최근접 이웃 모델링을 사용한 Neonatal Mouse Heart의 클론 분석

요약

여기에 제시된 프로토콜은 다색 계통 추적 및 최근접 이웃 모델링을 사용하여 마우스의 성장 및 재생 중에 클론 유래 심근세포를 식별하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근 방식은 객관적이고 다양한 라벨링 조건에서 작동하며 다양한 이미지 분석 파이프라인을 통합하도록 조정할 수 있습니다.

초록

손실되거나 기능 장애가 있는 심근을 대체함으로써 조직 재생은 심부전을 치료할 수 있는 유망한 접근 방식입니다. 그러나 진정한 심장 재생을 감지하는 것은 잠재적인 재생 인자의 검증을 제한합니다. 새로운 심근세포를 검출하는 한 가지 방법은 클론 분석을 통한 다색 계통 추적입니다. 클론 분석 실험은 너무 희박한 라벨링 조건은 심근세포 증식과 같은 드문 이벤트에 대한 민감도가 부족하고 확산 라벨링은 클론을 분해하는 능력을 제한하기 때문에 수행하기 어려울 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 심근세포 클론을 해결하기 위해 최근접 이웃 분포의 통계적 모델링을 사용하여 신생아 마우스 심장의 클론 분석을 수행하는 프로토콜입니다. 이 접근법은 다양한 라벨링 조건에서 클론을 분리할 수 있게 하고 심근세포 증식 및 재생을 정량화하기 위한 강력한 분석 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 조직에 적용할 수 있으며 조직 재생을 연구하는 데 광범위하게 사용할 수 있습니다.

서문

심부전의 조직학적 특징은 손상, 노화 또는 세포사멸 후 심근세포(CM)의 소실입니다¹. 조직 재생을 통해 손실되거나 기능 장애가 있는 심근을 보충하는 것은 심부전 환자를 치료하기 위한 잠재적인 치료 전략입니다. 지난 수십 년 동안 발달 및 재생 생물학의 획기적인 발전으로 포유류의 심장이 손실된 CM을 보충하는 능력이 제한되어 있다는 사실이 밝혀졌습니다 ^2,3,4,5. 이 흥미로운 연구는 타고난 성장 메커니즘이 재생을 위해 배치될 수 있는 가능성을 제기했습니다. 성인 포유류의 심장에는 선천성 재생 반응이 기능적으로 없기 때문에 치료적 심장 재생이 실현되기 위해서는 내인성 복구의 견고성을 향상시키는 방법이 필요합니다.

선천성 심장 재생의 메커니즘은 종에 걸쳐 보존되는 것으로 보입니다. 부상 후 기존 CM이 증식하여 제브라피시 ^6,7, 도마뱀 ^8,9, 생쥐 ^4,10, 쥐¹¹ 및 돼지^12,13에서 새로운 CM을 생성합니다. 따라서 많은 그룹에서 심근 형성을 촉진할 수 있는 유사분열(mitogen)을 규명하기 위해 노력하고 있습니다. 그러나 이러한 작업은 쉽지 않습니다. 성체 포유류 CM을 증식시키는 것은 벅찬 일일 뿐만 아니라 희귀한 증식 사건을 식별하는 것도 어렵습니다 ^1,14. 희귀한 순환 CM을 식별하는 문제는 성체 포유류 CM이 우선적으로 자궁내막증을 겪는 경향으로 인해 더욱 복잡해집니다. 예를 들어, 마우스 심장 손상 후 경계 영역에 있는 CM의 거의 25%가 세포 주기에 다시 진입하지만 CM의 3.2%만이⁴를 분열합니다. 대부분의 사이클링 CM은 게놈을 복제하지만 사이토키네시스(cytokinesis)를 거치지 않기 때문에, 단순히 사이클링 CM의 수 증가를 분석하는 것은 진정한 심근 형성이라고 보기에는 모호합니다. 따라서, CM에 의한 뉴클레오시드 혼입 또는 CM에 증식 마커의 존재에 대한 분석은 재생을 완전히 나타내지 않을 수 있습니다. 심장 재생을 위한 후보 인자가 더 많이 등장함에 따라 CM 증식을 더 잘 식별하기 위한 분석이 필요합니다.

계통 추적에 의한 클론 분석은 세포와 그 자손을 직접 시각화할 수 있기 때문에 심근 형성을 분석하는 데 유용한 접근 방식입니다. 클론 분석을 위한 전통적인 접근 방식에는 리포터 유전자를 가진 단일 세포의 희귀 라벨링이 포함됩니다. 그러나 희귀 세포의 단색 계통 추적은 증식하는 CM을 표지할 가능성이 낮기 때문에 CM 증식과 같은 드문 사건에 대해 제한된 가치를 가질 수 있습니다¹⁵. 또는 다색 계통 추적은 클론 분석에 대한 감도를 높일 수 있습니다¹⁶. 간단히 말해서, 개별 세포는 무작위로 여러 형광 단백질 중 하나로 유전적으로 표지되며, 증식하는 세포는 인접한 형광 세포에서 분리될 수 있는 균일한 색의 세포 클러스터를 생성합니다. 이 방법은 다양한 장기의 성장을 추적하는 데 사용되어 왔으며, 최근에는 포유류의 심장 재생 연구에 적용되고 있습니다^17,18. 다색 계통 추적은 배아 및 신생아 단계에서 CM의 클론 확장을 감지할 수 있지만, 심장 손상 후 성인 마우스 심장에서는 선천성 재생 반응이 쉽게 감지되지 않습니다^17,19. 다색 계통 추적의 민감도를 향상시키는 한 가지 방법은 라벨링 수준을 높이고 희귀 이벤트를 시각화할 확률을 높이는 것입니다. 그러나 더 넓은 라벨링은 공통 조상에서 발생한 것으로 유사하게 라벨링된 세포와 동일한 형광단으로 독립적으로 라벨링된 세포를 구별할 수 없다는 대가를 치르게 됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 최근접 이웃 모델링을 사용하여 신생아 마우스 심장에서 클론 관련 CM을 식별하는 것입니다. 이 방법은 편향되지 않고 정량적이며 다양한 라벨링 조건에서 작동합니다.

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프로토콜

생쥐를 다루고, 생존 수술을 수행하고, 심장을 적출하는 모든 절차는 지역 기관 동물 사용 위원회의 승인을 필요로 합니다.

1. CM의 클론 분석을 위한 마우스

1. 크로스 Myh6-MerCreMer 마우스²⁰ Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw} 마우스²¹을 사용하여 Myh6-MerCreMer를 생성합니다. R26R-레인보우 쌍형전환 마우스.
   1. R26R-Rainbow 대립유전자에 대해 동형접합 마우스의 재고를 유지하고 Myh6-MerCreMer 대립유전자에 대해 이형접합 마우스와 교배하여 모든 실험이 R26R-Rainbow 대립유전자에 대해 이형접합 마우스에서 수행되도록 합니다. 또는 R26R-Rainbow 대립유전자에 동형접합 마우스를 사용하여 색상 다양성을 높일 수 있지만, 이를 위해서는 EGFP, mCerulean, mOrange 및 mCherry 형광단을 충실하게 구별할 수 있는 이미징 시스템이 필요합니다.
2. 심장 채취 시 유전형 분석을 수행합니다.
   참고: Myh6-MerCreMer 마우스는 CM에서 타목시펜 유도성 Cre 재조합효소를 발현하며 PCR 프라이머 CGTACTGACGGTGGGAGAAT(Cre-F) 및 GTGGCAGATGGCGCGGCAACA(Cre-R)를 사용하여 유전자형을 분석하여 200 염기쌍(bp) 생성물을 생성할 수 있습니다. R26R-Rainbow 마우스는 EGFP를 구성적으로 발현하지만 Cre 매개 재조합 후 mCerulean, mOrange 또는 mCherry를 확률적으로 발현합니다. R26R-Rainbow는 PCR 프라이머 CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) 및 TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R)로 유전자형 분석을 할 수 있습니다. 야생형 대립유전자는 350bp 산물을 제공하고 무지개 대립유전자는 250bp 산물을 제공합니다.

2. cryyoinjury 및 심근세포의 라벨링

1. 앞서 설명한 대로 약간의 수정으로 냉동 손상을 수행합니다^22,23. 생후 1일 된 생쥐(P1)를 으깬 얼음 바닥에 3분 동안 조심스럽게 올려 놓아 심정지를 유발합니다. 반사적 철수 없이 발가락 꼬집기를 수행하여 적절한 마취를 확인합니다.
   참고: 마취 타이밍이 중요합니다. 쥐를 너무 오랫동안 냉각시키면 생존이 손상될 수 있습니다. 또한 생쥐의 나이가 중요합니다. 재생 능력은 생후 첫 주에 급격히 감소한다¹⁰.
2. 마취된 강아지를 냉찜질팩에 올려놓고 외과용 해부 현미경의 대물렌즈 아래에 놓습니다. 6mm 마이크로가위를 사용하여 4번째 갈비뼈와 5번째 갈비뼈 사이에 개흉술을 수행하여 심장의 앞쪽 표면을 노출시킵니다.
3. 액체 질소로 냉각된 극저온 프로브를 사용하여 프로브를 좌심실에 1-2초 동안 놓습니다. 가짜 부상의 경우 냉동 손상 없이 개흉술을 시행하십시오.
   알림: 냉동 손상의 지속 기간에 따라 부상의 정도가 결정됩니다. 부상이 장기화되면 생존율이 떨어집니다.
4. 직경 0.15mm의 바늘에 부착된 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다.
5. 강아지를 빠르게 따뜻하게 하고 수동으로 자극하여 혈류를 재개합니다. 강아지가 자발적으로 움직이면 가열 패드에 놓습니다.
6. 회복된 강아지에게 20μg의 타목시펜을 복강내 주사합니다. 이 시점에서 필요한 경우 봉합사 라인을 따라 0.25% 부피바카인과 같은 진통제를 주사합니다. 새끼를 댐으로 돌려보냅니다.
   참고: 한 깔짚에서 새끼를 낳은 새끼들은 함께 회수되어 함께 댐으로 돌아갑니다. 이 워크플로우는 댐 옆의 쓰레기의 생존과 재수용을 향상시킵니다.

3. 심장 채취 및 조직학적 분석을 위한 가공

1. 손상 후 20일(dpi) 또는 출생 후일(P21)에 심장을 적출하면 이 시점까지 재생 반응이 관찰될 수 있습니다¹⁰. 먼저 CO₂ 흡입실에서 마우스를 안락사시킨 다음 수술용 현미경으로 옮깁니다.
   참고: 안락사는 동물 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되어야 합니다.
2. 충분한 마취가 확인되면 수술용 마이크로 가위를 사용하여 심장을 노출시키는 이중 개흉술을 시행합니다. 그런 다음 1mL의 1M KCl, 1mL의 4% 파라포름알데히드 및 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 심장에 관류합니다.
   참고: 이미지 획득 중 자가형광을 유발할 수 있는 심실 내 혈전을 제한하려면 적절한 세척이 필요합니다.
3. 관류 후 심장을 절개하여 최소 1mL의 PBS가 들어 있는 튜브에 넣습니다.
4. 박개를 최적화하기 위해 해부 현미경을 사용하여 심장을 다듬습니다. 아트리움 아래의 수평 슬라이스는 짧은 축 단면을 위해 심장을 삽입하기 위한 좋은 표면을 제공합니다.
   참고: 또는 장축 절편이 필요한 경우 심장을 가로로 절단할 수 있습니다.
5. 트리밍한 심장을 30%(wt/vol) 자당 1mL에 4°C에서 12-18시간 동안 놓습니다. 자당 용액에서 샘플을 제거합니다. 조직 동결 매체를 사용하여 트리밍된 조직을 블록에 삽입합니다.
6. 내장된 조직을 드라이아이스에 빠르게 얼리고 블록을 -80°C에서 보관합니다.
7. 저온 유지 장치를 사용하여 동결된 전체 심장 블록을 10μm 절편으로 절단하고, 전하를 띤 슬라이드에 장착하고, -20°C에서 슬라이드를 보관합니다. 10개의 슬라이드에 걸쳐 하트를 연속적으로 나눕니다. 이 작업은 첫 번째 슬라이드로 돌아가서 다른 섹션을 추가하기 전에 10개의 슬라이드 각각에 섹션을 탑재하여 수행됩니다. 이러한 전략은 지정된 슬라이드의 여러 섹션에서 동일한 CM을 캡처할 기회를 제한합니다.
   알림: 형광 손실을 방지하기 위해 빛에 대한 노출을 제한하도록 주의하십시오.
8. 이미징할 준비가 되면 슬라이드를 해동하고 PBS에서 수분을 보충합니다. #1.5 유리 커버슬립을 적용하기 전에 페이드 방지 장착 매체를 추가하십시오. 미끄럼 방지 슬라이드는 4°C의 뚜껑이 있는 용기에 넣어 보관하십시오.
   참고: 냉동 손상에 대한 예상 결과에 대해 독자는 이 주제²³에 대한 이전 작업으로 안내됩니다. 심장 절편은 높은 수준의 자가형광을 가지고 있습니다. 커버슬립을 적용하기 전에 Sudan Black과 같은 담금질제를 사용하면 자가형광을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 관심 형광단이 담금질되지 않도록 주의해야 합니다.

4. 이미징

참고: 아래 단계는 mCerulean, EGFP, mOrange 및 mCherry 형광단을 구별할 수 있는 필터 큐브가 장착된 직립 광시야 형광 시스템과 이 설정과 관련된 소프트웨어가 있는 상용 현미경( 재료 표 참조)의 사용에 적용됩니다( 재료 표 참조). 추가 단계는 사용되는 정확한 이미징 시스템에 따라 달라집니다.

1. GFP 필터만으로 전체 슬라이드를 5배 확대하여 슬라이드 맵을 만듭니다.
2. 슬라이드 맵에서 손상되지 않고 이미징을 위한 자가형광이 제한된 개별 섹션을 선택합니다. 10개의 슬라이드 세트의 연속 절편으로 인해 인접한 절편은 최소 100μm 떨어져 있어 동일한 CM의 이미징을 방지할 수 있습니다.
3. mCerulean, mOrange, mCherry 및 EGFP 필터와 함께 20x 대물렌즈를 사용하여 개별 섹션에 대한 타일 스캔 이미징을 수행합니다. 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다.
4. 개별 채널 정보를 검색할 수 있는 형식으로 이미지를 저장합니다. 심장, 형광단 및 심장 내 절편의 위치를 식별할 수 있는 형식으로 파일 이름을 지정하도록 주의하십시오. 아래의 계산 단계에는 체계적인 명명 접근 방식이 필요합니다.

5. 라벨링된 CM을 식별하기 위한 이미지 분석

1. 각 세트에서 손상되지 않은 이미징 절편을 선택하고 모든 스크리너에게 무작위로 배포합니다. 스크리너가 각 이미지에 대해 다음 단계를 준수하는지 확인합니다.
2. 각 채널(mCerulean, mOrange 및 mCherry)에 대해 ImageJ²⁴의 'Color Balance' 도구를 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 조정하여 사용자가 레이블이 지정된 셀을 식별할 수 있도록 합니다.
   참고: ImageJ는 https://imagej.net 에서 다운로드할 수 있는 무료 이미지 분석 도구입니다. 이 프로토콜은 버전 2.0.0-rc-69/1.52i를 사용했습니다.
3. ImageJ의 '분석' 드롭다운 메뉴에서 '측정 설정'을 선택합니다. 열리는 창에서 '영역 | 질량 중심 | 경계 사각형 | Limit to threshold'입니다.
   참고: 이미지 감산 모듈은 배경 자가형광에 비해 형광단 신호를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 수행하는 경우 데이터 세트의 모든 이미지에 대해 빼기를 체계적으로 수행해야 합니다.
4. 관심 있는 이미지를 연 상태에서 '도구'를 선택한 다음 '분석' 드롭다운 메뉴에서 'ROI 관리자'를 선택합니다. 그러면 'ROI Manager' 창이 열립니다.
5. ImageJ 도구 모음에서 'Freehand selections' 도구를 선택하고 관심 있는 셀을 추적합니다(그림 2A). 추적이 완료되면 't'를 누르거나 'ROI manager' 창에서 'Add [t]' 버튼을 사용합니다(그림 2B). 단일 채널의 모든 셀에 대해 반복합니다.
   참고: 세분화 및 ROI는 각 채널에 대해 개별적으로 수행해야 합니다.
6. 지정된 채널의 모든 셀을 선택했으면 ROI를 .zip 파일로 저장합니다. 먼저 'ROI Manager' 창에서 'Deselect'를 선택하여 단일 ROI가 강조 표시되지 않도록 합니다. 그런 다음 'ROI 관리자' 창에서 '더보기' 탭을 클릭하고 '저장' 옵션을 선택합니다. 그러면 ROI가 .zip 파일로 저장되는 데스크톱 탐색기가 열립니다.
7. 각 ROI에 대한 측정값을 .csv 파일로 내보냅니다. 이렇게 하려면 '선택 취소'를 다시 선택하여 단일 ROI가 강조 표시되지 않았는지 확인한 다음 'ROI 관리자' 창에서 '측정'을 선택합니다. 그러면 이전에 선택한 모든 측정값이 포함된 새로운 '결과' 창이 열립니다.
8. '결과' 창에서 '파일'을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 '다른 이름으로 저장'을 선택합니다(그림 2C). 그러면 바탕 화면 탐색기가 다시 한 번 열리므로 파일을 .csv 형식으로 저장할 수 있습니다.
   참고: 다음 채널 세그먼트로 이동하기 전에 ROI와 측정값을 저장해야 합니다.
9. 심장, 채널 및 심장 내 섹션의 위치를 식별할 수 있는 형식으로 파일 이름을 지정할 때 주의하십시오. 예를 들어 'HeartType#_Set#_Section#_Channel'입니다(예: ROI의 경우 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip', 해당 측정값의 경우 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv').
   참고: 아래 코드는 위의 명명 규칙을 가정합니다. 다른 명명 규칙을 사용하려면 코드를 수정해야 합니다.

6. 통계 분석

참고: 동일한 형광단을 가진 세포는 클론 유래 세포(kin)와 관련이 없는 세포가 혼합되어 동일한 형광단(non-kin)을 발현하기 위해 무작위 재조합 이벤트를 겪었습니다. 이전 데이터¹⁷에 기초하여, 친족 세포는 동일한 형광단을 발현하는 비친족 세포보다 물리적 근접성이 더 가까운 것으로 가정됩니다. 따라서, 친족 세포와 비친족 세포는 거리 임계값에 기초하여 구별될 수 있다. 그러나 임계값을 결정하기 위해서는 친족 세포와 비친족 세포에 대한 최근접 이웃 분포를 디컨볼루션해야 합니다. 다행히도, 비친족 세포에 대한 최근접 이웃 분포는 각 세포에서 다른 형광단을 가진 가장 가까운 세포까지의 최근접 이웃 값을 평가하여 추정할 수 있습니다. 여기에서는 클론성을 정의하기 위한 임계값 거리를 통계적으로 결정하고 세포 간의 친족 확률을 할당하는 방법론을 제시합니다.

1. 섹션 5에서 얻은 .csv 파일을 사용하여 심장 슬라이스 내의 각 세포에 대한 가장 가까운 이웃 거리를 계산합니다. 이러한 결과를 채널 내(mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange, mCherry-mCherry) 및 채널 간(mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry 및 mCherry-mCerulean) 거리로 컴파일합니다. 결과를 두 개의 .csv 파일로 저장합니다: 하나는 채널 내 거리에 대한 것이고 다른 하나는 채널 간 거리에 대한 것입니다.
   1. numpy 및 pandas 라이브러리가 필요한 Python²⁵ 코드를 설치합니다.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. python snippet_6_1.py를 사용하여 거리를 계산하고 채널 내 거리 및 채널 간 거리에 대한 .csv 파일을 내보냅니다.
2. 채널 내 및 채널 간 거리를 R²⁶ 데이터 프레임으로 읽어 심장 식별자를 범주형 변수로 변환합니다. 이상값을 최소화하기 위해 최근접 이웃 히스토그램(그림 3A,C)을 확인하여 임시로 선택한 임계값을 적용합니다. 채널 간 및 채널 내 거리의 90% 이상을 커버하는 임계값을 선택해야 하며, 긴 꼬리는 제외하여 가장 가까운 이웃 거리가 멀 때 노이즈에 과적합되지 않도록 해야 합니다. 이 프로토콜은 400μm의 임계값을 사용합니다(그림 3). Rscript snippet_6_2.R 을 사용하여 이 단계를 실행합니다.
   참고: 또는 여러 슬라이스를 개별 변수로 모델링할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모델링 및 추정을 용이하게 하기 위해 모델 복잡성을 심장 수준으로 제한합니다.
3. 채널 내 및 채널 간 거리에 대한 자연 로그를 구합니다. 셀은 공간을 차지하는 점이 아닌 개체이기 때문에 최소 최근접 이웃 거리 분포는 0이 아닌 값을 중심으로 하며 셀 쌍 간의 최대 거리가 중앙값보다 훨씬 높을 수 있기 때문에 비대칭 꼬리를 갖습니다(그림 3A,C). 로그 정규 분포를 사용하여 이러한 분포를 모델링합니다(그림 3B,D). Rscript snippet_6_3.R을 사용하여 이 작업을 수행합니다.
4. 다음 베이지안 모델을 사용하여 kin(α₂, σ²₂) 및 non-kin(α₁, σ²₁) 최근접 이웃 분포의 평균 및 분산, 그리고 kin 분포(π=e^β/(1+e^β))에서 발생하는 채널 내 거리의 확률을 추정합니다.
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ 유니프(-5,0)
   여기서 Unif(a,b)는 구간 [a,b]의 균일 분포이고, N(μ,σ²|l2 가 구간 (l,u)로 제한된 정규 분포이고, T₁(0,1|x>0)은 양의 반선으로 제한된 표준 코시 분포(자유도가 1인 T)입니다. bw.dist_i 는 기록된 i^번째 채널 간 쌍 거리이고 wi.dist_i 는 i^번째 기록된 채널 내 쌍 거리입니다. 채널 내 기록된 거리에는 친족 세포 쌍과 비친족 세포 쌍의 혼합을 반영하는 2성분 혼합 분포가 있습니다.
   1. 가능한 경우 모델에 정보 사전 조건을 제공합니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 친족 세포가 비친족 세포보다 서로 더 가까울 것으로 예상하므로 이는 거리 분포의 평균에 대한 선행으로 제공됩니다. 그런 다음 runjags²⁷ 및 coda²⁸ R 패키지와 JAGS²⁹ 프로그램을 사용하여 매개변수를 추정합니다(Rscript snippet_6_4.R).
5. 사용 가능한 CPU의 수에 해당하는 체인의 수로 JAGS 모델을 실행합니다. Rscript snippet_6_5.R 을 사용하여 이 단계를 수행합니다. 수렴할 때까지 소프트웨어를 실행합니다.
6. 메트릭을 사용하여 유효 표본 크기(runjags에서 사용 가능), Gelman-Rubin 수렴 진단(runjags에서 사용 가능) 및 자기 상관(coda에서 사용 가능한 autocorr/autocorr.diag)과 같은 알고리즘의 수렴을 테스트합니다. Rscript snippet_6_6.R 을 사용하여 최근접 이웃 거리에 대한 실제 값과 추정 값의 분위수 수준 비교를 플롯하는 Q-Q 플롯을 검사하여 최근접 이웃 거리에 대한 추정 모델의 적합도를 확인합니다(그림 4C,F). 이 스크립트를 사용하려면 사용자가 명령 6의 출력을 기반으로 snippet_6_6.R의 25-29줄에 있는 값을 편집해야 합니다.
   참고: 이상적으로는 각 파라미터³⁰에 대해 10,000 이상의 유효 샘플 크기(SSeff)를 얻어야 합니다. 그러나 2,500보다 큰 SSeff는 일부 복잡한 모델에 적합할 수 있습니다. Gelman Rubin 진단은 완벽한 수렴을 위해 1.00이고 만족스러운 수렴을 위해 1.05 미만이어야 합니다. 높은 자기상관은 체인 내에서 느린 혼합을 나타내며 느린 수렴을 나타내는 지표입니다. 자기 상관 플롯은 좋은 모델의 경우 지수 감소를 따라야 합니다. 실제 및 모델링된 최근접 이웃 분포의 Q-Q 플롯(그림 4C,F)은 대각선을 최대한 가깝게 따라야 합니다.
7. 모델의 정확성을 확인한 후 한 쌍의 세포가 거리의 함수로 친족이 될 확률을 얻습니다. 채널 내 세포가 친족일 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위한 임계값 거리를 결정하려면 친족이 될 확률이 0.5 미만으로 떨어지는 거리를 식별합니다. 이것은 Rscript snippet_6_7.R을 사용하여 수행할 수 있습니다.
   참고: 실험 목표에 따라 대체 임계값을 선택할 수 있습니다. 일부 응용 프로그램의 경우 임계값이 관련이 없을 수 있으며 친족 쌍이 될 확률은 세포 쌍에 가중치를 부여하는 데 직접 사용될 수 있습니다.

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결과

신생아 냉동 손상에 대한 프로토콜을 따르면 부상이 있거나 없는 P21 심장이 생성되어야 합니다. 냉동 손상 된 심장은 잘 둘러싸인 상처를 가지고 있지만 가짜 심장의 표면은 매끄럽고 균질합니다. 냉동 손상 심장의 경우 부상 부위는 심장에서 심장으로 일관되어야 합니다. 현미경 검사 후 그림 1과 유사한 이미지를 얻어야 합니다. 이미지 해상도를 ?...

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토론

Multicolor 계통 추적은 단일 세포 해상도로 장기 성장 패턴을 식별하는 강력한 접근 방식입니다. 그러나 다색 계통 추적의 주요 한계는 세포의 희소 라벨링이 필요하다는 것인데, 이는 희귀 이벤트를 식별하기 위한 민감도를 감소시킬 수 있습니다. 실질 세포 회전율이 낮은 것으로 악명 높은 심장과 같은 장기의 경우, 이는 성장 반응을 과소평가하는 결과로 이어질 수 있습?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software