JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לשימוש במעקב אחר שושלת רב-צבעונית ומודלים של השכן הקרוב ביותר לזיהוי קרדיומיוציטים שמקורם בשיבוט במהלך גדילה והתחדשות בעכברים. גישה זו היא אובייקטיבית, פועלת בתנאי תיוג שונים, וניתן להתאים אותה לשילוב מגוון צינורות ניתוח תמונות.

Abstract

על ידי החלפת שריר הלב שאבד או לא מתפקד, התחדשות רקמות היא גישה מבטיחה לטיפול באי ספיקת לב. עם זאת, האתגר של זיהוי התחדשות לב בתום לב מגביל את התיקוף של גורמי התחדשות פוטנציאליים. שיטה אחת לאיתור קרדיומיוציטים חדשים היא מעקב אחר שושלת רב-צבעונית עם ניתוח משובט. ניסויי ניתוח שיבוטים יכולים להיות קשים לביצוע, מכיוון שתנאי תיוג דלילים מדי חסרי רגישות לאירועים נדירים כגון התפשטות קרדיומיוציטים, ותיוג מפוזר מגביל את היכולת לפתור שיבוטים. מוצג כאן פרוטוקול לביצוע ניתוח משובט של לב העכבר היילוד על ידי שימוש במודלים סטטיסטיים של התפלגויות השכנים הקרובים ביותר כדי לפתור שיבוטים של קרדיומיוציטים. גישה זו מאפשרת פתרון של שיבוטים במגוון תנאי תיוג ומספקת גישה אנליטית חזקה לכימות התפשטות והתחדשות קרדיומיוציטים. ניתן להתאים פרוטוקול זה לרקמות אחרות וניתן להשתמש בו באופן נרחב לחקר התחדשות רקמות.

Introduction

סימן היכר היסטולוגי של אי ספיקת לב הוא אובדן קרדיומיוציטים (CMs), לאחר פציעה, הזדקנות או אפופטוזיס1. חידוש שריר הלב שאבד או לא מתפקד באמצעות התחדשות רקמות מייצג אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית לריפוי חולים עם אי ספיקת לב. במהלך העשורים האחרונים, התקדמות משמעותית בביולוגיה התפתחותית והתחדשות חשפה יכולת מוגבלת של לב היונקים לחדש CMs שאבדו 2,3,4,5. עבודה מרגשת זו העלתה את האפשרות שניתן לפרוס מנגנוני גדילה מולדים להתחדשות. מכיוון שתגובות רגנרטיביות מולדות נעדרות מבחינה תפקודית בלב יונקים בוגרים, יש צורך בשיטות לשיפור החוסן של תיקון אנדוגני כדי לממש את התחדשות הלב הטיפולית.

נראה כי המנגנונים להתחדשות לב מולדת נשמרים בין מינים. בעקבות פציעה, CMs קיימים מתרבים ומייצרים CMs חדשים בדגי זברה 6,7, ניוטים 8,9, עכברים 4,10, חולדות11 וחזירים12,13. בהתאם לכך, קבוצות רבות מבקשות לזהות מיטוגנים המסוגלים לקדם קרדיומיוגנזה. עם זאת, עבודה כזו מאתגרת. לא רק שהמשימה לגרום ל-CMs של יונקים בוגרים להתרבות מרתיעה, אלא שהיכולת לזהות אירועי התפשטות נדירים היא קשה 1,14. האתגר של זיהוי CMs מחזוריים נדירים מורכב על ידי הנטייה של CMs יונקים בוגרים לעבור אנדומיטוזיס באופן מועדף. לדוגמה, לאחר פגיעה בלב העכבר, כמעט 25% מה-CMs באזור הגבול נכנסים מחדש למחזור התא, אך רק 3.2% מה-CMs מתחלקים4. מכיוון שרוב ה-CMs המחזוריים משכפלים את הגנום שלהם אך לא מצליחים לעבור ציטוקינזיס, פשוט בדיקה של עלייה במספר ה-CMs המחזוריים אינה חד משמעית לקרדיומיוגנזה בתום לב. לפיכך, מבחנים לשילוב נוקלאוזידים על ידי CMs או לנוכחות סמני התפשטות על CMs עשויים שלא להצביע לחלוטין על התחדשות. ככל שמופיעים גורמים מועמדים נוספים להתחדשות הלב, יש צורך בבדיקות לזיהוי טוב יותר של היפרפלזיה של CM.

ניתוח שיבוט על ידי מעקב אחר שושלת הוא גישה רבת ערך לבדיקת קרדיומיוגנזה מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של תאים וצאצאיהם. גישות מסורתיות לניתוח שיבוט כוללות תיוג נדיר של תאים בודדים עם גן מדווח. עם זאת, מעקב אחר שושלת בצבע יחיד של תאים נדירים עשוי להיות בעל ערך מוגבל עבור אירועים נדירים כגון התפשטות CM מכיוון שהסיכוי לתיוג CM מתפשט הואנמוך 15. לחלופין, מעקב אחר שושלת רב-צבעונית יכול להגביר את הרגישות לניתוח משובט16. בקצרה, תאים בודדים מסומנים גנטית באחד מכמה חלבונים פלואורסצנטיים באופן אקראי, כך שתאים מתרבים ייצרו אשכולות תאים בצבע הומוגני שניתן לפתור מתאים פלואורסצנטיים שכנים. שיטה זו שימשה למעקב אחר צמיחה במגוון איברים, ולאחרונה יושמה במחקרים על התחדשות לב של יונקים 17,18. בעוד שמעקב אחר שושלת צבעונית יכול לזהות התרחבות משובטת של CMs בשלבים עובריים ויילודים, תגובות רגנרטיביות מולדות אינן מזוהות בקלות בלב העכבר הבוגר לאחר פגיעה לבבית17,19. גישה אחת להגביר את הרגישות של מעקב אחר שושלות רב-צבעוניות תהיה להגדיל את רמת התיוג ולהגדיל את ההסתברות להמחשת אירועים נדירים. עם זאת, תיוג רחב יותר בא במחיר של חוסר היכולת להבחין בין תאים בעלי תווית דומה כעולים מאב קדמון משותף לעומת תאים שתויגו באופן עצמאי עם אותו פלואורופור. מוצג כאן פרוטוקול המשתמש במודלים של השכן הקרוב ביותר כדי לזהות CMs הקשורים לשיבוט בלב העכבר היילוד. שיטה זו היא בלתי מוטה, כמותית ועובדת על מגוון תנאי תיוג.

Protocol

כל ההליכים לטיפול בעכברים, ביצוע ניתוחי הישרדות וקצירת לבבות דורשים אישור של ועדה מוסדית מקומית לשימוש בבעלי חיים.

1. עכברים לניתוח שיבוט של CMs

  1. עכברי Cross Myh6-MerCreMer 20 עם Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)עכברי Ilw 21 ליצירת Myh6-MerCreMer; עכברים דו-טרנסגניים R26R-Rainbow.
    1. שמור על מלאי של עכברים הומוזיגוטיים עבור האלל R26R-Rainbow והכלאה עם עכברים הטרוזיגוטיים עבור האלל Myh6-MerCreMer, כך שכל הניסויים מבוצעים בעכברים הטרוזיגוטיים עבור האלל R26R-Rainbow. לחלופין, השתמש בעכברים הומוזיגוטיים עבור האלל R26R-Rainbow כדי להגדיל את מגוון הצבעים, אך זה ידרוש מערכת הדמיה שיכולה להבחין נאמנה בפלואורופורים EGFP, mCerulean, mOrange ו-mCherry .
  2. בצע גנוטיפ בזמן איסוף הלב.
    הערה: עכברי Myh6-MerCreMer מבטאים רקומבינאז Cre המושרה על ידי טמוקסיפן ב-CMs וניתן לבצע גנוטיפ באמצעות פריימרים PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) ו-GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) כדי ליצור מוצר של 200 זוגות בסיסים (bp). עכברי R26R-Rainbow מבטאים באופן מכונן EGFP אך יבטאו באופן סטוכסטי mCerulean, mOrange או mCherry לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. ניתן לבצע גנוטיפ של R26R-Rainbow עם פריימרים PCR CTCTGCTGCCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAAGATA (R26-R) ו-TCAATGGGCGGGGGTCGTCT (Rainbow-R). האלל מסוג הבר נותן מוצר של 350 bp ואלל Rainbow נותן מוצר של 250 bp.

2. פגיעה בקפיאה ותיוג של קרדיומיוציטים

  1. בצע פציעות קריולוגיות כמתואר קודם לכן עם שינויים קלים22,23. הניחו בזהירות עכברים בני יום אחד (P1) על מצע של קרח כתוש למשך 3 דקות כדי לגרום לדום לב. אשר הרדמה נאותה על ידי ביצוע צביטה בבוהן ללא נסיגה רפלקסיבית.
    הערה: תזמון ההרדמה הוא קריטי. ההישרדות עלולה להיפגע אם עכברים מקוררים זמן רב מדי. בנוסף, גיל העכברים הוא קריטי. יכולת ההתחדשות דועכת בחדות במהלך השבוע הראשון לחיים10.
  2. מקם את הגור המורדם על חבילה קרה ותחת המטרה של מיקרוסקופ ניתוח כירורגי. השתמש במספריים 6 מ"מ כדי לבצע כריתת בית חזה בין הצלע הרביעית לחמישית כדי לחשוף את המשטח הקדמי של הלב.
  3. בעזרת קריופרוב מקורר בחנקן נוזלי, הנח את הגשושית על החדר השמאלי למשך 1-2 שניות. עבור פציעות דמה, בצע כריתת בית חזה ללא פגיעה בהקפאה.
    הערה: משך הפגיעה בהקפאה מכתיב את מידת הפציעה. פציעות ממושכות יפחיתו את שיעורי ההישרדות.
  4. סגור את החתך עם תפר פוליפרופילן 6-0 המחובר למחט בקוטר 0.15 מ"מ.
  5. חממו את הגור במהירות ועוררו ידנית כדי לחדש את זרימת הדם. ברגע שהגור זז באופן ספונטני, הניחו על כרית חימום.
  6. יש להזריק לגורים שהחלימו 20 מיקרוגרם של טמוקסיפן תוך צפק. בשלב זה, יש להזריק משככי כאבים, כגון 0.25% בופיבקאין לאורך קו התפר, במידת הצורך. החזירו גורים לסכר.
    הערה: גורים מהמלטה בודדת נאספים יחד ומוחזרים לסכר יחד. זרימת עבודה זו משפרת את ההישרדות והקבלה מחדש של המלטה על ידי הסכר.

3. קצירת לבבות ועיבוד לניתוח היסטולוגי

  1. קצרו לבבות 20 יום לאחר הפציעה (dpi), או יום לאחר הלידה (P21), מכיוון שניתן לצפות בתגובות התחדשות עד נקודת זמן זו10. תחילה המתת חסד של עכברים בתא אינהלציה של CO2 ולאחר מכן העברה למיקרוסקופ כירורגי.
    הערה: המתת חסד צריכה להתבצע בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים.
  2. לאחר אישור הרדמה מספקת, בצע כריתת בית חזה כפולה באמצעות מספריים כירורגיות כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן, יש לחלחל את הלב עם 1 מ"ל של 1 M KCl, 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ו-1 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט (PBS).
    הערה: יש צורך בשטיפה נאותה כדי להגביל קרישי דם תוך חדריים שעלולים לגרום לאוטופלואורסצנטיות במהלך רכישת תמונה.
  3. לאחר הזלוף, יש לנתח את הלב ולהניח בצינור המכיל לפחות 1 מ"ל PBS.
  4. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לקצץ את הלבבות על מנת לייעל את ההטמעה. פרוסה אופקית מתחת לאטריום מספקת משטח טוב להטמעת הלבבות לקטעים קצרי ציר.
    הערה: לחלופין, ניתן לחתוך את הלב לרוחב אם רוצים קטעי ציר ארוכים.
  5. מניחים לבבות גזומים ב-1 מ"ל של סוכרוז של 30% (משקל/נפח) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-18 שעות. מוציאים את הדגימות מתמיסת הסוכרוז. הטמיעו רקמות גזומות בבלוקים באמצעות אמצעי הקפאת רקמות.
  6. הקפיאו את הרקמה המוטמעת במהירות על קרח יבש ואחסנו בלוקים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  7. חתכו בלוקים קפואים של לב שלם למקטעים של 10 מיקרומטר עם קריוסטט, הרכיבו על שקופיות טעונות ואחסנו שקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. חתכו לבבות באופן סדרתי על פני 10 שקופיות. זה נעשה על ידי הרכבת קטע על כל אחת מ-10 השקופיות לפני החזרה לשקופית הראשונה כדי להוסיף קטע נוסף. אסטרטגיה כזו מגבילה את הסיכוי ללכוד את אותם CMs במספר קטעים בשקופית נתונה.
    הערה: הקפד להגביל את החשיפה לאור על מנת למנוע אובדן פלואורסצנטי.
  8. כשהוא מוכן להדמיה, יש להפשיר את השקופיות ולהחזיר לחות ב-PBS. הוסף אמצעי הרכבה נגד דהייה לפני החלת כיסוי זכוכית #1.5. אחסן שקופיות שהחליקו על המכסה בכלי מכוסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לתוצאות צפויות עבור קריופציעה, הקורא מופנה לעבודה קודמת בנושאזה 23. במחלקות הלב יש רמות גבוהות של אוטופלואורסצנטיות. שימוש בחומרי מרווה, כגון סודאן בלאק, לפני מריחת כיסוי יכול לסייע בהפחתת אוטו-פלואורסצנטיות. עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מכיבוי פלואורופורים מעניינים.

4. הדמיה

הערה: השלבים שלהלן חלים על השימוש במיקרוסקופ מסחרי (ראה טבלת חומרים) בעל מערכת פלואורסצנטית בשדה רחב זקוף עם קוביות סינון המצוידות להבחין בין פלואורופורים mCerulean, EGFP, mOrange ו-mCherry ותוכנה הקשורה להגדרה זו (ראה טבלת חומרים). שלבים נוספים ישתנו בהתאם למערכת ההדמיה המדויקת שבה נעשה שימוש.

  1. דמיין את השקופית כולה בהגדלה פי 5 עם מסנן GFP בלבד כדי ליצור מפת שקופיות.
  2. בחר מקטעים בודדים במפת השקופיות שלמים ובעלי אוטופלואורסצנטיות מוגבלת להדמיה. בשל החלוקה הסדרתית בקבוצות של 10 שקופיות, קטעים סמוכים יהיו במרחק של לפחות 100 מיקרומטר זה מזה, מה שימנע הדמיה של אותם CMs.
  3. בצע הדמיית סריקת אריחים עבור המקטעים הבודדים באמצעות מטרה של פי 20 עם המסננים mCerulean, mOrange, mCherry ו-EGFP. תמונות מייצגות מוצגות באיור 1.
  4. שמרו תמונות בתבנית המאפשרת לאחזר את פרטי הערוץ הבודדים. הקפד לתת שמות לקבצים בפורמט שיאפשר לזהות את הלב, הפלואורופור ומיקום החלק בתוך הלב. נדרשת גישת שמות שיטתית עבור השלבים החישוביים שלהלן.

5. ניתוח תמונות לזיהוי CMs מסומנים

  1. בחר את הקטעים המצוירים שנותרו שלמים מכל סט וחלק באופן אקראי לכל המסננים. ודא שהמסננים מקפידים על השלבים הבאים עבור כל תמונה.
  2. עבור כל ערוץ (mCerulean, mOrange ו-mCherry), השתמש בכלי 'איזון צבע' ב-ImageJ24 כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה כדי לעזור למשתמש לזהות תאים מסומנים.
    הערה: ImageJ הוא כלי חינמי לניתוח תמונות שניתן להוריד מ-https://imagej.net. פרוטוקול זה השתמש בגרסה 2.0.0-rc-69/1.52i.
  3. ב-ImageJ, בחר 'הגדר מדידות' מהתפריט הנפתח 'ניתוח' . בחלון שנפתח, בחר 'אזור | מרכז המסה | מלבן תוחם | הגבל לסף'.
    הערה: לפעמים ניתן להשתמש במודול חיסור התמונה כדי לשפר את אות הפלואורופור ביחס לאוטו-פלואורסצנציה ברקע. עם זאת, אם מבוצע, החיסור צריך להיעשות באופן שיטתי עבור כל התמונות במערך נתונים.
  4. כאשר התמונה המעניינת פתוחה, בחר 'כלים' ולאחר מכן בחר 'מנהל החזר ROI' מהתפריט הנפתח 'ניתוח'. זה ייפתח, חלון 'מנהל החזר ROI'.
  5. בחר בכלי 'בחירות ביד חופשית' מסרגל הכלים ImageJ ועקוב אחר התא המעניין (איור 2A). לאחר המעקב, לחץ על 't' או השתמש בלחצן 'הוסף [t]' בחלון 'מנהל החזר ההשקעה' (איור 2B). חזור על הפעולה עבור כל התאים בערוץ יחיד.
    הערה: יש לבצע פילוח והחזר ROI עבור כל ערוץ בנפרד.
  6. לאחר שנבחרו כל התאים עבור ערוץ נתון, שמור את ההחזר על ההשקעה כקובץ .zip. עשה זאת על ידי בחירה תחילה באפשרות 'בטל בחירה' בחלון 'מנהל החזר ההשקעה' כדי לוודא שלא מודגש החזר ROI יחיד. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה 'עוד' בחלון 'מנהל החזר ההשקעה' ובחר באפשרות 'שמור'. פעולה זו תפתח את הנווט השולחני, שבו החזר ה-ROI נשמר כקובץ .zip.
  7. ייצא את המדידות עבור כל אחד מהחזרי ה-ROI כקובץ .csv. לשם כך, ודא שלא מודגש החזר ROI יחיד, שוב על ידי בחירה באפשרות 'בטל בחירה', ולאחר מכן בחר 'מדוד' בחלון 'מנהל החזר ההשקעה'. פעולה זו תפתח חלון 'תוצאות' חדש עם כל המדידות שנבחרו קודם לכן.
  8. בחלון 'תוצאות' בחר 'קובץ', ולאחר מכן בחר 'שמור בשם' מהתפריט הנפתח (איור 2C). פעולה זו תפתח שוב את נווט שולחן העבודה, כך שניתן יהיה לשמור את הקובץ בפורמט .csv.
    הערה: הקפד לשמור את ההחזר על ההשקעה והמדידות לפני שתעבור לפילוח הערוץ הבא.
  9. הקפד לתת שמות לקבצים בפורמט שיאפשר לזהות את הלב, הערוץ והמיקום של הקטע בתוך הלב. לדוגמה, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (למשל, 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' עבור ההחזר על ההשקעה ו-'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' עבור המדידות המתאימות).
    הערה: הקוד שלהלן מניח את מוסכמת מתן השמות לעיל. מוסכמה אחרת למתן שמות תדרוש שינוי בקוד.

6. ניתוח סטטיסטי

הערה: תאים הנושאים את אותו פלואורופור הם תערובת של תאים שמקורם בשיבוט (קרוב) ותאים לא קשורים שעברו אירוע רקומבינציה אקראי כדי לבטא את אותו פלואורופור (לא קרוב). בהתבסס על נתונים קודמים17, ההנחה היא שלתאי קרובי משפחה יש קרבה פיזית קרובה יותר מאשר לתאים שאינם קרובי משפחה המבטאים את אותו פלואורופור. לפיכך, ניתן להבדיל בין תאים קרובים ולא קרובים על סמך סף מרחק. עם זאת, על מנת לקבוע את הסף, יש לנטרל את התפלגות השכן הקרוב ביותר עבור תאים קרובים ולא קרובי משפחה. למרבה המזל, ניתן להעריך את התפלגות השכן הקרוב ביותר עבור תאים שאינם קרובי משפחה על ידי הערכת ערכי השכן הקרוב ביותר מכל תא לתא הקרוב ביותר הנושא פלואורופור שונה. כאן, מוצגת מתודולוגיה לקביעה סטטיסטית של מרחק סף להגדרת שיבוטיות ולהקצאת הסתברות לקרבה בין תאים.

  1. באמצעות קבצי .csv שהתקבלו מסעיף 5, חשב את מרחקי השכנים הקרובים ביותר עבור כל תא בתוך פרוסת לב. אספו את התוצאות הללו למרחקים בתוך הערוץ (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange ו-mCherry-mCherry) ובין הערוצים (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry ו-mCherry-mCerulean). שמרו את התוצאות בשני קובצי .csv: אחד למרחקים בתוך הערוץ ואחד למרחקים בין ערוצים.
    1. התקן את קוד Python25 הדורש את ספריות numpy ו-pandas.
      > pip להתקין numpy; pip להתקין פנדות
    2. חשב מרחקים וייצא קובצי .csv עבור מרחקים בתוך הערוץ ומרחקים בין ערוצים באמצעות snippet_6_1.py python.
  2. קרא את המרחקים בתוך הערוץ ובין הערוצים למסגרת נתונים R26 , והמיר את מזהי הלב למשתנה קטגורי. החל סף שנבחר אד-הוק על ידי התבוננות בהיסטוגרמות של השכן הקרוב ביותר (איור 3A,C) כדי למזער חריגים. הקפד לבחור סף המכסה למעלה מ-90% מהמרחקים בין הערוצים ובתוך הערוץ, תוך אי הכללת הזנב הארוך כדי למנוע התאמה יתר לרעש במרחקי השכן הקרובים ביותר. פרוטוקול זה משתמש בסף של 400 μm (איור 3). השתמש ב- Rscript snippet_6_2.R כדי לבצע שלב זה.
    הערה: לחלופין, ניתן לעצב פרוסות מרובות כמשתנים בודדים. פרוטוקול זה מגביל את מורכבות המודל לרמת הלב כדי להקל על המידול וההערכה.
  3. השג את הלוגריתמים הטבעיים עבור המרחקים בתוך הערוץ ובין הערוצים. מכיוון שתאים הם ישויות שאינן נקודתיות שתופסות מקום, ההתפלגות המינימלית של מרחק השכן הקרוב ביותר מרוכזת סביב ערך שאינו אפס ויש לה זנבות אסימטריים מכיוון שהמרחק המקסימלי בין זוגות תאים יכול להיות גבוה משמעותית מהערכים החציוניים (איור 3A,C). השתמש בהתפלגות הלוג-נורמלית כדי למדל התפלגויות כאלה (איור 3B,D). עשה זאת באמצעות Rscript snippet_6_3.R.
  4. השתמש במודל הבייסיאני הבא כדי להעריך את הממוצעים והשונות של התפלגות השכן הקרוב ביותר (α2, σ2 2) ולא-קרוב (α1, σ21), ואת ההסתברות למרחקים בתוך הערוץ הנובעים מהתפלגות הקרובים (π=eβ/(1+eβ)):
    bw.disti ~ N(α1, σ21| l.limiwi.disti ~ N(α1, σ2, 1| l.limi2, σ2, 2| l.limiσ1 ~ T1(0,1|σ1>0)
    σ2 ~ T1(0,1|σ2>0)
    α1 ~ Unif(2,6)
    α2 ~ Unif(1,5)
    β ~ Unif(-5,0)
    כאשר Unif(a,b) היא ההתפלגות האחידה במרווח [a,b], N(μ,σ2|l2 מוגבלת למרווח (l,u), T1(0,1|x>0) היא התפלגות קושי הסטנדרטית (T עם דרגת חופש אחת) המוגבלת לחצי קו החיובי, bw.disti הוא מרחק הזוגותהנרשם בין הערוצים ו-wi.disti הוא מרחק הזוגותהנרשם בתוך הערוץ. שימו לב שלמרחקים שנרשמו בתוך הערוץ יש התפלגות תערובת דו-רכיבית המשקפת את התערובת של זוגות תאים קרובים ולא קרובים.
    1. ספק למודל מקדימים אינפורמטיביים במידת האפשר. לדוגמה, פרוטוקול זה מצפה שתאי המשפחה יהיו קרובים יותר זה לזה מאשר תאים שאינם קרובי משפחה, כך שזה מסופק כקדם לממוצע התפלגות המרחקים. לאחר מכן, השתמש בחבילות runjags27 ו-coda28 R ובתוכנית JAGS29 להערכת פרמטרים (Rscript snippet_6_4.R).
  5. הפעל את מודל JAGS עם מספר השרשראות המתאימות למספר המעבדים הזמינים. השתמש ב- Rscript snippet_6_5.R כדי לבצע שלב זה. אפשר לתוכנה לפעול עד להתכנסות.
  6. השתמש במדדים כדי לבדוק את ההתכנסות של האלגוריתם, כגון גודל מדגם אפקטיבי (זמין עם runjags), אבחון ההתכנסות של גלמן-רובין (זמין עם runjags) והמתאם האוטומטי שלו (autocorr/autocorr.diag זמין בקודה). ודא את מידת ההתאמה של המודל המשוער למרחקי השכן הקרוב ביותר על ידי בדיקת תרשים Q-Q, המתווה השוואה ברמת הקוונטיל של ערכים בפועל וערכים משוערים עבור מרחקי השכן הקרוב ביותר באמצעות Rscript snippet_6_6.R (איור 4C,F). קובץ Script זה דורש מהמשתמש לערוך את הערכים בשורות 25-29 של snippet_6_6.R בהתבסס על הפלט מפקודה 6.
    הערה: באופן אידיאלי, יש להשיג גודל מדגם אפקטיבי (SSeff) של יותר מ-10,000 עבור כל אחד מהפרמטרים30. עם זאת, SSeff גדול מ-2,500 עשוי להתאים לדגמים מורכבים מסוימים. האבחנה של גלמן רובין היא 1.00 להתכנסות מושלמת וחייבת להיות פחות מ-1.05 להתכנסות משביעת רצון. מתאם אוטומטי גבוה מצביע על ערבוב איטי בתוך שרשראות ומהווה אינדיקטור להתכנסות איטית. עלילת המתאם האוטומטי חייבת לעקוב אחר דעיכה מעריכית במקרה של מודל טוב. תרשים Q-Q של התפלגויות השכן הקרוב ביותר בפועל ומעוצב (איור 4C,F) צריך לעקוב אחר האלכסון קרוב ככל האפשר.
  7. לאחר אימות הדיוק של המודלים, קבל את ההסתברות שזוג תאים הם קרובים כפונקציה של המרחק שלהם. כדי לקבוע מרחק סף לקביעה אם תאים בתוך הערוץ עשויים להיות קרובי משפחה, זהה את המרחק שבו ההסתברות להיות קרוב משפחה יורדת מתחת ל-0.5. ניתן לעשות זאת באמצעות Rscript snippet_6_7.R.
    הערה: ניתן לבחור ערכי סף חלופיים על סמך יעדי הניסוי. עבור יישומים מסוימים, ספים עשויים שלא להיות רלוונטיים וההסתברות להיות זוג קרובים עשויה לשמש ישירות לשקילת זוגות תאים.

תוצאות

ביצוע הפרוטוקול לפגיעה בהקפאה בילודים אמור להניב לבבות P21 עם ובלי פציעה. ללבבות פצועים בהקפאה יש פגיעה מוגבלת היטב בעוד שפני השטח של לבבות דמה חלקים והומוגניים. בלבבות פצועים, אזור הפגיעה צריך להיות עקבי מלב ללב. לאחר מיקרוסקופיה, יש לקבל תמונות דומות לאיור 1

Discussion

מעקב אחר שושלת צבעונית הוא גישה רבת עוצמה לזיהוי דפוסי צמיחת איברים ברזולוציה של תא בודד. עם זאת, מגבלה עיקרית למעקב אחר שושלת רב-צבעונית היא הצורך בתיוג דליל של תאים, מה שיכול להפחית את הרגישות לזיהוי אירועים נדירים. עבור איברים כמו הלב עם רמות נמוכות לשמצה של תחלופת תאי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי R03 HL144812 (RK), פרס מדען רופא התחלה חזקה של אוניברסיטת דיוק (RK), מענק זרע של קרן מנדל (RK) ומענק T32 HL007101 Training (DCC). בנוסף, ברצוננו להודות לאוולין מק'קאלו על הסיוע בגידול עכברים ולד"ר דאגלס מרצ'וק ומתיו דטר על הערות ודיון מועילים. לבסוף, ברצוננו להודות ל-Purushothama Rao Tata על שסיפקה באדיבות עכברי R26R-Rainbow .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass coverslipFisherScientific12-544E
6-O proleneEthicon8706H
Anti-fade mounting mediumFisherScientific00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
CryomoldsVWR15160-215
CryoprobeWorld Precision Instruments501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ softwarehttps://imagej.net
KCl 1MFisherScientificLC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mmWorld Precision Instruments14003
Myh6-CreERT2 miceThe Jackson Laboratory005657
Needler holderWorld Precision Instruments14109
Paraformaldehyde 4%FisherScientificAC416785000
Phosphate buffered saline
Pythonhttps://www.python.org/
Rhttps://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)FisherScientificBP220
Surgical dissecting scissorsWorld Precision Instruments14393
Syringe for tamoxifenVWRBD328438
Tamoxifen, 20 μgSigmaT5648
Tissue Freezing MediaVWR15148-031
White Frosted/Plus slidesGlobe Scientific1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software

References

  1. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
  2. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
  3. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  4. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  5. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  6. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  7. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  8. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
  9. Oberpriller, J., Oberpriller, J. C. Mitosis in adult newt ventricle. Journal of Cell Biology. 49 (2), 560-563 (1971).
  10. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  11. Wang, H., et al. Natural Heart Regeneration in a Neonatal Rat Myocardial Infarction Model. Cells. 9 (1), (2020).
  12. Ye, L., et al. Early Regenerative Capacity in the Porcine Heart. Circulation. 138 (24), 2798-2808 (2018).
  13. Zhu, W., et al. Regenerative Potential of Neonatal Porcine Hearts. Circulation. 138 (24), 2809-2816 (2018).
  14. Kadow, Z. A., Martin, J. F. Distinguishing Cardiomyocyte Division From Binucleation. Circulation Research. 123 (9), 1012-1014 (2018).
  15. Roy, E., Neufeld, Z., Livet, J., Khosrotehrani, K. Concise review: understanding clonal dynamics in homeostasis and injury through multicolor lineage tracing. Stem Cells. 32 (12), 3046-3054 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  17. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 1-13 (2018).
  18. Xiao, Q., et al. A p53-based genetic tracing system to follow postnatal cardiomyocyte expansion in heart regeneration. Development. 144 (4), 580-589 (2017).
  19. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  20. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  21. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  22. Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Science Translational Medicine. 7 (281), 245 (2015).
  23. Polizzotti, B. D., Ganapathy, B., Haubner, B. J., Penninger, J. M., Kuhn, B. A cryoinjury model in neonatal mice for cardiac translational and regeneration research. Nature Protocols. 11 (3), 542-552 (2016).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. van Rossum, G. Python tutorial, Technical Report CS-R9526. Centrum voor Wiskunde en Informatica (CWI). , (1995).
  26. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  27. Denwood, M. J. runjags: An R package providing interface utilities, model templates, parallel computing methods and additional distributions for MCMC models in JAGS. Journal of Statistical Software. 71 (9), 1-25 (2016).
  28. Plummer, M., Best, N., Cowles, K., Vines, K. CODA: convergence diagnosis and output analysis for MCMC. R News. 6 (1), 7-11 (2006).
  29. Plummer, M. . Proceedings of the 3rd international workshop on distributed statistical computing. , 1-10 (2003).
  30. Kruschke, J. . Doing Bayesian data analysis: A tutorial with R, JAGS, and Stan. , (2014).
  31. Darehzereshki, A., et al. Differential regenerative capacity of neonatal mouse hearts after cryoinjury. Developmental Biology. 399 (1), 91-99 (2015).
  32. Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523 (7559), 226-230 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved