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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Abstract

Le tecniche di elettrofisiologia a fette in vitro misurano l'attività a singola cellula con una precisa risoluzione elettrica e temporale. Le fette cerebrali devono essere relativamente sottili per visualizzare e accedere correttamente ai neuroni per il bloccaggio delle patch o l'imaging, e l'esame in vitro dei circuiti cerebrali è limitato solo a ciò che è fisicamente presente nella fetta acuta. Per mantenere i benefici della sperimentazione di fette in vitro preservando una porzione maggiore di nuclei presnaptici, abbiamo sviluppato una nuova preparazione di fette. Questa "fetta di cuneo" è stata progettata per le registrazioni di elettrofisiologia patch-clamp per caratterizzare i diversi input monaurali e sound-driven ai neuroni olivocochlear mediali (MOC) nel tronco encefalico. Questi neuroni ricevono i loro input eccitatori e inibitori afferenti primari dai neuroni attivati dagli stimoli nell'orecchio contralaterale e dal corrispondente nucleo cocleare (CN). È stata progettata una fetta cerebrale asimmetrica che è più spessa nel dominio rostro-caudale sul bordo laterale di un emisfero e poi si assottiglia verso il bordo laterale dell'emisfero opposto. Questa fetta contiene, sul lato spesso, la radice nervosa uditiva che trasmette informazioni sugli stimoli uditivi al cervello, sui circuiti NC intrinseci e sia sulle vie afferenti inibitorie disinaptiche che trisintottiche che convergono sui neuroni MOC contralaterali. La registrazione viene eseguita dai neuroni MOC sul lato sottile della fetta, dove vengono visualizzati utilizzando l'ottica DIC per tipici esperimenti patch-clamp. La stimolazione diretta del nervo uditivo viene eseguita mentre entra nel tronco uditivo, consentendo l'attività intrinseca del circuito CN e la plasticità sinaptica a sinapsi a monte dei neuroni MOC. Con questa tecnica, si può imitare l'attivazione del circuito in vivo il più vicino possibile all'interno della fetta. Questa preparazione della fetta di cuneo è applicabile ad altri circuiti cerebrali in cui le analisi dei circuiti beneficeranno della conservazione della connettività a monte e degli input a lungo raggio, in combinazione con i vantaggi tecnici della fisiologia delle fette in vitro.

Introduzione

L'osservazione dell'attività dei circuiti neurali viene eseguita idealmente con input sensoriali e feedback nativi e connettività intatta tra le regioni cerebrali, in vivo. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti che danno una risoluzione a una cellula della funzione del circuito neurale è ancora limitata da sfide tecniche nel cervello intatto. Mentre l'elettrofisiologia extracellulare in vivo o i metodi di imaging multifotonica possono essere utilizzati per studiare l'attività in sistemi nervosi intatti, interpretare come diversi input integrino o misurino gli input sinaptici sottosoglie rimane difficile. Le registrazioni intere cellulari in vivo superano questi limiti ma sono difficili da eseguire, anche nelle regioni cerebrali facilmente accessibili. Le sfide tecniche degli esperimenti di risoluzione a singola cellula sono ulteriormente amplificate in alcune popolazioni neuronali che si trovano in profondità nel cervello, o in popolazioni spazialmente diffuse che richiedono strumenti genetici per localizzare le cellule in vivo (ad esempio, espressione genetica della channelrhodopsina abbinata alla registrazione optrode) o identificazione istochimica post-hoc dopo la registrazione dell'etichettatura del sito (ad esempio con marcatori specifici della neurotrasmissione). Essendo situati diffusamente vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico, i neuroni olivocochlear mediali (MOC) soffrono dei limiti di cuisopra 1,rendendoli estremamente difficili da accedere per la sperimentazione in vivo.

Le fette cerebrali (~100-500 μm di spessore) sono state a lungo utilizzate per studiare i circuiti cerebrali, compresi i circuiti uditivi del tronco encefalico, a causa della segregazione fisica dei neuroni collegati che sono contenuti all'interno dellastessa fetta 2,3,4,5,6,7,8,9. Esperimenti che utilizzano fette molto più spesse (>1 mm) sono stati impiegati in altri laboratori per capire come gli input bilaterali si integrano nelle aree del complesso olivario superiore (SOC) tra cui l'oliva medialesuperiore 10,11. Queste fette sono state preparate in modo tale che gli assoni del nervo uditivo (AN) sono rimasti intatti all'interno della fetta e sono stati stimolati elettricamente ad avviare il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici nel CN, imitando l'attività dei neuroni uditivi di primo ordine mentre rispondevano al suono. Uno dei principali svantaggi di queste fette spesse è la visibilità dei neuroni per le registrazioni elettrofisiofisioche patch-clamp ("patching"). L'applicazione di patch diventa sempre più difficile man mano che i numerosi assoni in quest'area si mielivano conl'età di 12,13,14,15anni, rendendo il tessuto otticamente denso e oscurando i neuroni anche in una tipica, sottile fetta cerebrale. Il nostro obiettivo è quello di creare preparati in vitro che assomiglino più strettamente alla connettività del circuito delle registrazioni in vivo, ma con le capacità di registrazione ad alta produttività e ad alta risoluzione dell'elettrofisiologia patch-clamp guidata visivamente nelle fette cerebrali.

Il nostro laboratorio studia la fisiologia dei neuroni del sistema efferente uditivo, compresi i neuroni MOC. Questi neuroni colinergici forniscono un feedback efferente alla coclea modulando l'attività delle cellule ciliate esterne (OHC)16,17,18,19,20. Studi precedenti hanno dimostrato che questa modulazione gioca un ruolo nel controllo del guadagno nella cochlea21,22,23,24,25,26 e protezione dal trauma acustico27,28,29,30,31,32,33. Nei topi, i neuroni MOC si trovano diffusamente nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) nel tronco uditivo1. Il nostro gruppo ha utilizzato la linea di topi ChAT-IRES-Cre incrociata con la linea del mouse tdTomato reporter per colpire i neuroni MOC in fette di tronco encefalico sotto illuminazione epifluorescente. Abbiamo dimostrato che i neuroni MOC ricevono un input inibitoriofferente dal nucleo mediale ipsilaterale del corpo trapezoiato (MNTB), che è eccitato, a sua volta, dagli assoni delle cellule folte globulari (GBC) nel nucleo cocleare conlaterale (CN)34,35,36,37,38. Inoltre, i neuroni MOC probabilmente ricevono il loro input eccitatorio dalle cellule T-stellate nel contralaterale CN39,40,41. Nel loro insieme, questi studi mostrano che i neuroni MOC ricevono sia input eccitatori che inibitori derivati dallo stesso orecchio (contralaterale). Tuttavia, i neuroni presnaptici, e i loro assoni che convergono sui neuroni MOC, non sono abbastanza vicini l'uno all'altro per essere completamente intatti in una tipica preparazione delle fette coronali. Per indagare come l'integrazione degli input sinaptici ai neuroni MOC influenzi i loro potenziali schemi di fuoco d'azione, con particolare attenzione all'inibizione appena descritta, abbiamo sviluppato una preparazione in cui potremmo stimolare i diversi afferenti ai neuroni MOC da un orecchio nel modo più fisiologicamente realistico possibile, ma con i benefici tecnici degli esperimenti in vitro sulle fette cerebrali.

La fetta di cuneo è una preparazione di fette spesse modificata progettata per lo studio dell'integrazione del circuito nei neuroni MOC (schematizzata nella figura 1A). Sul lato spesso della fetta, il cuneo contiene gli assoni mozzati del nervo uditivo (chiamato "radice nervosa uditivo" di seguito) mentre entrano nel tronco encefalico dalla periferia e dalla sinapsi nel CN. La radice nervosa uditivo può essere stimolata elettricamente per evocare il rilascio di neurotrasmettitori e l'attivazione sinaptica delle cellule del CN42completamenteintatto,43,44,45,46. Questo formato di stimolazione ha diversi vantaggi per l'analisi del circuito. In primo luogo, invece di stimolare direttamente gli assoni T-stellati e GBC che forniscono un input afferente ai neuroni MOC, stimoliamo l'AN per consentire l'attivazione di circuiti intrinseci abbondanti nel CN. Questi circuiti modulano l'uscita dei neuroni CN ai loro obiettivi in tutto il cervello, compresi i neuroni MOC46,47,48,49,50,51. In secondo luogo, l'attivazione polisinaptica di circuiti afferenti dall'AN attraverso il CN a monte dei neuroni MOC consente tempi di attivazione più naturali e la plasticità a queste sinapsi come sarebbero in vivo durante la stimolazione uditivo. In terzo luogo, possiamo variare i nostri modelli di stimolazione per imitare l'attività AN. Infine, sia le proiezioni monoali eccitatorie che inibitorie ai neuroni MOC sono intatte nella fetta di cuneo e la loro integrazione può essere misurata su un neurone MOC con la precisione dell'elettrofisiologia patch-clamp. Nel complesso, questo schema di attivazione fornisce un circuito più intatto ai neuroni MOC rispetto a una tipica preparazione delle fette cerebrali. Questa fetta di cuneo del tronco encefalico può anche essere utilizzata per indagare altre aree uditivi che ricevono input inibitori da MNTB ipsilaterale tra cui l'oliva superiore laterale, il nucleo olivario superiore e l'oliva superiore mediale10,11,52,53,54,55,56. Oltre alla nostra preparazione specifica, questo metodo di affezione può essere utilizzato o modificato per valutare altri sistemi con i vantaggi di mantenere la connettività degli input a lungo raggio e migliorare la visualizzazione dei neuroni per una varietà di tecniche di elettrofisiologia o imaging a risoluzione a singola cellula.

Questo protocollo richiede l'uso di uno stadio o di una piattaforma del vibratomo che può essere inclinato di circa 15°. Qui usiamo uno stadio magnetico a 2 pezzi disponibile in commercio in cui lo "stadio" è un disco metallico con un fondo curvo posto in una "base dello stadio" magnetica concava. Il palco può quindi essere spostato per regolare l'angolo della fetta. I cerchi concentrici sulla base dello stadio vengono utilizzati per stimare l'angolo in modo riproducibile. La base dello stadio e dello stadio è posizionata nella camera di affezione, dove può anche essere ruotata la base dello stadio magnetico.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Preparazioni sperimentali

NOTA: I dettagli relativi alla preparazione delle fette, tra cui la soluzione di affettare, la temperatura di affezione, la temperatura e l'apparato di incubazione delle fette (ecc.) sono specifici per la preparazione del tronco encefalico eseguita in questo esperimento. I dettagli dell'incubazione delle fette possono essere modificati per esperienza di laboratorio.

  1. Preparare soluzioni interne per il bloccaggio delle patch.
    1. Preparare la soluzione di morsetto di tensione contenente (in mM) 76 Cs-metanosulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosfocreatina, 5 QX-314 e 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Regolare il pH a 7,2 con CsOH.
    2. Preparare la soluzione di morsetto corrente contenente (in mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosfocreatina e 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Regolare il pH a 7,2 con KOH.
  2. Preparare 100 mL di agar al 4% aggiungendo 4 g di agar a 100 mL di acqua calda (quasi bollente). Posizionare sulla piastra di agitazione riscaldata per mantenere la temperatura e mescolare fino a completa dissoluzione. Versare in piastre petri di plastica da 100 mm a circa 1 cm di profondità e lasciare raffreddare. Conservare in frigorifero fino a quando necessario.
  3. Preparare 1 L liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4e 10 destrosio. Bolla con carbogeno (5% CO2 / 95% O2) per almeno 10 min, quindi regolare il pH finale a 7,4 con 1 M NaOH se necessario. Mantenere l'ossigenazione e il pH della soluzione gorgogliando continuamente con carbogeno durante l'esperimento.
  4. Preparare la soluzione di affezione da 200 mL aggiungendo acido cinurenico da 1 mM all'ACSF. Soluzione sonicata in un bagno d'acqua sonicante per 10 minuti fino a quando l'acido cinurenico non viene sciolto. Bollare continuamente con carbogeno e posizionare sul ghiaccio.
    ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati durante la manipolazione dell'acido cinurenico.
  5. Montare una lama appropriata nel vibratomo seguendo le istruzioni del produttore. Raffreddare la camera di affettamento del vibratome circondarla di ghiaccio.

2. Rimozione del cervello con radice nervosa uditivo intatta per la stimolazione

NOTA: I topi per questi esperimenti sono stati ottenuti incrociando topi transgenici ChAT-IRES-Cre su uno sfondo C57BL/6J con topi reporter tdTomato (Ai14). I topi usati per l'istologia e l'elettrofisiologia erano post-udito (P14-P23), che è intorno a P12 nei topi. I neuroni che esprimono tdTomato nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) sono stati precedentemente caratterizzati come neuroni MOC in questa linea di topo57.

  1. Eutanasia (ad esempio asfissia di CO2) e decapitare l'animale utilizzando procedure istituzionali approvate.
  2. Usando una lama di rasoio, tagliare la pelle alla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Sbucciare la pelle per esporre il cranio.
  3. Usando piccole forbici, fai un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana partendo dalla base (estremità caudale vicino al midollo spinale) del cranio e continuando verso il naso.
  4. Alla sutura lambda, fare tagli nel cranio dalla linea mediana, laterale verso l'orecchio su entrambi i lati. Sbucciare il cranio per esporre il cervello.
  5. A partire dall'estremità rostrale, sollevare delicatamente il cervello lontano dal cranio con una piccola spatola da laboratorio o forcep smussate. Tagliare il nervo ottico e continuare a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale.
  6. Tagliare i nervi trigeminali pizzicandoli con force sottili vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico.
    NOTA: Fallo con attenzione poiché il nervo vestibulocochlear si trova appena sotto questo e deve essere intatto per un'eventuale stimolazione.
  7. Mettere la preparazione in una piastra di Petri di vetro riempita con soluzione di affezione a freddo. Posizionare il piatto al microscopio di sezionamento. Bolla delicatamente con carbogeno.
  8. Tagliare il nervo facciale vicino al tronco encefalico ed esporre il nervo vestibulocochlear.
  9. Usando forcep fini, spingere le punte nella foramina dove il nervo vestibulocochlear esce il cranio il più lontano possibile e pizzicare il nervo per remarlo, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico. Ripeti questo dall'altra parte.
  10. Una volta che entrambe le radici nervose sono libere, rimuovere le meningi e la vascucolatura dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoiato.
  11. Liberare completamente il cervello dal cranio pizzicando i nervi cranici rimanenti e il tessuto connettivo facendo attenzione a preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.

3. Bloccare e montare il cervello sul palco (disco magnetico)

  1. Preparare la superficie del cervello per fissarsi allo stadio bloccando il cervello a livello del chiasmo ottico.
    1. Con la superficie ventrale verso l'alto, stabilizzare il cervello usando uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale in modo che il cervello non si inclini durante il passaggio successivo.
    2. A livello del chiasmo ottico, usa le forcep aperte per creare il piano per bloccare il cervello inserendo attraverso il cervello fino al fondo del piatto. Inserire le forcep con un angolo di circa 20° da verticale in modo che le punte escino dalla superficie dorsale del cervello caudale al chiasmo ottico.
    3. Tagliare lungo le forcep usando la lama del rasoio.
  2. Incollare il cervello sulla superficie dello stadio.
    1. Preparare un piccolo blocco (~ 1 cm3) del 4% di agar per sostenere il cervello.
    2. Posizionare una piccola goccia di colla sul palco e stenderla in un rettangolo in modo che sia il cervello che il blocco di agar possano essere incollati verso il basso.
    3. Usando le forcep, sollevare con cura il cervello e tamponare delicatamente il liquido in eccesso usando il bordo di un tovagliolo di carta. Posizionare la superficie bloccata sulla colla, la superficie ventrale sarà verso la lama durante l'affettamento.
    4. Spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale del cervello per sostenerlo durante l'affezione e garantire un corretto posizionamento cerebrale (cioè un angolo).

4. Affettare il cervello per creare una fetta di cuneo

NOTA: Preparare una fetta cerebrale usando il vibratoma che ha la radice nervosa cocleare sul lato spesso e i neuroni olivocochlear mediali (MOC) e il nucleo mediale del corpo trapezoidico (MNTB) sul lato sottile.

  1. Posizionare il disco magnetico con il cervello attaccato sulla base del palco e posizionarlo nella camera di affezione con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama.
  2. Riempire la camera con soluzione di affettamento ghiacciato e bollare con carbogeno.
  3. Abbassare la lama nella soluzione e tagliare le fette caudali nella regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Se le fette appaiono asimmetriche, inclinare leggermente lo stadio per ottenere simmetria.
    NOTA: Le velocità della lama tra 0,05-0,10 mm/s sono state efficaci per tagliare fette sane e possono variare a seconda dell'età animale e della regione cerebrale.
  4. Una volta che le fette sono simmetriche, spostare lo stadio ~15° (corrispondente a circa 3 anelli concentrici sulla base del palco) su un lato.
    NOTA: spostare lo stage lontano dalla radice del nervo uditivo che si desidera conservare nella sezione.
  5. Continuare a affeggiare attentamente fino a quando la radice nervosa udibile è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato.
  6. Spostare il palco indietro di 15° nella posizione originale.
  7. Allontanare la lama dal tessuto e ruotare la base del palco di 90° in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama. Abbassare la lama diverse centinaia di micron e quindi portare lentamente la lama vicino al bordo del tessuto. Ripetere questa ripetizione fino a quando la lama non tocca il bordo laterale. Abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta, qui altri duecento micron.
    NOTA: La fetta risultante è idealmente spessa circa 300 mm a livello del nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) sul lato in cui avrà luogo il bloccaggio del cerotto.
  8. Allontanare la lama dal tessuto e far girare indietro la base dello stadio in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso di essa.
  9. Creare il taglio che designa la superficie rostrale della fetta di cuneo. Trasferire la fetta su un pezzo di carta di interfaccia (1 cm2)di superficie caudale verso il basso. Spostare la fetta nella camera di incubazione o in un altro apparecchio di incubazione adatto per il recupero (30 min a 35 °C).
    NOTA: Il nervo facciale deve essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale (vedere figura 1B).

5. Configurazione e registrazione di elettrofisiologia

  1. Posizionare la fetta di cuneo nella camera di registrazione e fissare la fetta con un'arpa o un sistema di stabilizzazione. Perfondere continuamente il tessuto ad una velocità di 7-10 mL/min con ACSF caldo (35 °C) bollato con carbogeno.
  2. Identificare i neuroni MOC geneticamente etichettati nel VNTB utilizzando l'epifluorescenza con filtri di emissione a 561 nm per registrazioni di patch-clamp. Capovolgere la sezione se non sono disponibili celle potenzialmente patchabili.
  3. Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice nervosa udibile sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante del tungsteno bipolare verso la radice del nervo uditivo e delicatamente nella superficie del tessuto.
    NOTA: Gli elettrodi di aspirazione sono stati utilizzati in esperimenti di stimolazione nervosa uditivo in altri laboratori. Gli elettrodi di vetro theta o i metodi di stimolazione ottica possono essere utilizzati se applicabili ad altri preparati specifici.
  4. Spostare il campo visivo al VNTB per scegliere un neurone MOC da indirizzare per l'elettrofisiologia del patch clamp.
  5. Riempire una pipetta di registrazione con una soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto.
  6. Patch e registrazione dal neurone MOC nella configurazione a cellule intere. Compensare la capacità della membrana e la resistenza in serie, se necessario.
  7. Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditivo per ottenere eventi postinaptici coerenti nel neurone MOC.
    NOTA: Potrebbe essere necessario spostare l'elettrodo di stimolazione.
  8. Eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate in MOC (morsetto di tensione) o modelli di potenziale d'azione (morsetto di corrente).
    NOTA: La preparazione della fetta di cuneo può essere utilizzata con qualsiasi tipico strumento patch-clamp come registrazioni di patch sciolte, farmacologia, optogenetica, imaging del calcio, disaccamento del neurotrasmettitore, ecc.

6. Conferma istologica dei nuclei del tronco encefalico

NOTA: Questo viene fatto con colorazione viola cresile, in fetta di cuneo fissa e ri sezionata. Questo metodo consente la visualizzazione dei nuclei contenuti nella sezione.

  1. Dopo aver preparato una fetta di cuneo, immergere la fetta in fissivo (4% di PFA in PBS) durante la notte. Risciacquare la fetta 3x per 10 minuti in PBS (temperatura ambiente su uno shaker), quindi mettere in saccarosio al 30% in PBS durante la notte a 4 °C per crioproteggere.
  2. Ritagliare la fetta su un microtomo di congelamento (40-70 mm) e raccogliere sezioni seriali in una piastra da 24 pozza in PBS.
  3. Montare sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e lasciare asciugare completamente. Posizionare le diapositive nel carrello scorrevole.
  4. Preparare soluzioni di violetta cresile
    1. Preparare l'1% di acetato di violetta cresile mescolando 5 g di acetato di violetta cresile in 500 mL dH2O
    2. Preparare il tampone di acetato preparando prima la soluzione di 90 mL A (acido acetico glaciale da 540 mL + 89,46 mL dH2O) e 10 mL soluzione B (136 mg di acetato di sodio in 10 mL dH2O). Combinare la soluzione A e la soluzione B producendo il buffer di acetato.
    3. Unire l'1% di acetato di violetta cresile con il tampone di acetato 1:1 per lo 0,5% di viola cresile nel tampone di acetato. Filtrare prima dell'uso.
    4. Preparare il 95% e il 70% di etanolo diluire il 100% di etanolo con volumi appropriati di dH2O
  5. Eseguire il protocollo di colorazione viola cresile. Spostare il carrello scorrevole attraverso vassoi di soluzione, gonfiando la soluzione in eccesso su un tovagliolo di carta tra vassoi: xilene - 5 min; 95% di etanolo - 3 min; 70% di etanolo - 3 min; dH2O – 3 min; Soluzione di viola cresile allo 0,5% - monitoraggio di 8-14 minuti frequentemente fino a quando la colorazione nucleare diventa viola scuro; dH2O – 3 min; 70% di etanolo - 3 min; 95% di etanolo - 1-2 min; 100% di etanolo - il tuffo scivola due volte; xilene – 5 min; xilene: 25 min fino all'eseguito il montaggio.
    ATTENZIONE: Utilizzare gli xileni solo sotto una cappa aspirante.
  6. Rimuovere le diapositive dallo xilene una alla volta e posizionare immediatamente i coperchi sulle diapositive utilizzando il supporto di montaggio. Lasciare asciugare il supporto di montaggio (durante la notte).
  7. Sezioni immagine.

7. Etichettatura della biocitina per il tracciamento anterogrado degli assoni nel tessuto vivo e non con prefisso

  1. Preparare una fetta di cuneo come sopra (Passaggi 2-4).
  2. Trasferire la sezione sulla carta di interfaccia (~1 cm2). Al microscopio di sezionamento, individuare il CN sul lato spesso della fetta.
  3. Rimuovere con cura l'ACSF in eccesso dall'area circostante la fetta torcendo un angolo di carta velina per allontanare l'ACSF dal tessuto. Ciò impedisce alla biocitina di diffondersi nelle aree circostanti della fetta che potrebbero portare all'assorbimento nelle cellule al di fuori del NC.
  4. Con le forcep fini, selezionare un piccolo cristallo di biocitina e posizionarlo sulla superficie del CN. Premere delicatamente il cristallo nel tessuto per favorire il contatto con i neuroni e il successivo assorbimento nei somata. Ripetere questo passaggio per coprire la regione di interesse desiderata, in questo caso le regioni CN contenenti neuroni T-stellate e GBC.
  5. Posizionare la fetta in una camera di incubazione. Lasciare incubare la fetta per 2-4 h a 35 °C per consentire l'assorbimento e il trasporto della biocitina. Dopo l'incubazione, sciacquare la fetta in ACSF per rimuovere eventuali particelle di biocitina.
  6. Posizionare la fetta in fissivo (4% di PFA in PBS) durante la notte. Risciacquare 3 volte per 10 minuti in PBS.
  7. Crioproteggere la fetta in saccarosio al 30% in PBS durante la notte a 4 °C o fino a quando la fetta non affonda.
  8. Resect il tessuto per produrre sezioni trasversali su un microtomo di congelamento a 70-100 mm.
  9. Elaborare il tessuto utilizzando metodi immunoistochimici standard con una streptavidina coniugata fluorescentmente.
    NOTA: Ulteriori immunoistochimica possono essere eseguite sulle sezioni se utili per l'etichettatura di corpi cellulari presnaptici, assoni, recettori o altre molecole sinaptiche importanti per la visualizzazione del circuito (cioè, i passaggi degli anticorpi primari non dovrebbero influire negativamente sulla visualizzazione secondaria della biocitina).
  10. Immagine del tessuto.

Risultati

Esame istologico della fetta di cuneo
Per la nostra indagine sulla funzione neuronale del tronco encefalico uditivo, la preparazione della fetta di cuneo è stata progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il contralaterale CN ai neuroni MOC destinati alle registrazioni (fetta di esempio mostrata nella figura 1B). L'esame istologico iniziale del preparato è importante per confermare che la fetta contiene i nuclei necessari per l'attivazione del circuito e che l...

Discussione

La procedura di affettare qui descritta come una fetta di cuneo è potente per mantenere intatti circuiti neuronali presnaptici, ma con l'accessibilità della sperimentazione della fetta cerebrale per l'analisi della funzione neuronale. Occorre fare molta attenzione in diversi passaggi iniziali al fine di massimizzare l'utilità della preparazione per l'analisi del circuito. Le dimensioni del cuneo devono essere confermate mediante esame istologico, che è parte integrante della conferma che sia i nuclei presnaptici che ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

Riferimenti

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