Klonale Analyse des neonatalen Mausherzens mit Hilfe der Nächste-Nachbarn-Modellierung

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von mehrfarbiger Abstammungsverfolgung und Nearest-Neighbor-Modellierung zur Identifizierung klonal abgeleiteter Kardiomyozyten während des Wachstums und der Regeneration bei Mäusen vorgestellt. Dieser Ansatz ist objektiv, funktioniert unter verschiedenen Beschriftungsbedingungen und kann angepasst werden, um eine Vielzahl von Bildanalyse-Pipelines zu integrieren.

Zusammenfassung

Durch den Ersatz von verlorenem oder dysfunktionalem Myokard ist die Geweberegeneration ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Herzinsuffizienz. Die Herausforderung, eine echte Herzregeneration zu erkennen, schränkt jedoch die Validierung potenzieller regenerativer Faktoren ein. Eine Methode zum Nachweis neuer Kardiomyozyten ist die mehrfarbige Abstammungsverfolgung mit klonaler Analyse. Klonale Analyseexperimente können schwierig durchzuführen sein, da die Markierungsbedingungen, die zu spärlich sind, nicht für seltene Ereignisse wie die Proliferation von Kardiomyozyten empfindlich sind und die diffuse Markierung die Fähigkeit einschränkt, Klone aufzulösen. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um eine klonale Analyse des neonatalen Mausherzens unter Verwendung statistischer Modellierung der Nächste-Nachbarn-Verteilungen durchzuführen, um Kardiomyozyten-Klone aufzulösen. Dieser Ansatz ermöglicht die Auflösung von Klonen über eine Reihe von Markierungsbedingungen und bietet einen robusten analytischen Ansatz zur Quantifizierung der Kardiomyozytenproliferation und -regeneration. Dieses Protokoll kann an andere Gewebe angepasst werden und kann auf breiter Basis zur Untersuchung der Geweberegeneration eingesetzt werden.

Einleitung

Ein histologisches Kennzeichen der Herzinsuffizienz ist der Verlust von Kardiomyozyten (CMs), entweder nach Verletzung, Seneszenz oder Apoptose¹. Die Wiederauffüllung des verlorenen oder dysfunktionalen Myokards durch Geweberegeneration stellt eine potenzielle therapeutische Strategie zur Heilung von Patienten mit Herzinsuffizienz dar. In den letzten Jahrzehnten haben bahnbrechende Fortschritte in der Entwicklungs- und Regenerationsbiologie eine begrenzte Fähigkeit des Säugetierherzens zutage gefördert, verlorene CMs wieder aufzufüllen 2,3,4,5. Diese spannende Arbeit hat die Möglichkeit aufgeworfen, dass angeborene Wachstumsmechanismen zur Regeneration eingesetzt werden können. Da angeborene regenerative Reaktionen im erwachsenen Säugetierherz funktionell nicht vorhanden sind, sind Methoden zur Verbesserung der Robustheit der endogenen Reparatur erforderlich, damit eine therapeutische Herzregeneration realisiert werden kann.

Die Mechanismen für die Regeneration des angeborenen Herzens scheinen über alle Spezies hinweg konserviert zu sein. Nach einer Verletzung vermehren sich bereits vorhandene CMs, um neue CMs in Zebrafischen ^6,7, Molchen ^8,9, Mäusen ^4,10, Ratten¹¹ und Schweinen^12,13 zu erzeugen. Dementsprechend versuchen viele Gruppen, Mitogene zu identifizieren, die in der Lage sind, die Kardiomyogenese zu fördern. Diese Arbeit ist jedoch eine Herausforderung. Nicht nur die Aufgabe, adulte Säugetier-CMs zur Proliferation zu bringen, ist entmutigend, sondern es ist auch schwierig, seltene proliferative Ereignisse zu identifizieren ^1,14. Die Herausforderung bei der Identifizierung seltener zyklischer CMs wird durch die Tendenz erwachsener Säugetier-CMs verschärft, sich bevorzugt einer Endomitose zu unterziehen. Zum Beispiel treten nach einer Verletzung des Mausherzens fast 25 % der CMs in der Grenzzone wieder in den Zellzyklus ein, aber nur 3,2 % der CMs teilen^{sich 4}. Da die meisten zyklischen CMs ihr Genom duplizieren, aber keine Zytokinese durchlaufen, ist die einfache Untersuchung auf eine Zunahme der Anzahl von zyklischen CMs für eine echte Kardiomyogenese mehrdeutig. Daher weisen Assays für den Nukleosideinbau durch CMs oder für das Vorhandensein von proliferativen Markern auf CMs möglicherweise nicht vollständig auf eine Regeneration hin. Da immer mehr Kandidatenfaktoren für die Herzregeneration auftauchen, werden Assays zur besseren Identifizierung der CM-Hyperplasie benötigt.

Die klonale Analyse durch Lineage Tracing ist ein wertvoller Ansatz für die Untersuchung der Kardiomyogenese, da sie die direkte Visualisierung von Zellen und ihren Nachkommen ermöglicht. Traditionelle Ansätze für die klonale Analyse beinhalten die seltene Markierung einzelner Zellen mit einem Reportergen. Die einfarbige Abstammungsverfolgung seltener Zellen kann jedoch bei seltenen Ereignissen wie der CM-Proliferation von begrenztem Wert sein, da die Wahrscheinlichkeit, eine proliferierende CM zu markieren, gering ist¹⁵. Alternativ kann die mehrfarbige Abstammungsverfolgung die Empfindlichkeit für die klonale Analyse^{erhöhen 16}. Kurz gesagt, einzelne Zellen werden nach dem Zufallsprinzip mit einem von mehreren fluoreszierenden Proteinen genetisch markiert, so dass proliferierende Zellen homogen gefärbte Zellcluster erzeugen, die von benachbarten fluoreszierenden Zellen aufgelöst werden können. Diese Methode wurde verwendet, um das Wachstum in einer Vielzahl von Organen zu verfolgen, und wurde in jüngerer Zeit auf Studien zur Herzregeneration von Säugetieren angewendet^17,18. Während die mehrfarbige Abstammungsverfolgung die klonale Expansion von CMs im embryonalen und neonatalen Stadium nachweisen kann, sind angeborene regenerative Reaktionen im Herzen von erwachsenen Mäusen nach einer Herzverletzung nicht leicht zu erkennen^17,19. Ein Ansatz, um die Empfindlichkeit der mehrfarbigen Abstammungsverfolgung zu verbessern, besteht darin, die Beschriftungsebene zu erhöhen und die Wahrscheinlichkeit für die Visualisierung seltener Ereignisse zu erhöhen. Eine breitere Markierung hat jedoch den Preis, dass es nicht möglich ist, ähnlich markierte Zellen als von einem gemeinsamen Vorfahren stammend von Zellen zu unterscheiden, die unabhängig voneinander mit demselben Fluorophor markiert wurden. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Nearest-Neighbor-Modellierung verwendet, um klonal verwandte CMs im neonatalen Mausherz zu identifizieren. Diese Methode ist unvoreingenommen, quantitativ und funktioniert unter einer Reihe von Kennzeichnungsbedingungen.

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Protokoll

Alle Verfahren für den Umgang mit Mäusen, die Durchführung von Überlebensoperationen und die Entnahme von Herzen bedürfen der Genehmigung durch ein lokales institutionelles Tierverwendungskomitee.

1. Mäuse für die klonale Analyse von CMs

1. Kreuzung von Myh6-MerCreMer-Mäusen²⁰ mit Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw-Mäusen 21} zur Erzeugung von Myh6-MerCreMer; R26R-Rainbow bitransgene Mäuse.
   1. Halten Sie Bestände an Mäusen aufrecht, die homozygot für das R26R-Rainbow-Allel sind, und kreuzen Sie sich mit Mäusen, die homozygot für das Myh6-MerCreMer-Allel sind, so dass alle Experimente an Mäusen durchgeführt werden, die heterozygot für das R26R-Rainbow-Allel sind. Alternativ können Sie Mäuse verwenden, die homozygot für das R26R-Rainbow-Allel sind, um die Farbvielfalt zu erhöhen, aber dies erfordert ein Bildgebungssystem, das EGFP-, mCerulean-, mOrange- und mCherry-Fluorophore originalgetreu unterscheiden kann.
2. Führen Sie die Genotypisierung zum Zeitpunkt der Herzentnahme durch.
   HINWEIS: Myh6-MerCreMer-Mäuse exprimieren eine Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase in CMs und können mit den PCR-Primern CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) und GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) genotypisiert werden, um ein 200-Basenpaar (bp)-Produkt zu erzeugen. R26R-Rainbow-Mäuse exprimieren konstitutiv EGFP, exprimieren aber nach Cre-vermittelter Rekombination stochastisch mCerulean, mOrange oder mCherry. R26R-Rainbow kann mit den PCR-Primern CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) und TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R) genotypisiert werden. Das Wildtyp-Allel ergibt ein Produkt von 350 bp und das Rainbow-Allel ein Produkt von 250 bp.

2. Kryoverletzung und Markierung von Kardiomyozyten

1. Kryoverletzungen wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchführen^22,23. Legen Sie einen Tag alte Mäuse (P1) vorsichtig für 3 Minuten auf ein Bett aus zerstoßenem Eis, um einen Herzstillstand auszulösen. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifung ohne reflexartigen Rückzug durchführen.
   HINWEIS: Der Zeitpunkt der Anästhesie ist entscheidend. Das Überleben kann beeinträchtigt werden, wenn Mäuse zu lange gekühlt werden. Darüber hinaus ist das Alter der Mäuse entscheidend. Die Regenerationsfähigkeit nimmt in der ersten Lebenswoche stark ab¹⁰.
2. Positionieren Sie den anästhesierten Welpen auf einer Kühlpackung und unter dem Objektiv eines chirurgischen Präpariermikroskops. Verwenden Sie eine 6-mm-Mikroschere, um eine Thorakotomie zwischen der 4. und 5. Rippe durchzuführen, um die vordere Oberfläche des Herzens freizulegen.
3. Platzieren Sie die Sonde mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Kryosonde für 1-2 s auf dem linken Ventrikel. Bei Scheinverletzungen führen Sie eine Thorakotomie ohne Kryoverletzung durch.
   HINWEIS: Die Dauer der Kryoverletzung bestimmt das Ausmaß der Verletzung. Längere Verletzungen verringern die Überlebensraten.
4. Verschließen Sie den Schnitt mit einem 6-0-Polypropylen-Nahtmaterial, das an einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,15 mm befestigt ist.
5. Erwärmen Sie den Welpen schnell und stimulieren Sie ihn manuell, um den Blutfluss wieder aufzunehmen. Sobald sich der Welpe spontan bewegt, legen Sie ihn auf ein Heizkissen.
6. Injizieren Sie genesenen Welpen intraperitoneal 20 μg Tamoxifen. Injizieren Sie zu diesem Zeitpunkt bei Bedarf Analgetika wie 0,25 % Bupivacain entlang der Nahtlinie. Bringen Sie die Welpen zum Muttertier zurück.
   HINWEIS: Welpen aus einem einzigen Wurf werden zusammen geborgen und gemeinsam zum Muttertier zurückgebracht. Dieser Arbeitsablauf verbessert das Überleben und die Rücknahme des Mülls durch den Damm.

3. Entnahme von Herzen und Aufbereitung für die histologische Analyse

1. Entnehmen Sie die Herzen 20 Tage nach der Verletzung (dpi) oder nach der Geburt (P21), da zu diesem Zeitpunkt regenerative Reaktionen beobachtet werden können¹⁰. Zuerst werden die Mäuse in einer CO₂ -Inhalationskammer eingeschläfert und dann in ein Operationsmikroskop überführt.
   HINWEIS: Die Euthanasie sollte in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren durchgeführt werden.
2. Sobald eine ausreichende Anästhesie bestätigt ist, führen Sie eine doppelte Thorakotomie mit einer chirurgischen Mikroschere durch, um das Herz freizulegen. Perfundierten Sie dann das Herz mit 1 ml 1 M KCl, 1 ml 4% Paraformaldehyd und 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   HINWEIS: Eine angemessene Wäsche ist erforderlich, um intraventrikuläre Blutgerinnsel zu begrenzen, die während der Bildaufnahme Autofluoreszenz verursachen können.
3. Nach der Perfusion das Herz präparieren und in ein Röhrchen geben, das mindestens 1 ml PBS enthält.
4. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Herzen zu trimmen, um die Einbettung zu optimieren. Eine horizontale Scheibe unterhalb des Atriums bietet eine gute Oberfläche zum Einbetten der Herzen für kurzachsige Schnitte.
   HINWEIS: Alternativ kann man das Herz auch quer schneiden, wenn lange Achsschnitte gewünscht sind.
5. Legen Sie die abgeschnittenen Herzen 12–18 h lang in 1 ml 30 % (Gew.-%) Saccharose bei 4 °C. Nehmen Sie die Proben aus der Saccharoselösung. Betten Sie getrimmtes Gewebe mit Gewebegefriermedien in Blöcke ein.
6. Frieren Sie das eingebettete Gewebe schnell auf Trockeneis ein und lagern Sie die Blöcke bei -80 °C.
7. Gefrorene Ganzherzblöcke werden mit einem Kryostaten in 10 μm-Abschnitte geschnitten, auf geladene Objektträger montiert und Objektträger bei -20 °C gelagert. Unterteilen Sie die Herzen nacheinander über 10 Folien. Dazu wird auf jeder der 10 Folien ein Abschnitt montiert, bevor Sie zur ersten Folie zurückkehren, um einen weiteren Abschnitt hinzuzufügen. Eine solche Strategie schränkt die Wahrscheinlichkeit ein, dieselben CMs in mehreren Abschnitten einer bestimmten Folie zu erfassen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Lichteinwirkung zu begrenzen, um einen Fluoreszenzverlust zu vermeiden.
8. Wenn sie für die Bildgebung bereit sind, tauen Sie die Objektträger auf und rehydrieren Sie sie in PBS. Fügen Sie ein lichtbeständiges Eindeckmedium hinzu, bevor Sie ein Glasdeckglas #1,5 anbringen. Lagern Sie Objektträger mit Deckel in einem abgedeckten Behälter bei 4 °C.
   HINWEIS: Für erwartete Ergebnisse bei Kryoverletzung wird der Leser auf frühere Arbeiten zu diesem Thema^{verwiesen 23}. Herzschnitte weisen einen hohen Grad an Autofluoreszenz auf. Die Verwendung von Abschreckungsmitteln wie Sudan Black vor dem Auftragen eines Deckglases kann helfen, die Autofluoreszenz zu mildern. Es ist jedoch Vorsicht geboten, um ein Abschrecken der interessierenden Fluorophore zu vermeiden.

4. Bildgebung

HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für die Verwendung eines kommerziellen Mikroskops (siehe Materialtabelle), das über ein aufrechtes Weitfeld-Fluoreszenzsystem mit Filterwürfeln verfügt, die zur Unterscheidung von mCerulean-, EGFP-, mOrange- und mCherry-Fluorophoren ausgestattet sind, sowie für die mit diesem Aufbau verknüpfte Software (siehe Materialtabelle). Die zusätzlichen Schritte variieren je nach verwendetem Bildgebungssystem.

1. Stellen Sie die gesamte Folie mit 5-facher Vergrößerung nur mit dem GFP-Filter dar, um eine Slidemap zu erstellen.
2. Wählen Sie einzelne Abschnitte auf der Diakarte aus, die intakt sind und eine begrenzte Autofluoreszenz für die Bildgebung aufweisen. Aufgrund der seriellen Schnitte in Sätzen von 10 Objektträgern sind benachbarte Schnitte mindestens 100 μm voneinander entfernt, wodurch die Abbildung derselben CMs verhindert wird.
3. Führen Sie eine Kachelscan-Bildgebung für die einzelnen Schnitte mit einem 20-fach-Objektiv mit den Filtern mCerulean, mOrange, mCherry und EGFP durch. Repräsentative Bilder sind in Abbildung 1 dargestellt.
4. Speichern Sie Bilder in einem Format, das das Abrufen der einzelnen Kanalinformationen ermöglicht. Achten Sie darauf, die Dateien in einem Format zu benennen, das es ermöglicht, das Herz, das Fluorophor und die Position des Abschnitts innerhalb des Herzens zu identifizieren. Für die folgenden Rechenschritte ist ein systematischer Benennungsansatz erforderlich.

5. Analyse von Bildern zur Identifizierung von beschrifteten CMs

1. Wählen Sie aus jedem Satz die abgebildeten Abschnitte aus, die intakt sind, und verteilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip an alle Screener. Stellen Sie sicher, dass die Screener die folgenden Schritte für jedes Bild befolgen.
2. Verwenden Sie für jeden Kanal (mCerulean, mOrange und mCherry) das Werkzeug "Farbbalance" in ImageJ²⁴ , um Helligkeit und Kontrast des Bildes anzupassen und dem Benutzer die Identifizierung der beschrifteten Zellen zu erleichtern.
   HINWEIS: ImageJ ist ein kostenloses Bildanalyse-Tool, das von https://imagej.net heruntergeladen werden kann. Dieses Protokoll verwendet die Version 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. Wählen Sie in ImageJ "Messungen festlegen" aus dem Dropdown-Menü "Analysieren". Wählen Sie im sich öffnenden Fenster "Bereich | Schwerpunkt | Umgebendes Rechteck | Begrenzung auf Schwellenwert".
   HINWEIS: Das Bildsubtraktionsmodul kann manchmal verwendet werden, um das Fluorophorsignal im Verhältnis zur Hintergrundautofluoreszenz zu verbessern. Wenn die Subtraktion jedoch durchgeführt wird, sollte sie systematisch für alle Bilder in einem Datensatz durchgeführt werden.
4. Wenn das gewünschte Bild geöffnet ist, wählen Sie "Tools" und dann "ROI-Manager" aus dem Dropdown-Menü "Analysieren". Es öffnet sich das Fenster "ROI-Manager".
5. Wählen Sie das Werkzeug "Freihandauswahl" aus der ImageJ-Symbolleiste aus, und zeichnen Sie die gewünschte Zelle nach (Abbildung 2A). Drücken Sie nach der Verfolgung "t" oder verwenden Sie die Schaltfläche "[t]" im Fenster "ROI-Manager" (Abbildung 2B). Wiederholen Sie den Vorgang für alle Zellen eines einzelnen Kanals.
   HINWEIS: Segmentierung und ROIs sollten für jeden Kanal separat durchgeführt werden.
6. Nachdem Sie alle Zellen für einen bestimmten Kanal ausgewählt haben, speichern Sie die ROIs als .zip Datei. Wählen Sie dazu zunächst im Fenster "ROI-Manager" die Option "Auswahl aufheben", um sicherzustellen, dass kein einzelner ROI hervorgehoben wird. Klicken Sie dann im Fenster "ROI-Manager" auf die Registerkarte "Mehr" und wählen Sie die Option "Speichern". Dadurch wird der Desktop-Navigator geöffnet, in dem die ROIs als .zip Datei gespeichert werden.
7. Exportieren Sie die Messungen für jeden ROI als .csv Datei. Stellen Sie dazu sicher, dass kein einzelner ROI hervorgehoben ist, indem Sie erneut "Abwählen" und dann im Fenster "ROI-Manager" auf "Messen" klicken. Daraufhin öffnet sich ein neues Fenster "Ergebnisse", in dem alle zuvor ausgewählten Messungen angezeigt werden.
8. Wählen Sie im Fenster "Ergebnisse" die Option "Datei" und dann "Speichern unter" aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 2C). Dadurch wird der Desktop-Navigator erneut geöffnet, so dass die Datei im .csv Format gespeichert werden kann.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die ROIs und Messungen speichern, bevor Sie mit der Segmentierung des nächsten Kanals fortfahren.
9. Achten Sie darauf, die Dateien in einem Format zu benennen, das es ermöglicht, das Herz, den Kanal und die Position des Abschnitts innerhalb des Herzens zu identifizieren. Beispiel: "HeartType#_Set#_Section#_Channel" (z. B. "CI-1_Set4_S3_mOrange.zip" für die ROIs und "CI-1_Set4_S3_mOrange.csv" für die entsprechenden Messungen).
   HINWEIS: Der folgende Code geht von der oben genannten Namenskonvention aus. Eine andere Namenskonvention erfordert eine Änderung des Codes.

6. Statistische Analyse

HINWEIS: Zellen, die denselben Fluorophor tragen, sind eine Mischung aus klonal abgeleiteten Zellen (Kin) und nicht verwandten Zellen, die einem zufälligen Rekombinationsereignis unterzogen wurden, um dasselbe Fluorophor zu exprimieren (Nicht-Kin). Basierend auf früheren Daten¹⁷ wird davon ausgegangen, dass Verwandtenzellen eine engere physikalische Nähe aufweisen als Nicht-Verwandtenzellen, die denselben Fluorophor exprimieren. So können verwandte und nicht-verwandte Zellen anhand einer Entfernungsschwelle unterschieden werden. Um den Schwellenwert zu bestimmen, müssen jedoch die Verteilungen der nächsten Nachbarn für verwandte und nicht-verwandte Zellen entfaltet werden. Glücklicherweise können die Verteilungen der nächsten Nachbarn für nicht-verwandte Zellen geschätzt werden, indem die Werte der nächsten Nachbarn von jeder Zelle zur nächstgelegenen Zelle, die einen anderen Fluorophor trägt, ausgewertet werden. Hier wird eine Methodik zur statistischen Bestimmung eines Schwellenwerts zur Definition der Klonalität und zur Zuweisung einer Verwandtschaftswahrscheinlichkeit zwischen Zellen vorgestellt.

1. Berechnen Sie anhand der .csv Dateien aus Abschnitt 5 die Entfernungen der nächsten Nachbarn für jede Zelle innerhalb einer Herzscheibe. Kompilieren Sie diese Ergebnisse in Abstände innerhalb des Kanals (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange und mCherry-mCherry) und zwischen den Kanälen (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry und mCherry-mCerulean). Speichern Sie die Ergebnisse in zwei .csv Dateien: eine für Entfernungen innerhalb des Kanals und eine für Entfernungen zwischen den Kanälen.
   1. Installieren Sie den Python^25-Code , für den die Bibliotheken numpy und pandas erforderlich sind.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Berechnen Sie Entfernungen und exportieren Sie .csv Dateien für Entfernungen innerhalb und zwischen Kanälen mit Python-snippet_6_1.py.
2. Lesen Sie die Abstände innerhalb und zwischen den Kanälen in einen R^{26-Datenrahmen} ein, indem Sie die Herzidentifikatoren in eine kategoriale Variable umwandeln. Wenden Sie einen ad-hoc ausgewählten Schwellenwert an, indem Sie sich die Histogramme der nächsten Nachbarn ansehen (Abbildung 3A, C), um Ausreißer zu minimieren. Achten Sie darauf, einen Schwellenwert zu wählen, der mehr als 90 % der Abstände zwischen und innerhalb des Kanals abdeckt, während der Long Tail ausgeschlossen wird, um eine Überanpassung an das Rauschen bei großen Entfernungen der nächsten Nachbarn zu vermeiden. Dieses Protokoll verwendet einen Schwellenwert von 400 μm (Abbildung 3). Verwenden Sie Rscript snippet_6_2.R , um diesen Schritt auszuführen.
   HINWEIS: Alternativ können mehrere Slices als einzelne Variablen modelliert werden. Dieses Protokoll begrenzt die Modellkomplexität auf die Herzebene, um die Modellierung und Schätzung zu vereinfachen.
3. Erhalten Sie die natürlichen Logarithmen für die Entfernungen innerhalb und zwischen den Kanälen. Da es sich bei Zellen um raumbeanspruchende, nicht punktuelle Entitäten handelt, ist die Verteilung des minimalen nächsten Nachbarn um einen Wert ungleich Null zentriert und weist asymmetrische Schwänze auf, da der maximale Abstand zwischen Zellpaaren wesentlich höher sein kann als die Medianwerte (Abbildung 3A, C). Verwenden Sie die logarithmisch-normale Verteilung, um solche Verteilungen zu modellieren (Abbildung 3B,D). Verwenden Sie dazu Rscript snippet_6_3.R.
4. Verwenden Sie das folgende Bayes'sche Modell, um die Mittelwerte und Varianzen der Nächste-Nachbarn-Verteilungen (α₂, σ²₂) und Nicht-Verwandten (α₁, σ²₁) sowie die Wahrscheinlichkeit von Abständen innerhalb des Kanals, die sich aus der Verwandtschaftsverteilung (π=e^β/(1+e^β)) ergeben, zu schätzen:
   bw.vert_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~ T₁ (0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   wobei Unif(a,b) die Gleichverteilung auf dem Intervall [a,b] ist, N(μ,σ²|l2 ist, die auf das Intervall (l,u) beschränkt ist, T₁(0,1|x>0) die Standard-Cauchy-Verteilung (T mit 1 Freiheitsgrad) ist, die auf die positive Halblinie beschränkt ist, bw.dist_i ist^{die i te} protokollierte Paarentfernung zwischen den Kanälen und wi.dist_i ist die i^{protokollierte} Paarentfernung innerhalb des Kanals. Beachten Sie, dass die protokollierten Abstände innerhalb des Kanals eine Zweikomponenten-Mischungsverteilung aufweisen, die die Beimischung von verwandten und nicht-verwandten Zellpaaren widerspiegelt.
   1. Stellen Sie dem Modell nach Möglichkeit informative Prioren zur Verfügung. Zum Beispiel erwartet dieses Protokoll, dass die Verwandtschaftszellen näher beieinander liegen als Nicht-Verwandtenzellen, daher wird dies als Prior für den Mittelwert der Verteilung der Entfernungen bereitgestellt. Verwenden Sie dann die R-Pakete runjags²⁷ und coda²⁸ sowie das Programm JAGS²⁹ zur Parameterschätzung (Rscript snippet_6_4.R).
5. Führen Sie das JAGS-Modell mit der Anzahl der Ketten aus, die der Anzahl der verfügbaren CPUs entspricht. Verwenden Sie Rscript snippet_6_5.R , um diesen Schritt auszuführen. Lassen Sie die Software bis zur Konvergenz laufen.
6. Verwenden Sie Metriken, um die Konvergenz des Algorithmus zu testen, z. B. die effektive Stichprobengröße (verfügbar mit runjags), die Gelman-Rubin-Konvergenzdiagnose (verfügbar mit runjags) und ihre Autokorrelation (autocorr/autocorr.diag verfügbar in coda). Überprüfen Sie die Güte der Anpassung des geschätzten Modells für die Entfernungen der nächsten Nachbarn, indem Sie ein Q-Q-Diagramm untersuchen, das einen Vergleich der tatsächlichen und geschätzten Werte für die Entfernungen der nächsten Nachbarn auf Quantilebene mit Rscript snippet_6_6.R darstellt (Abbildung 4C,F). Dieses Skript erfordert, dass der Benutzer die Werte in den Zeilen 25 bis 29 von snippet_6_6.R basierend auf der Ausgabe von Befehl 6 bearbeitet.
   HINWEIS: Im Idealfall sollte für jeden der Parameter³⁰ eine effektive Stichprobengröße (SSeff) von mehr als 10.000 erhalten werden. Ein SSeff größer als 2.500 kann jedoch für einige komplexe Modelle geeignet sein. Die Gelman Rubin-Diagnose beträgt 1,00 für perfekte Konvergenz und muss kleiner als 1,05 für eine zufriedenstellende Konvergenz sein. Eine hohe Autokorrelation deutet auf eine langsame Durchmischung innerhalb der Ketten hin und ist ein Indikator für langsame Konvergenz. Das Autokorrelationsdiagramm muss im Falle eines guten Modells einem exponentiellen Zerfall folgen. Das Q-Q-Diagramm der tatsächlichen und modellierten Verteilungen der nächsten Nachbarn (Abbildung 4C,F) sollte so genau wie möglich der Diagonalen folgen.
7. Nachdem Sie die Genauigkeit der Modelle überprüft haben, ermitteln Sie die Wahrscheinlichkeit, dass ein Zellpaar verwandt ist, als Funktion seiner Entfernung. Um einen Schwellenwert für die Bestimmung zu bestimmen, ob Zellen innerhalb des Kanals wahrscheinlich verwandt sind, identifizieren Sie den Abstand, bei dem die Wahrscheinlichkeit, verwandt zu sein, unter 0,5 fällt. Dies kann mit Rscript snippet_6_7.R erfolgen.
   HINWEIS: Alternative Schwellenwerte können basierend auf experimentellen Zielen ausgewählt werden. Für einige Anwendungen sind Schwellenwerte möglicherweise nicht relevant, und die Wahrscheinlichkeit, ein Verwandtschaftspaar zu sein, kann direkt zur Gewichtung von Zellpaaren verwendet werden.

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Ergebnisse

Die Befolgung des Protokolls für die Kryoverletzung bei Neugeborenen sollte zu P21-Herzen mit und ohne Verletzung führen. Kryoverletzte Herzen haben eine gut umschriebene Verletzung, während die Oberfläche von Scheinherzen glatt und homogen ist. Bei kryogeschädigten Herzen sollte der Bereich der Verletzung von Herz zu Herz gleich sein. Nach der Mikroskopie sollten Bilder ähnlich wie in Abbildung 1 aufgenommen werden. Beachten Sie, dass die Bildauflösu...

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Diskussion

Die mehrfarbige Abstammungsverfolgung ist ein leistungsstarker Ansatz, um Muster des Organwachstums mit Einzelzellauflösung zu identifizieren. Eine wesentliche Einschränkung bei der mehrfarbigen Abstammungsverfolgung ist jedoch die Notwendigkeit einer spärlichen Markierung von Zellen, die die Empfindlichkeit bei der Identifizierung seltener Ereignisse verringern kann. Bei Organen wie dem Herzen mit notorisch niedrigem Parenchymzellumsatz kann dies zu einer Unterschätzung der Wachstum...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software