Analyse clonale du cœur de souris néonatale à l’aide de la modélisation du plus proche voisin

Résumé

Voici un protocole d’utilisation du traçage de lignage multicolore et de la modélisation du voisin le plus proche pour identifier les cardiomyocytes dérivés par clonage pendant la croissance et la régénération chez la souris. Cette approche est objective, fonctionne dans différentes conditions d’étiquetage et peut être adaptée pour intégrer une variété de pipelines d’analyse d’images.

Résumé

En remplaçant le myocarde perdu ou dysfonctionnel, la régénération tissulaire est une approche prometteuse pour traiter l’insuffisance cardiaque. Cependant, le défi de détecter une véritable régénération cardiaque limite la validation des facteurs de régénération potentiels. Une méthode pour détecter de nouveaux cardiomyocytes est le traçage de lignage multicolore avec analyse clonale. Les expériences d’analyse clonale peuvent être difficiles à entreprendre, car les conditions de marquage trop clairsemées manquent de sensibilité pour les événements rares tels que la prolifération des cardiomyocytes, et le marquage diffus limite la capacité à résoudre les clones. Voici un protocole pour entreprendre une analyse clonale du cœur de souris néonatale en utilisant la modélisation statistique des distributions des plus proches voisins pour résoudre les clones de cardiomyocytes. Cette approche permet de résoudre les clones dans une gamme de conditions de marquage et fournit une approche analytique robuste pour quantifier la prolifération et la régénération des cardiomyocytes. Ce protocole peut être adapté à d’autres tissus et peut être largement utilisé pour étudier la régénération tissulaire.

Introduction

Une caractéristique histologique de l’insuffisance cardiaque est la perte de cardiomyocytes (MC), soit à la suite d’une blessure, d’une sénescence ou d’une apoptose¹. La reconstitution du myocarde perdu ou dysfonctionnel par la régénération tissulaire représente une stratégie thérapeutique potentielle pour guérir les patients atteints d’insuffisance cardiaque. Au cours des dernières décennies, des progrès fondamentaux en biologie du développement et de la biologie régénérative ont mis au jour une capacité limitée du cœur des mammifères à reconstituer les CM^{2, 3, 4, 5} perdus. Ce travail passionnant a soulevé la possibilité que les mécanismes de croissance innés puissent être déployés pour la régénération. Étant donné que les réponses régénératives innées sont fonctionnellement absentes dans le cœur des mammifères adultes, des méthodes visant à améliorer la robustesse de la réparation endogène sont nécessaires pour que la régénération thérapeutique du cœur puisse être réalisée.

Les mécanismes de régénération innée du cœur semblent être conservés d’une espèce à l’autre. À la suite d’une blessure, les MC préexistants prolifèrent pour générer de nouveaux MC chez le poisson-zèbre ^6,7, le triton ^8,9, la souris ^4,10, le rat¹¹ et le porc^12,13. En conséquence, de nombreux groupes cherchent à identifier des mitogènes capables de favoriser la cardiomyogenèse. Cependant, ce travail est difficile. Non seulement la tâche de faire proliférer les MC de mammifères adultes est intimidante, mais il^{est difficile} d’identifier des événements prolifératifs rares1,14. Le défi d’identifier les MC cycliques rares est aggravé par la tendance des MC de mammifères adultes à subir préférentiellement une endomitose. Par exemple, après une blessure au cœur de la souris, près de 25 % des MC de la zone frontalière réintègrent le cycle cellulaire, mais seulement 3,2 % des MC en divisent⁴. Étant donné que la plupart des MC cycliques dupliquent leur génome mais ne subissent pas de cytokinèse, le simple fait de rechercher une augmentation du nombre de CM cycliques est ambigu à la cardiomyogenèse de bonne foi. Ainsi, les tests d’incorporation de nucléosides par les MC ou de présence de marqueurs prolifératifs sur les MC peuvent ne pas indiquer entièrement la régénération. À mesure que de plus en plus de facteurs candidats à la régénération cardiaque apparaissent, des tests pour mieux identifier l’hyperplasie de la MC sont nécessaires.

L’analyse clonale par traçage de lignée est une approche précieuse pour le dosage de la cardiomyogenèse, car elle permet de visualiser directement les cellules et leur progéniture. Les approches traditionnelles de l’analyse clonale impliquent un marquage rare de cellules uniques avec un gène rapporteur. Cependant, le traçage de la lignée unicolore de cellules rares peut avoir une valeur limitée pour des événements peu fréquents tels que la prolifération de MC, car les chances de marquer un MC proliférant sont faibles¹⁵. Alternativement, le traçage de lignage multicolore peut augmenter la sensibilité de l’analyse clonale¹⁶. En bref, les cellules individuelles sont génétiquement marquées avec l’une des nombreuses protéines fluorescentes au hasard, de sorte que les cellules proliférantes génèrent des amas de cellules de couleur homogène qui peuvent être résolues à partir de cellules fluorescentes voisines. Cette méthode a été utilisée pour suivre la croissance à travers une variété d’organes, et a été plus récemment appliquée à des études sur la régénération cardiaque chez les mammifères^17,18. Alors que le traçage de la lignée multicolore peut détecter l’expansion clonale des CM aux stades embryonnaire et néonatal, les réponses régénératives innées ne sont pas facilement détectées dans le cœur de souris adulte après une lésion cardiaque^17,19. Une approche pour améliorer la sensibilité du traçage de lignage multicolore serait d’augmenter le niveau d’étiquetage et d’augmenter la probabilité de visualiser des événements rares. Cependant, un marquage plus large se fait au prix de l’impossibilité de distinguer les cellules marquées de la même manière comme provenant d’un ancêtre commun des cellules qui ont été marquées indépendamment avec le même fluorophore. Voici un protocole qui utilise la modélisation du voisin le plus proche pour identifier les MC clonalement apparentés dans le cœur de souris néonatale. Cette méthode est impartiale, quantitative et fonctionne dans une gamme de conditions d’étiquetage.

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Protocole

Toutes les procédures de manipulation des souris, d’opérations chirurgicales de survie et de prélèvement de cœurs doivent être approuvées par un comité institutionnel local d’utilisation des animaux.

1. Souris pour l’analyse clonale des MC

1. Croisez les souris Myh6-MerCreMer ²⁰ avec les souris Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw souris 21} pour générer Myh6-MerCreMer ; R26R-Souris bitransgéniques arc-en-ciel.
   1. Maintenir des stocks de souris homozygotes pour l’allèle R26R-Arc-en-ciel et croiser avec des souris hétérozygotes pour l’allèle Myh6-MerCreMerMer, de sorte que toutes les expériences soient réalisées chez des souris hétérozygotes pour l’allèle R26R-Arc-en-ciel. Alternativement, utilisez des souris homozygotes pour l’allèle R26R-Rainbow afin d’augmenter la diversité des couleurs, mais cela nécessitera un système d’imagerie capable de discriminer fidèlement les fluorophores EGFP, mCerulean, mOrange et mCherry.
2. Effectuer le génotypage au moment du prélèvement cardiaque.
   REMARQUE : Les souris Myh6-MerCreMer expriment une Cre recombinase inductible par le tamoxifène dans les MC et peuvent être génotypées à l’aide des amorces PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) et GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) pour générer un produit de 200 paires de bases (bp). Les souris R26R-Rainbow expriment constitutivement l’EGFP mais exprimeront stochastiquement mCerulean, mOrange ou mCherry après une recombinaison médiée par Cre. R26R-Rainbow peut être génotypé à l’aide des amorces de PCR CTCTGCTGCCTCTCTGGCTCTCTCTCTTC (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) et TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). L’allèle de type sauvage donne un produit de 350 pb et l’allèle arc-en-ciel donne un produit de 250 pb.

2. Cryolésion et marquage des cardiomyocytes

1. Effectuer les cryolésions comme décrit précédemment avec des modifications mineures^22,23. Placez délicatement des souris d’un jour (P1) sur un lit de glace pilée pendant 3 min pour induire un arrêt cardiaque. Confirmez une anesthésie adéquate en effectuant un pincement des orteils sans retrait réflexe.
   REMARQUE : Le moment de l’anesthésie est critique. La survie peut être altérée si les souris sont refroidies trop longtemps. De plus, l’âge des souris est critique. La capacité de régénération diminue fortement au cours de la première semaine de vie¹⁰.
2. Placez le chiot anesthésié sur une compresse froide et sous l’objectif d’un microscope chirurgical de dissection. À l’aide de microciseaux de 6 mm, effectuez une thoracotomie entre la 4e et la 5e côte afin d’exposer la surface antérieure du cœur.
3. À l’aide d’une cryosonde refroidie à l’azote liquide, placez la sonde sur le ventricule gauche pendant 1 à 2 s. Pour les blessures simulées, effectuez une thoracotomie sans cryolésion.
   REMARQUE : La durée de la cryolésion dicte l’étendue de la blessure. Des blessures prolongées diminueront les taux de survie.
4. Fermez l’incision avec une suture en polypropylène 6-0 fixée à une aiguille de 0,15 mm de diamètre.
5. Réchauffez rapidement le chiot et stimulez-le manuellement pour reprendre la circulation sanguine. Une fois que le chiot se déplace spontanément, placez-le sur un coussin chauffant.
6. Injectez 20 μg de tamoxifène récupérés par voie intrapéritonéale. À ce stade, injectez des analgésiques, tels que de la bupivacaïne à 0,25 % le long de la ligne de suture, si nécessaire. Retournez les petits à la mère.
   REMARQUE : Les petits d’une seule portée sont récupérés ensemble et renvoyés ensemble à la mère. Ce flux de travail améliore la survie et la réacceptation de la litière par le barrage.

3. Prélèvement des cœurs et traitement pour l’analyse histologique

1. Récoltez les cœurs 20 jours après la blessure (ppp) ou le jour postnatal (P21), car les réponses régénératives peuvent être observées à ce point¹⁰. Euthanasiez d’abord les souris dans une chambre d’inhalation de CO₂ , puis transférez-les dans un microscope chirurgical.
   REMARQUE : L’euthanasie doit être pratiquée conformément aux directives institutionnelles pour l’utilisation des animaux.
2. Une fois qu’une anesthésie suffisante est confirmée, effectuez une double thoracotomie à l’aide de microciseaux chirurgicaux pour exposer le cœur. Ensuite, perfuser le cœur avec 1 mL de 1 M de KCl, 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % et 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : Un lavage adéquat est nécessaire pour limiter les caillots sanguins intraventriculaires qui peuvent provoquer une autofluorescence lors de l’acquisition de l’image.
3. Après la perfusion, disséquez le cœur et placez-le dans un tube contenant au moins 1 ml de PBS.
4. Utilisez un microscope à dissection pour tailler les cœurs afin d’optimiser l’emboîtement. Une tranche horizontale sous l’atrium offre une bonne surface pour l’encastrement des cœurs pour les sections à axe court.
   REMARQUE : Alternativement, on peut couper transversalement le cœur si des sections à grand axe sont souhaitées.
5. Placer les cœurs parés dans 1 mL de saccharose à 30 % (poids/vol) à 4 °C pendant 12 à 18 h. Retirer les échantillons de la solution de saccharose. Incorporez les tissus coupés dans les blocs à l’aide d’un produit de congélation des tissus.
6. Congelez rapidement le tissu incrusté sur de la glace sèche et stockez les blocs à −80 °C.
7. Divisez des blocs de cœur entier congelés en sections de 10 μm à l’aide d’un cryostat, montez-les sur des lames chargées et stockez les lames à -20 °C. Divisez en série des cœurs sur 10 diapositives. Cela se fait en montant une section sur chacune des 10 diapositives avant de revenir à la première diapositive pour ajouter une autre section. Une telle stratégie limite les chances de capturer les mêmes CM sur plusieurs sections d’une diapositive donnée.
   REMARQUE : Veillez à limiter l’exposition à la lumière afin d’éviter la perte de fluorescence.
8. Lorsqu’elles sont prêtes pour l’imagerie, décongelez les lames et réhydratez-les dans le PBS. Ajoutez un support de montage anti-décoloration avant d’appliquer une lamelle en verre #1.5. Conservez les lames enrobées dans un récipient couvert à 4 °C.
   REMARQUE : Pour les résultats attendus pour la cryolésion, le lecteur est dirigé vers les travaux antérieurs sur ce sujet²³. Les sections cardiaques ont des niveaux élevés d’autofluorescence. L’utilisation d’agents de trempe, tels que le noir de soudan, avant l’application d’une lamelle peut aider à atténuer l’autofluorescence. Cependant, il faut faire preuve de prudence pour éviter d’éteindre les fluorophores d’intérêt.

4. Imagerie

REMARQUE : Les étapes ci-dessous s’appliquent à l’utilisation d’un microscope commercial (voir le tableau des matériaux) doté d’un système de fluorescence à champ large vertical avec des cubes de filtre équipés pour discriminer les fluorophores mCerulean, EGFP, mOrange et mCherry, et du logiciel associé à cette configuration (voir le tableau des matériaux). Les étapes supplémentaires varient en fonction du système d’imagerie utilisé exactement.

1. Imagez l’intégralité de la diapositive à un grossissement de 5x avec uniquement le filtre GFP pour créer une carte de diapositive.
2. Sélectionnez des sections individuelles de la carte des diapositives qui sont intactes et dont l’autofluorescence est limitée pour l’imagerie. En raison de la coupe en série en ensembles de 10 lames, les sections adjacentes seront espacées d’au moins 100 μm, empêchant l’imagerie des mêmes CM.
3. Effectuez une imagerie par balayage de tuiles pour les sections individuelles à l’aide d’un objectif 20x avec les filtres mCerulean, mOrange, mCherry et EGFP. Des images représentatives sont présentées à la figure 1.
4. Enregistrez les images dans un format qui permet de récupérer les informations de chaque chaîne. Veillez à nommer les fichiers dans un format qui permettra d’identifier le cœur, le fluorophore et la position de la section à l’intérieur du cœur. Une approche de nommage systématique est nécessaire pour les étapes de calcul ci-dessous.

5. Analyse des images pour identifier les CM étiquetés

1. Sélectionnez les sections imagées qui sont intactes de chaque ensemble et distribuez-les au hasard à tous les screeners. Assurez-vous que les agents de filtrage respectent les étapes suivantes pour chaque image.
2. Pour chaque canal (mCerulean, mOrange et mCherry), utilisez l’outil « Balance des couleurs » sur ImageJ²⁴ pour ajuster la luminosité et le contraste de l’image afin d’aider l’utilisateur à identifier les cellules étiquetées.
   REMARQUE : ImageJ est un outil d’analyse d’image gratuit qui peut être téléchargé à partir de https://imagej.net. Ce protocole utilisait la version 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. Dans ImageJ, sélectionnez « Définir les mesures » dans le menu déroulant « Analyser ». Dans la fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez « Zone | Centre de masse | Rectangle englobant | Limite au seuil ».
   REMARQUE : Le module de soustraction d’image peut parfois être utilisé pour améliorer le signal fluorophore par rapport à l’autofluorescence de fond. Cependant, si elle est effectuée, la soustraction doit être effectuée systématiquement pour toutes les images d’un ensemble de données.
4. Avec l’image qui vous intéresse ouverte, sélectionnez « Outils », puis sélectionnez « Gestionnaire de retour sur investissement » dans le menu déroulant « Analyser ». Cela ouvrira la fenêtre 'ROI Manager'.
5. Sélectionnez l’outil « Sélections à main levée » dans la barre d’outils ImageJ et tracez la cellule qui vous intéresse (Figure 2A). Une fois le tracé effectué, appuyez sur « t » ou utilisez le bouton « Ajouter [t] » dans la fenêtre « Gestionnaire de retour sur investissement » (Figure 2B). Répétez l’opération pour toutes les cellules d’un seul canal.
   REMARQUE : La segmentation et les retours sur investissement doivent être effectués séparément pour chaque canal.
6. Une fois que toutes les cellules d’un canal donné ont été sélectionnées, enregistrez les ROI dans un fichier .zip. Pour ce faire, sélectionnez d’abord « Désélectionner » dans la fenêtre « Gestionnaire de retour sur investissement » pour vous assurer qu’aucun retour sur investissement n’est mis en évidence. Ensuite, cliquez sur l’onglet « Plus » dans la fenêtre « Gestionnaire de retour sur investissement » et sélectionnez l’option « Enregistrer ». Cela ouvrira le navigateur de bureau, où les retours sur investissement sont enregistrés sous forme de fichier .zip.
7. Exportez les mesures de chacun des retours sur investissement sous forme de fichier .csv. Pour ce faire, assurez-vous qu’aucun retour sur investissement n’est mis en évidence, en sélectionnant à nouveau « Désélectionner », puis sélectionnez « Mesurer » dans la fenêtre « Gestionnaire de retour sur investissement ». Cela ouvrira une nouvelle fenêtre « Résultats » avec toutes les mesures sélectionnées précédemment.
8. Dans la fenêtre « Résultats », sélectionnez « Fichier », puis « Enregistrer sous » dans le menu déroulant (Figure 2C). Cela ouvrira à nouveau le navigateur de bureau, de sorte que le fichier peut être enregistré dans le format .csv.
   REMARQUE : Assurez-vous d’enregistrer les retours sur investissement et les mesures avant de passer à la segmentation du canal suivant.
9. Veillez à nommer les fichiers dans un format qui permettra d’identifier le cœur, le canal et la position de la section à l’intérieur du cœur. Par exemple, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (par exemple, 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' pour les retours sur investissement et 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' pour les mesures correspondantes).
   REMARQUE : Le code ci-dessous suppose la convention de nommage ci-dessus. Une convention de dénomination différente nécessitera une modification du code.

6. Analyse statistique

REMARQUE : Les cellules portant le même fluorophore sont un mélange de cellules dérivées clonales (kin) et de cellules non apparentées qui ont subi un événement de recombinaison aléatoire pour exprimer le même fluorophore (non-kin). Sur la base de données antérieures¹⁷, on suppose que les cellules apparentées ont une proximité physique plus proche que les cellules non apparentées exprimant le même fluorophore. Ainsi, les cellules parentes et non parentes peuvent être différenciées en fonction d’un seuil de distance. Cependant, afin de déterminer le seuil, les distributions du voisin le plus proche pour les cellules parentes et non parentes doivent être déconvoluées. Heureusement, les distributions du plus proche voisin pour les cellules non apparentées peuvent être estimées en évaluant les valeurs du voisin le plus proche de chaque cellule à la cellule la plus proche portant un fluorophore différent. Ici, une méthodologie est présentée pour déterminer statistiquement une distance seuil afin de définir la clonalité et pour attribuer une probabilité de parenté entre les cellules.

1. À l’aide des fichiers .csv obtenus à partir de la section 5, calculez les distances du voisin le plus proche pour chaque cellule à l’intérieur d’une tranche de cœur. Compilez ces résultats en distances intra-canal (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange et mCherry-mCherry) et entre les canaux (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry et mCherry-mCerulean). Enregistrez les résultats dans deux fichiers .csv : un pour les distances à l’intérieur d’un canal et un pour les distances entre les canaux.
   1. Installez le code Python²⁵ qui nécessite les bibliothèques numpy et pandas.
      > pip install numpy ; pip install pandas
   2. Calculez les distances et exportez des fichiers .csv pour les distances à l’intérieur du canal et les distances entre les canaux à l’aide de python snippet_6_1.py.
2. Lire les distances à l’intérieur et entre les canaux dans une trame de données R²⁶ , en convertissant les identificateurs cardiaques en une variable catégorielle. Appliquez un seuil choisi ad hoc en examinant les histogrammes des voisins les plus proches (Figure 3A, C) pour minimiser les valeurs aberrantes. Assurez-vous de choisir un seuil qui couvre plus de 90 % des distances entre les canaux et à l’intérieur des canaux, tout en excluant la longue traîne pour éviter de trop s’adapter au bruit à de grandes distances entre les voisins les plus proches. Ce protocole utilise un seuil de 400 μm (Figure 3). Utilisez Rscript snippet_6_2.R pour exécuter cette étape.
   REMARQUE : Alternativement, on peut modéliser plusieurs tranches en tant que variables individuelles. Ce protocole limite la complexité du modèle au niveau du cœur pour faciliter la modélisation et l’estimation.
3. Obtenez les logarithmes népériens pour les distances à l’intérieur du canal et entre les canaux. Étant donné que les cellules sont des entités non ponctuelles occupant de l’espace, la distribution minimale de distance du voisin le plus proche est centrée autour d’une valeur non nulle et a des queues asymétriques puisque la distance maximale entre les paires de cellules peut être considérablement supérieure aux valeurs médianes (Figure 3A, C). Utilisez la distribution log-normale pour modéliser de telles distributions (Figure 3B,D). Pour ce faire, utilisez Rscript snippet_6_3.R.
4. Utilisez le modèle bayésien suivant pour estimer les moyennes et les variances des distributions du plus proche voisin de kin (α₂, σ²₂) et non-kin (α₁, σ²₁), ainsi que la probabilité de distances à l’intérieur du canal résultant de la distribution de parenté (π=e^β/(1+e^β)) :
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²_| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   où Unif(a,b) est la distribution uniforme sur l’intervalle [a,b], N(μ,σ²|lσ 2 contraintes à l’intervalle (l,u), T₁(0,1|x>0) est la distribution de Cauchy standard (T avec 1 degré de liberté) contrainte à la demi-droite positive, bw.dist_i est la^ième distance de paire entre les canaux enregistrée et wi.dist_i est la^ième distance de paire enregistrée à l’intérieur du canal. Notez que les distances enregistrées à l’intérieur du canal ont une distribution de mélange à deux composantes reflétant le mélange de paires de cellules parentes et non parentes.
   1. Fournissez au modèle des préalables informatifs si possible. Par exemple, ce protocole s’attend à ce que les cellules parentes soient plus proches les unes des autres que les cellules non parentes, de sorte que cela est fourni comme a priori pour la moyenne de la distribution des distances. Ensuite, utilisez les packages R runjags²⁷ et coda²⁸ ainsi que le programme JAGS²⁹ pour l’estimation des paramètres (Rscript snippet_6_4.R).
5. Exécutez le modèle JAGS avec le nombre de chaînes correspondant au nombre de CPU disponibles. Utilisez Rscript snippet_6_5.R pour effectuer cette étape. Laissez le logiciel s’exécuter jusqu’à la convergence.
6. Utilisez des métriques pour tester la convergence de l’algorithme, telles que la taille effective de l’échantillon (disponible avec runjags), le diagnostic de convergence Gelman-Rubin (disponible avec runjags) et son autocorrélation (autocorr/autocorr.diag disponible dans coda). Vérifiez la qualité de l’ajustement du modèle estimé pour les distances du voisin le plus proche en inspectant un graphique Q-Q, qui trace une comparaison au niveau quantile des valeurs réelles et estimées des distances du voisin le plus proche à l’aide de Rscript snippet_6_6.R (Figure 4C,F). Ce script demande à l’utilisateur de modifier les valeurs des lignes 25 à 29 de snippet_6_6.R en fonction de la sortie de la commande 6.
   REMARQUE : Idéalement, une taille d’échantillon effective (SSeff) supérieure à 10 000 devrait être obtenue pour chacun des paramètres³⁰. Cependant, un SSeff supérieur à 2 500 peut convenir à certains modèles complexes. Le diagnostic de Gelman Rubin est de 1,00 pour une convergence parfaite et doit être inférieur à 1,05 pour une convergence satisfaisante. Une autocorrélation élevée indique un mélange lent au sein des chaînes et est un indicateur de convergence lente. Le tracé d’autocorrélation doit suivre une décroissance exponentielle dans le cas d’un bon modèle. Le tracé Q-Q des distributions réelles et modélisées du voisin le plus proche (Figure 4C, F) doit suivre la diagonale aussi près que possible.
7. Après avoir vérifié l’exactitude des modèles, obtenez la probabilité qu’une paire de cellules soit apparentée en fonction de leur distance. Pour déterminer une distance seuil permettant de déterminer si les cellules à l’intérieur du canal sont susceptibles d’être apparentées, identifiez la distance à laquelle la probabilité d’être apparentée tombe en dessous de 0,5. Cela peut être fait en utilisant Rscript snippet_6_7.R.
   REMARQUE : D’autres seuils peuvent être choisis en fonction des objectifs expérimentaux. Pour certaines applications, les seuils peuvent ne pas être pertinents et la probabilité d’être une paire de parenté peut être directement utilisée pour pondérer des paires de cellules.

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Résultats

Le respect du protocole de cryolésion néonatale devrait donner des cœurs P21 avec et sans lésion. Les cœurs cryoblessés ont une blessure bien circonscrite tandis que la surface des cœurs fictifs est lisse et homogène. Dans les cœurs cryoblessés, la zone de blessure doit être cohérente d’un cœur à l’autre. Après la microscopie, des images similaires à la figure 1 doivent être obtenues. Notez que la résolution de l’image permet d’iden...

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Discussion

Le traçage de la lignée multicolore est une approche puissante pour identifier les modèles de croissance des organes avec une résolution de cellule unique. Cependant, une limitation majeure du traçage de lignage multicolore est la nécessité d’un marquage clairsemé des cellules, ce qui peut réduire la sensibilité à l’identification d’événements rares. Pour des organes comme le cœur avec des niveaux notoirement faibles de renouvellement des cellules parenchymateuses, ce...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalational chamber
Cold pack
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Liquid Nitrogen
Microscissors, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 mice	The Jackson Laboratory	005657
Needler holder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Phosphate buffered saline
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Rotating Shaker
Stereoscope
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Surgical dissecting scissors	World Precision Instruments	14393
Syringe for tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Tissue Freezing Media	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 upright widefield fluorescence system
Zen 2.5 Blue software