olduğunda, slaytları çözün ve PBS'de rehidrate edin. #1.5 cam lamel uygulamadan önce solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamı ekleyin. Kapaktan kaymış slaytları kapalı bir kapta 4 °C'de saklayın.
   NOT: Kriyoyaralanma için beklenen sonuçlar için, okuyucu bu konudaki önceki çalışmalara^{yönlendirilir 23}. Kardiyak bölümler yüksek otofloresan seviyelerine sahiptir. Bir lamel uygulanmadan önce Sudan Black gibi su verme maddelerinin kullanılması, otofloresansın azaltılmasına yardımcı olabilir. Bununla birlikte, ilgilenilen floroforların söndürülmesini önlemek için dikkatli olunmalıdır.

4. Görüntüleme

NOT: Aşağıdaki adımlar, mCerulean, EGFP, mOrange ve mCherry floroforlarını ayırt etmek için donatılmış filtre küplerine sahip dik bir geniş alan floresan sistemine sahip ticari bir mikroskobun (Malzeme Tablosuna bakın) kullanımı ve bu kurulumla ilişkili yazılım için geçerlidir (bkz. Malzeme Tablosu). Ek adımlar, kullanılan tam görüntüleme sistemine bağlı olarak değişecektir.

1. Bir slayt haritası oluşturmak için yalnızca GFP filtresiyle tüm slaytı 5x büyütmede görüntüleyin.
2. Slayt haritasında bozulmamış ve görüntüleme için sınırlı otomatik floresan olan bölümleri tek tek seçin. 10 slayttan oluşan setler halinde seri kesitleme nedeniyle, bitişik bölümler en az 100 μm aralıklı olacak ve aynı CM'lerin görüntülenmesini önleyecektir.
3. mCerulean, mOrange, mCherry ve EGFP filtreleriyle 20x objektif kullanarak tek tek bölümler için döşeme taraması görüntülemesi gerçekleştirin. Temsili resimler Şekil 1'de gösterilmiştir.
4. Görüntüleri, tek tek kanal bilgilerinin alınmasına izin veren bir formatta kaydedin. Dosyaları, kalbi, floroforu ve kalp içindeki bölümün konumunu tanımlamaya izin verecek bir formatta adlandırmaya dikkat edin. Aşağıdaki hesaplama adımları için sistematik bir adlandırma yaklaşımı gereklidir.

5. Etiketli CM'leri tanımlamak için görüntülerin analizi

1. Her kümeden sağlam olan görüntülenen bölümleri seçin ve tüm izleyicilere rastgele dağıtın. İzleyicilerin her görüntü için aşağıdaki adımlara uyduğundan emin olun.
2. Her kanal için (mCerulean, mOrange ve mCherry), kullanıcının etiketli hücreleri tanımlamasına yardımcı olmak üzere görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için ImageJ^24'teki 'Renk Dengesi' aracını kullanın.
   NOT: ImageJ, https://imagej.net'dan indirilebilen ücretsiz bir görüntü analiz aracıdır. Bu protokol 2.0.0-rc-69/1.52i sürümünü kullandı.
3. ImageJ'de, 'Analiz Et' açılır menüsünden 'Ölçümleri Ayarla'yı seçin. Açılan pencerede 'Alan | Kütle merkezi | Sınırlayıcı dikdörtgen | Eşik sınırı'.
   NOT: Görüntü çıkarma modülü bazen arka plan otofloresansına göre florofor sinyalini iyileştirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, gerçekleştirilirse, bir veri kümesindeki tüm görüntüler için çıkarma işlemi sistematik olarak yapılmalıdır.
4. İlgilendiğiniz resim açıkken, 'Araçlar'ı seçin ve ardından 'Analiz Et' açılır menüsünden 'ROI yöneticisi'ni seçin. Bu, 'ROI Yöneticisi' penceresi açılacaktır.
5. ImageJ araç çubuğundan 'Freehand seçimleri' aracını seçin ve ilgilendiğiniz hücreyi izleyin (Şekil 2A). İzlendikten sonra, 't' tuşuna basın veya 'ROI yöneticisi' penceresindeki '[t]' ekle düğmesini kullanın (Şekil 2B). Tek bir kanalın tüm hücreleri için tekrarlayın.
   NOT: Segmentasyon ve ROI'ler her kanal için ayrı ayrı yapılmalıdır.
6. Belirli bir kanal için tüm hücreler seçildikten sonra, ROI'leri bir .zip dosyası olarak kaydedin. Bunu, tek bir yatırım getirisinin vurgulanmadığından emin olmak için önce 'ROI Yöneticisi' penceresinde 'Seçimi Kaldır'ı seçerek yapın. Ardından, 'ROI yöneticisi' penceresindeki 'Diğer' sekmesine tıklayın ve 'Kaydet' seçeneğini seçin. Bu, ROI'lerin bir .zip dosyası olarak kaydedildiği masaüstü gezginini açacaktır.
7. ROI'lerin her biri için ölçümleri bir .csv dosyası olarak dışa aktarın. Bunu yapmak için, yine 'Seçimi Kaldır'ı seçerek tek bir yatırım getirisinin vurgulanmadığından emin olun ve ardından 'Yatırım Getirisi yöneticisi' penceresinde 'Ölç'ü seçin. Bu, daha önce seçilen tüm ölçümleri içeren yeni bir 'Sonuçlar' penceresi açacaktır.
8. 'Sonuçlar' penceresinde 'Dosya'yı seçin, ardından açılır menüden 'Farklı kaydet'i seçin (Şekil 2C). Bu, masaüstü gezginini bir kez daha açacaktır, böylece dosya .csv biçiminde kaydedilebilir.
   NOT: Bir sonraki kanalı bölümlere ayırmaya geçmeden önce ROI'leri ve ölçümleri kaydettiğinizden emin olun.
9. Dosyaları, kalbi, kanalı ve kalp içindeki bölümün konumunu tanımlamaya izin verecek bir formatta adlandırmaya dikkat edin. Örneğin, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (ör. ROI'ler için 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' ve karşılık gelen ölçümler için 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv').
   NOT: Aşağıdaki kod, yukarıdaki adlandırma kuralını varsayar. Farklı bir adlandırma kuralı, kodda değişiklik yapılmasını gerektirir.

6. İstatistiksel analiz

NOT: Aynı floroforu taşıyan hücreler, klonal olarak türetilmiş hücrelerin (akraba) ve aynı floroforu (akraba olmayan) ifade etmek için rastgele bir rekombinasyon olayına maruz kalan ilgisiz hücrelerin bir karışımıdır. Önceki verilere¹⁷ dayanarak, akraba hücrelerinin, aynı floroforu ifade eden akraba olmayan hücrelerden daha yakın bir fiziksel yakınlığa sahip olduğu varsayılmaktadır. Böylece, akraba ve akraba olmayan hücreler bir mesafe eşiğine göre ayırt edilebilir. Bununla birlikte, eşiği belirlemek için, akraba ve akraba olmayan hücreler için en yakın komşu dağılımlarının dekonvolvasyonunun kaldırılması gerekir. Neyse ki, akraba olmayan hücreler için en yakın komşu dağılımları, her hücreden farklı bir florofor taşıyan en yakın hücreye en yakın komşu değerleri değerlendirilerek tahmin edilebilir. Burada, klonaliteyi tanımlamak için bir eşik mesafesini istatistiksel olarak belirlemek ve hücreler arasında bir akrabalık olasılığı atamak için metodoloji sunulmaktadır.

1. Bölüm 5'ten elde edilen .csv dosyalarını kullanarak, bir kalp dilimi içindeki her hücre için en yakın komşu mesafelerini hesaplayın. Bu sonuçları kanal içi (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange ve mCherry-mCherry) ve kanallar arası (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry ve mCherry-mCerulean) mesafeler halinde derleyin. Sonuçları iki .csv dosyasına kaydedin: biri kanal içi ve diğeri kanallar arası mesafeler için.
   1. numpy ve pandas kitaplıklarını gerektiren Python²⁵ kodunu yükleyin.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Python snippet_6_1.py kullanarak kanal içi mesafeler ve kanallar arası mesafeler için mesafeleri hesaplayın ve .csv dosyalarını dışa aktarın.
2. Kanal içi ve kanallar arası mesafeleri bir R²⁶ veri çerçevesine okuyarak kalp tanımlayıcılarını kategorik bir değişkene dönüştürün. Aykırı değerleri en aza indirmek için en yakın komşu histogramlarına (Şekil 3A,C) bakarak geçici olarak seçilen bir eşik uygulayın. Kanal arası ve kanal içi mesafelerin %90'ından fazlasını kapsayan bir eşik seçtiğinizden emin olun, ancak en yakın komşu mesafelerindeki gürültüye aşırı uyum sağlamaktan kaçınmak için uzun kuyruğu hariç tutun. Bu protokol 400 μm'lik bir eşik kullanır (Şekil 3). Bu adımı yürütmek için Rscript snippet_6_2.R kullanın.
   NOT: Alternatif olarak, birden çok dilim ayrı değişkenler olarak modellenebilir. Bu protokol, modelleme ve tahmin kolaylığı için model karmaşıklığını kalp seviyesiyle sınırlar.
3. Kanal içi ve kanallar arası mesafeler için doğal logaritmaları elde edin. Hücreler yer kaplayan, nokta olmayan varlıklar olduğundan, minimum en yakın komşu mesafe dağılımı sıfırdan farklı bir değer etrafında ortalanır ve hücre çiftleri arasındaki maksimum mesafe medyan değerlerden önemli ölçüde daha yüksek olabileceğinden asimetrik kuyruklara sahiptir (Şekil 3A,C). Bu tür dağılımları modellemek için log-normal dağılımı kullanın (Şekil 3B,D). Bunu Rscript snippet_6_3.R kullanarak yapın.
4. Akraba (α₂, σ²₂) ve akraba olmayan (α₁, σ²₁) en yakın komşu dağılımlarının ortalamalarını ve varyanslarını ve akraba dağılımından (π=e^β/(1+e^β)) kaynaklanan kanal içi mesafelerin olasılığını tahmin etmek için aşağıdaki Bayes modelini kullanın:
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Ünif(2,6)
   α₂ ~ Ünif(1,5)
   β ~ Ünif(-5,0)
   Unif(a,b), [a,b] aralığındaki tekdüze dağılımdır, N(μ,σ²|lσ 2 , (l,u) aralığıyla sınırlı normal dağılımdır, T₁(0,1|x>0), pozitif yarım çizgiyle sınırlı standart Cauchy dağılımıdır (1 serbestlik dereceli T), bw.dist_i , kanal çifti arasında kaydedilen i^. mesafedir ve wi.dist_i , kanal içi çift mesafesi ile kaydedilen i^'dir . Kanal içi kaydedilen mesafelerin, akraba ve akraba olmayan hücre çiftlerinin karışımını yansıtan iki bileşenli bir karışım dağılımına sahip olduğuna dikkat edin.
   1. Mümkünse modele bilgilendirici öncelikler sağlayın. Örneğin, bu protokol akraba hücrelerin birbirine akraba olmayan hücrelere göre daha yakın olmasını bekler, bu nedenle bu, mesafelerin dağılımının ortalaması için bir ön olarak sağlanır. Ardından, parametre tahmini için runjags²⁷ ve coda²⁸ R paketlerini ve JAGS²⁹ programını kullanın (Rscript snippet_6_4.R).
5. JAGS modelini, mevcut CPU sayısına karşılık gelen zincir sayısıyla yürütün. Bu adımı gerçekleştirmek için Rscript snippet_6_5.R kullanın. Yazılımın yakınsama olana kadar çalışmasına izin verin.
6. Algoritmanın yakınsamasını test etmek için etkin örneklem boyutu (runjag'larla kullanılabilir), Gelman-Rubin yakınsama tanılaması (runjag'larla kullanılabilir) ve otokorelasyonu (autocorr/autocorr.diag coda'da mevcuttur) gibi ölçümleri kullanın. Rscript snippet_6_6.R kullanarak en yakın komşu mesafeleri için gerçek ve tahmini değerlerin nicelik düzeyinde bir karşılaştırmasını çizen bir Q-Q grafiğini inceleyerek en yakın komşu mesafeleri için tahmini modelin uygunluğunu doğrulayın (Şekil 4C,F). Bu komut dosyası, kullanıcının Komut 6'nın çıktısına göre snippet_6_6.R'nin 25-29. satırlarındaki değerleri düzenlemesini gerektirir.
   NOT: İdeal olarak,³⁰ parametresinin her biri için 10.000'den büyük bir etkin örneklem boyutu (SSeff) elde edilmelidir. Bununla birlikte, 2.500'den büyük bir SSeff, bazı karmaşık modeller için uygun olabilir. Gelman Rubin tanılaması, mükemmel yakınsama için 1,00'dir ve tatmin edici yakınsama için 1,05'ten küçük olmalıdır. Yüksek otokorelasyon, zincirler içinde yavaş karıştırmayı gösterir ve yavaş yakınsamanın bir göstergesidir. Otokorelasyon grafiği, iyi bir model olması durumunda üstel bir bozulmayı takip etmelidir. Gerçek ve modellenmiş en yakın komşu dağılımlarının Q-Q grafiği (Şekil 4C,F) köşegeni mümkün olduğunca yakından takip etmelidir.
7. Modellerin doğruluğunu doğruladıktan sonra, mesafelerinin bir fonksiyonu olarak bir çift hücrenin akraba olma olasılığını elde edin. Kanal içi hücrelerin akraba olma olasılığının olup olmadığını belirlemek için bir eşik mesafesi belirlemek için, akraba olma olasılığının 0,5'in altına düştüğü mesafeyi belirleyin. Bu, Rscript snippet_6_7.R kullanılarak yapılabilir.
   NOT: Deneysel hedeflere dayalı olarak alternatif eşikler seçilebilir. Bazı uygulamalar için, eşikler ilgili olmayabilir ve bir akraba çifti olma olasılığı doğrudan hücre çiftlerini ağırlıklandırmak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yenidoğan kriyoyaralanma protokolünü takiben, yaralanmalı ve yaralanmasız P21 kalpleri verilmelidir. Kriyoinjurlu kalpler iyi sınırlı bir yaralanmaya sahipken, sahte kalplerin yüzeyi pürüzsüz ve homojendir. Kriyoinyaralı kalplerde, yaralanma bölgesi kalpten kalbe tutarlı olmalıdır. Mikroskopi sonrası Şekil 1'e benzer görüntüler elde edilmelidir. Görüntü çözünürlüğünün tek tek CM'lerin tanımlanmasına izin verdiğini ve gör?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Çok renkli soy izleme, tek hücre çözünürlüğü ile organ büyümesi modellerini belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, çok renkli soy izlemenin önemli bir sınırlaması, nadir olayları tanımlama hassasiyetini azaltabilen hücrelerin seyrek etiketlenmesine duyulan ihtiyaçtır. Düşük parankimal hücre döngüsü seviyelerine sahip kalp gibi organlar için bu, büyüme tepkilerinin hafife alınmasına yol açabilir. Burada, yenidoğan faresinde büy?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software