体外楔形切片准备模拟在Vivvo神经元电路连接

摘要

将不同的突触输入与神经元的整合最好用一种制备来测量，这种制备保留了所有突触前核，以便自然计时和电路可塑性，但大脑切片通常切断许多连接。我们开发了一个经过修改的大脑切片来模拟体内回路活动，同时保持体外实验能力。

摘要

体外切片电生理学技术以精确的电和时间分辨率测量单细胞活动。脑片必须相对薄，以正确可视化和访问神经元进行贴片夹紧或成像，并且对大脑电路的体外检查仅限于急性切片中物理存在的。为了保持体外切片实验的好处，同时保留大部分前突触核，我们开发了一种新型切片制备。这种"楔形切片"设计用于贴片式电生理学记录，以描述脑干中中层胆汁（MOC）神经元的多种单声道、声驱动输入。这些神经元从由反边耳和相应的耳蜗核（CN）的刺激激活的神经元中接收其主要兴奋和抑制性输入。设计了一个不对称的大脑切片，在一个半球的横向边缘的玫瑰花外域中最厚，然后向相反半球的横向边缘变薄。在厚的一面，该片包含听觉神经根向大脑传递有关听觉刺激的信息，内在的CN电路，以及融合在反向MOC神经元上的脱联兴奋和三联突抑制的通路。记录从片片薄侧的MOC神经元进行，在该实验中，使用DIC光学元件进行典型贴片夹实验。当听觉神经进入听觉脑干时，直接刺激它，允许内在CN电路活性和突触可塑性发生在MOC神经元上游的突触。使用这种技术，可以尽可能密切地模拟切片内的体内电路激活。这种楔形切片制备适用于其他脑电路，其中电路分析将受益于保持上游连接和远程输入，结合体外切片生理学的技术优势。

引言

神经回路活动的观察是理想地用原生感官输入和反馈进行的，以及大脑区域之间在体内的完整连接。然而，进行神经回路功能单细胞分辨率的实验仍然受到完整大脑中技术挑战的受限。虽然在体内细胞外电生理学或多光子成像方法可用于调查完整神经系统的活动，但解释不同输入如何集成或测量亚星体突触输入仍然很困难。体内全细胞记录克服了这些限制，但很难执行，即使在大脑区域，很容易访问。单细胞分辨率实验的技术挑战在位于大脑深处的某些神经元群体或空间扩散群体中进一步放大，这些群体需要基因工具来定位体内细胞（例如，与视光记录配对的通道霍多辛的遗传表达）或记录站点标记后（例如具有神经传递特异性标记）后组织化学识别。位于脑干的腹外表面附近，中层胆道（MOC）神经元受到上述^限制1，使得它们极难进入体内实验。

脑片（±100-500μm厚度）长期以来一直用于研究脑电路，包括听觉脑干电路，因为同一切片^{2、3、4、5、6、7、8、9}中所含的神经元的物理^分离。其他实验室都使用更厚的切片（>1 mm）进行实验，以了解双边输入如何整合在高级橄榄复合物（SOC）区域，包括中层高级橄榄^10，11。这些切片的准备，使听觉神经（AN）的轴突保持完好无损的切片内，并受电刺激，启动突触神经递质释放在CN，模仿一阶听觉神经元的活动，因为他们会响应声音。这些厚切片的一个主要缺点是神经元的可见性，用于贴片电生理记录（"修补"）。修补变得越来越困难，因为在这个区域的许多轴突成为骨髓与^年龄12，13，14，15，使组织光学密集和模糊神经元，即使在一个典型的，薄的大脑切片。我们的目标是创造体外准备，更类似于体内记录电路连接，但与高通量和高分辨率记录能力视觉引导补丁夹电生理学在脑片。

我们的实验室研究听觉发泡系统神经元的生理学，包括MOC神经元。这些胆碱神经元通过调节外发细胞^{（OHCs）16、17、18、19、20}的活性^{，为耳蜗提供}发^向反馈。先前的研究显示，这种调制在耳蜗^{21、22、23、24、25、26}和隔音^{创伤27、28、29、30、31、32、33}等的增益控制中起着^{一定的作用}。在小鼠中，MOC神经元弥漫地位于听觉脑干1中梯形体（VNTB）的腹^核。我们组利用与 tdTomato 记者鼠标线交叉的 ChAT-IRES-Cre 鼠标线，在显光照明下瞄准脑干切片中的 MOC 神经元。我们表明，MOC神经元从梯形体（MNTB）的吸管内核接收一个抑制性输入，而梯形体（MNTB）则由反边合体核^{（CN）34、35、36、37、38}中的球状浓密细胞（GBC）的轴突激发。此外，MOC神经元可能从反面^{CN39、40、41}中的T-斯特拉特细胞^{接收其兴奋性输入}。综合起来，这些研究表明，MOC神经元接收来自同一（反向）耳朵的兴奋和抑制性输入。然而，前突触神经元，及其轴突聚集在MOC神经元上，在典型的日冕切片制备中，彼此不够接近，无法完全完好无损。为了研究突触输入与MOC神经元的整合如何影响其作用潜在的射击模式，我们开发了一种制备，我们可以以最生理上现实的方式刺激从一只耳朵对MOC神经元的不同影响，但具有体外脑切片实验的技术益处。

楔形切片是一种经过修改的厚切片制备，用于调查MOC神经元中的电路集成（图1A中所示）。在切片的厚侧，楔子包含听觉神经的被切断轴突（以下简称"听觉神经根"），因为它们从边缘进入脑干，并在CN中突触。听觉神经根可以电刺激，唤起神经递质释放和突触激活完全完整的CN 42，43，44，45，46^细胞。这种刺激格式对电路分析具有若干优点。首先，我们刺激的不是直接刺激向MOC神经元提供输入的T-斯特拉特和GBC轴突，而是刺激性，以允许激活CN中丰富的内在电路。这些电路调节CN神经元的输出到他们在整个大脑的目标，包括MOC神经元46，47，48，49，50，51。其次，从安到MOC神经元的CN上游的多合成激活允许更自然的激活时间，使可塑性在这些突触中发生，因为它们在听觉刺激期间在体内发生。第三，我们可以改变我们的刺激模式来模仿一个活动。最后，对MOC神经元的兴奋和抑制单声投影在楔片中完好无损，它们在MOC神经元中可以测量其整合，并精确测量贴片-夹触电生理学。总的来说，与典型的脑切片制备相比，这种激活方案为MOC神经元提供了一个更完整的电路。这种脑干楔形切片也可用于研究其他听觉区域，接受从ipilatermNTB的抑制性输入，包括横向优越的橄榄，优越的橄榄核和中高级橄榄10，11，52，53，54，55，56。除了我们的具体准备，这种切片方法可以使用或修改来评估其他系统，其好处是保持远程输入的连接，并改善神经元的可视化，用于各种单细胞分辨率电生理学或成像技术。

该协议要求使用可倾斜约 15° 的振动台或平台。在这里，我们使用一个市售的两件式磁舞台，"舞台"是一个金属盘，底部弯曲，放置在凹式磁性"舞台基座"中。然后可以移动舞台以调整切片角度。舞台基座上的同心圆用于可重复估计角度。舞台和舞台底座放置在切片室中，其中磁级底座也可以旋转。

研究方案

所有实验程序都得到国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验准备

注:有关切片制备的详细信息，包括切片溶液、切片温度、切片孵化温度和装置（等）是本实验中进行脑干制备的特明。切片孵育细节可以根据实验室经验进行更改。

1. 准备用于修补的内部解决方案。
   1. 准备含有（以 mM）76 Cs-甲烷硫化酯的电压夹溶液， 56 CsCl， 1 MgCl₂， 1 CaCl₂， 10 HEPES ， 10 EGTA ， 0.3 Na-GTP ， 2 Mg-ATP ， 5 Na₂-磷酸，5 QX-314， 和 0.01 亚历克萨氟-488 氢化物.使用 CSOH 将 pH 调整为 7.2。
   2. 准备含有（在mM）125 K-葡萄糖酸，5KCl，1MgCl 2，0.1 CaCl_2，10HEPES，1 EGTA，0.3 Na-GTP，2 Mg-ATP，1 Na_2-磷酸酸酯和0.01亚历克萨氟-488氢化物的当前夹紧溶液。使用 KOH 将 pH 调整为 7.2。
2. 在100 mL热（接近沸腾）水中加入4克的阿加，准备100 mL的4%的阿加。放在加热搅拌板上以保持温度并搅拌，直到完全溶解。倒入 100 毫米塑料培养皿，深度约 1 厘米，让冷却。冷藏至需要。
3. 准备 1 L 人工脑脊液 （ACSF） 包含 mM: 124 NaCl， 1.2 CaCl_2，1.3 MgSO_4，5 KCl， 26 NaHCO_3，1.25 KH₂PO_4，和 10 葡萄糖.用碳化物 （5% CO₂ / 95% O_2）泡至少 10 分钟，然后根据需要，用 1 M NaOH 将最终 pH 调整为 7.4。在整个实验中，通过不断使用碳化物冒泡，保持溶液的氧合和pH值。
4. 在ACSF中加入1 mM基努林酸，准备200 mL切片溶液。声波溶液在声波水浴10分钟，直到基努雷酸溶解。不断冒泡与碳原和放在冰上。
   注意:处理基努雷酸时，请使用适当的个人防护设备。
5. 按照制造商的说明在振动器中安装适当的刀片。用冰围起冰，将振动室用冷。

2. 脑切除与完整的听觉神经根刺激

注:这些实验的小鼠是通过穿越C57BL/6J背景的C57BL/6J背景的ChAT-IRES-Cre转基因小鼠与tDTomato记者小鼠（Ai14）获得的。用于组织学和电生理学的小鼠是听力后发病（P14-P23），在小鼠中围绕P12。在梯形体（VNTB）的腹核中表达tdTomato的神经元以前被描述为此小鼠线⁵⁷中的MOC神经元。

1. 安乐死（例如，CO₂ 窒息）和斩首动物使用批准的机构程序。
2. 使用剃刀刀片，将头骨中线的皮肤从鼻子切到颈部后面。剥回皮肤露出头骨。
3. 使用小剪刀，在头骨的切口通过中线开始从头骨的基础（脊髓附近的骨端）开始，并继续向鼻子。
4. 在羔羊缝合，从中线切到头骨，向两侧的耳朵倾斜。剥回头骨露出大脑。
5. 从公鸡端开始，用小实验室铲或钝钳轻轻地将大脑从头骨上抬起来。切断视神经，继续轻轻地向后工作大脑，露出腹体表面。
6. 在脑干的腹体表面附近用细钳捏三叉神经，切开三叉神经。
   注意:请小心操作，因为背心神经就在这一点下方，需要完好无损才能最终受到刺激。
7. 将制剂放在装满冷切片溶液的玻璃培养皿中。将盘子放在解剖显微镜下。用碳原轻轻泡。
8. 修剪靠近脑干的面部神经，并暴露叶神经。
9. 使用精细钳子，将尖端推入前脑炎，其中前脑神经尽可能离开头骨，捏紧神经将其切断，使神经根附着在脑干上。在另一边重复。
10. 一旦两个神经根都自由了，从脑干靠近梯形身体的脑干的腹表面去除脑和血管。
11. 通过捏住剩余的颅神经和结缔组织来将大脑完全从头骨中释放出来，如果可能的话，小心保存剩余的脊髓。

3. 在舞台上阻止和安装大脑（磁盘）

1. 准备大脑的表面，通过阻塞大脑在光学奇亚姆的水平固定到阶段。
   1. 随着腹体表面向上，使用钝器稳定大脑，轻轻地固定脊髓，使大脑在以下步骤中不会倾斜。
   2. 在光学气则，使用开放钳子创建平面，通过插入大脑到盘子的底部来阻挡大脑。从垂直角度以大约 20° 的角度插入钳子，使尖端从脑筋膜的后面到光学奇亚姆。
   3. 使用剃刀刀片切割钳子。
2. 将大脑粘在舞台表面。
   1. 准备一小块 （+1 厘米³） 4% 的阿加量，用于支撑大脑。
   2. 在舞台上放置一小滴胶水，并铺入一个矩形，这样大脑和阿加块都可以粘下来。
   3. 使用钳子，小心地抬起大脑，用纸巾的边缘轻轻涂抹多余的液体。将堵塞的表面放在胶水上，在切片过程中，腹体表面会朝向刀片。
   4. 轻轻将阿加块推到大脑的背表面，在切片过程中支撑它，并确保正确的大脑定位（即角度）。

4. 切片大脑创建楔形切片

注:使用在厚侧有耳蜗神经根和中层胆汁（MOC）神经元和梯形体（MNTB）的中枢核的振动器准备大脑切片。

1. 将带连接大脑的磁碟放在舞台底座上，并将其放在切片室中，大脑的腹腔表面朝向刀片。
2. 用冰冷切片溶液填充腔室，用碳化物填充气泡。
3. 将刀片下到溶液中，将切片切割到感兴趣的区域，以确保切片是对称的。如果切片看起来不对称，则稍微倾斜舞台以获得对称性。
   注:刀片速度在0.05-0.10毫米/s之间是有效的切割健康切片，可能因动物年龄和大脑区域而异。
4. 一旦切片对称，将舞台 [15]（对应于舞台基座上的大约 3 个同心环）移向一侧。
   注:将舞台从要保留在切片中的听觉神经根移开。
5. 继续小心切开，直到听觉神经根靠近一侧的表面，面部神经可以看到另一侧的表面。
6. 将舞台移回 15° 到原始位置。
7. 将刀片从组织上移开，旋转舞台底座 90°，使薄侧的侧边朝向刀片。降低刀片几百微米，然后慢慢将刀片靠近组织的边缘。重复此错误，直到刀片接触横向边缘。将刀片降到切片薄边所需的厚度，此处再增加两百微米。
   注:在进行贴片夹紧的一侧，在梯形体（VNTB）的腹核水平处，理想的是±300 mm厚。
8. 将刀片从组织移回，将舞台底座旋转回来，使腹体表面朝向它。
9. 进行指定楔形切片的地体表面的切口。将切片转移到一块接口纸 （1 厘米²） 的考达尔表面向下。将切片移动到孵化室或其他合适的孵化装置进行回收（35°C 时为 30 分钟）。
   注:面部神经应在旋转面表面切片的两个半球上可见（参见 图 1B）。

5. 电生理学设置和记录

1. 将楔片放在记录室中，用竖琴或稳定系统固定切片。在温暖（35°C）ACSF与碳原泡下，以7-10 mL/min的速度连续吸收组织。
2. 使用带 561 nm 发射滤波器的荧光识别 VNTB 中带基因标记的 MOC 神经元，用于贴片夹记录。如果没有潜在的可修补单元格，翻转切片。
3. 使用 DIC 光学器件，聚焦切片厚侧的听觉神经根，并使用微操纵器将双极钨刺激电极向下移动到听觉神经根，并轻轻地移动到组织表面。
   注:吸附电极已用于其他实验室的听觉神经刺激实验。如果适用于其他特定制剂，可以使用玻璃电极或光学刺激方法。
4. 将视场移回 VNTB 以选择 MOC 神经元作为贴片夹电生理学的目标。
5. 为建议的实验为记录移液器填充适当的内部解决方案。
6. 在全细胞配置中修补和记录从 MOC 神经元。如果需要，补偿膜电容和系列电阻。
7. 调整听觉神经根的电刺激振幅，以获得MOC神经元中一致的后突触事件。
   注:可能需要移动刺激电极。
8. 运行适当的刺激方案，观察MOC（电压钳）或动作电位模式（电流钳）中唤起的突触电流。
   注:楔形切片制备可用于任何典型的贴片夹工具，如松散贴片记录、药理学、光遗传学、钙成像、神经递质解开等。

6. 脑干核的组织学确认

注:这是用紫紫罗兰染色，在固定，重新切片楔片完成。此方法允许可视化切片中包含的核。

1. 准备楔形切片后，将切片淹没在固定（PBS 中的 4% PFA）中过夜。在 PBS 中冲洗切片 3 次 10 分钟（摇床的室温），然后在 4 °C 下将 30% 蔗糖在 PBS 中过夜以进行低温保护。
2. 将切片重新切成冷冻微原子（40-70 mm），并在PBS的24井板中收集串行部分。
3. 在明胶涂层的幻灯片上安装部分，让完全干燥。将幻灯片放在滑轨中。
4. 准备紫红色溶液
   1. 在 500 mL dH₂O 中混合 5 克氯锡紫醋酸盐，准备 1% 氯锡紫醋酸盐
   2. 通过首先制备 90 mL 溶液 A（540 mL 冰川醋酸 = 89.46 mL dH₂O）和 10 mL 溶液 B（10 mL dH₂O 中的 136 毫克醋酸钠）来制备醋酸盐缓冲液。结合溶液 A 和溶液 B 产生醋酸盐缓冲液。
   3. 将 1% 氯乙基紫醋酸盐与醋酸盐缓冲液 1:1 混合在醋酸酯缓冲液中，用于 0.5% 氯乙基紫罗兰。使用前请过滤。
   4. 通过用适当体积的 dH₂O 稀释 100% 乙醇，准备 95% 和 70% 乙醇
5. 执行紫红色染色协议。将滑滑车移过溶液托盘，在纸盒之间的纸巾上印迹多余的溶液:二甲苯 = 5 分钟;95%乙醇= 3分钟;70% 乙醇 = 3 分钟;dH₂O = 3 分钟;0.5% 氯乙烯紫罗兰溶液 – 8-14 分钟频繁监测，直到核染色变成深紫色;dH₂O = 3 分钟;70% 乙醇 = 3 分钟;95%乙醇= 1-2分钟;100% 乙醇 = 浸滑梯两次;二甲苯 = 5 分钟;二甲苯:25分钟，直到安装执行。
   注意:仅在烟罩下使用 Xylenes。
6. 一次从二甲苯上拆下一个幻灯片，并立即使用安装介质将盖滑在幻灯片上。允许安装介质干燥（过夜）。
7. 图像部分。

7. 生物细胞素标签，用于活的、未固定的组织中轴翁的逆向追踪

1. 准备楔形切片，如上（步骤 2-4）。
2. 将切片转移到接口纸张 （+1 厘米²） 。在解剖显微镜下，将CN定位在切片厚的一侧。
3. 通过扭动纸巾的一角，小心地从切片周围区域去除多余的ACSF，将ACSF从组织中拉离。这可以防止生物细胞素扩散到切片的周围区域，这可能导致摄取到CN以外的细胞。
4. 使用精细钳子，选择一个小的生物细胞素晶体，并放在CN的表面。轻轻地将晶体压入组织，促进与神经元的接触，随后吸收到索玛塔。重复此步骤以覆盖所需的感兴趣区域，本例中为包含 T-stellate 和 GBC 神经元的 CN 区域。
5. 将切片放在孵化室中。允许切片在35°C下孵育2-4小时，以便吸收和运输生物细胞素。孵育后，在ACSF中冲洗切片以去除任何生物细胞素颗粒。
6. 将切片放置在固定（PBS 中的 4% PFA）中过夜。用 PBS 冲洗 3 次 10 分钟。
7. 在4°C或直到切片下沉时，在PBS中隔夜将30%蔗糖中的冷冻切片冷冻。
8. 在70-100 mm的冷冻显微原子上重新切除组织，产生横向部分。
9. 使用标准免疫组织化学方法处理具有荧光结合的链球菌素。
   注:如果有助于标记前突触细胞体、轴突、受体或其他对电路可视化重要的突触分子（即初级抗体步骤不应对生物细胞素二次可视化产生不利影响），则可以在各部分执行额外的免疫组织化学。
10. 成像组织。

结果

楔形切片的组织学研究
为了研究听觉脑干神经元功能，楔形切片制剂被设计为包含听觉神经根和CN反面的MOC神经元的目标记录（例如切片如图1B所示）。初步组织学检查的准备是重要的，以确认切片包含电路激活所必需的核，并且与弓投影完好无损。CN 中的两种细胞类型为 MOC 神经元提供声音信息。T-斯特拉特细胞被假设为MOC神经元39，40，41，58提供

讨论

这里描述的楔形切片切片过程对于保持完整的前突触神经元电路是强大的，但脑切片实验的可访问性，用于分析神经元功能。必须注意几个初始步骤，以最大限度地提高电路分析准备的效用。楔形的尺寸应使用组织学检查进行确认，这是确认前突触核及其囊突投影都包含在准备好的楔形切片中不可或缺的。如果投影被切断或几个轴子到达目标核，则切片几何可能需要修改。更一般来说，楔形切片?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental Preparations
Agar, powder	Fisher Scientific	BP1423500	4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488	Invitrogen	A10436	Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical Balance	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	Weighing chemicals
Double edged razor blade	Ted Pella	121-6	Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)	Sigma Aldrich	K3375-5G	Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH Meter	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	4% Agar Prep
Stirring Hotplate	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
Biocytin	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting Microscope	Amscope	SM-1BN	For precision dissection during brain removal
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3	WPI	501976	Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	Dissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)	Thomas Scientific	1220823	Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S Vibratome	Leica	1491200S001	Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissors	Roboz	RS-6872	Dissection tool
Single-edged carbon steel blades	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	Razor blade for dissection
Specimen disc, orienting	Leica	14048142068	Specialized vibratome stage for reproducible tilting
Spoonula	FisherSci	14-375-10	Dissection tool
Super Glue	Newegg	15187	Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal Microscope	Nikon Instruments		Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long	Sutter Instrument	BF150-110-10	Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFil	WPI	CMF20G	Patch electrode pipette filler
In-line solution heater	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Slice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator Systems	Sutter Intruments	MPC-200 with MP285	Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes	Sutter instruments	FG-P1000	Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and Software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Next	Can be any amplifier/software
Recording Chamber	Warner Instruments	RC26G	Slice "bath" during recording
Recording Chamber Harp	Warner Instruments	640253	Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation Chamber	Custom Build		Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unit	A.M.P.I.	Iso-Flex	Stimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controller	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Slice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrode	WPI	TM33CCINS	Stimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well Plate	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556006	Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 Streptavidin	Jackson Immuno labs	016-540-084	Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital Shaker	Sigma	CLS6780FP	Shaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich (Intramalls)	C5042-10G	Cellular stain for histology
Disposable Microtome Blades	Fisher Scientific	22-210-052	Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um	Fisher Scientific (Intramalls)	09-740-34A	Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01	Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rack	Fisher Scientific (Intramalls)	08-812	Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding Microtome	ThermoFisher	910020	Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-543D	Histochemistry slide cover glass
Permount mounting medium	Fisher Scientific	SP15-100	Cresyl violet section mounting medium
Superfrost Slides	Fisher Scientific	22-034980	Histology slides