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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’intégration de diverses entrées synaptiques aux neurones est mieux mesurée dans une préparation qui préserve tous les noyaux pré-synaptiques pour le timing naturel et la plasticité du circuit, mais les tranches de cerveau coupent généralement de nombreuses connexions. Nous avons développé une tranche de cerveau modifiée pour imiter l’activité du circuit in vivo tout en maintenant la capacité d’expérimentation in vitro.

Résumé

Les techniques d’électrophysiologie des tranches in vitro mesurent l’activité unicellique avec une résolution électrique et temporelle précise. Les tranches de cerveau doivent être relativement minces pour visualiser et accéder correctement aux neurones pour le patch-clamping ou l’imagerie, et l’examen in vitro des circuits cérébraux est limité à seulement ce qui est physiquement présent dans la tranche aiguë. Pour maintenir les avantages de l’expérimentation des tranches in vitro tout en préservant une plus grande partie des noyaux présynaptiques, nous avons développé une nouvelle préparation de tranches. Cette « tranche compensée » a été conçue pour les enregistrements d’électrophysiologie patch-clamp pour caractériser les diverses entrées monales et sonores aux neurones olivocochléaires médiaux (MOC) dans le tronc cérébral. Ces neurones reçoivent leurs entrées excitatrices et inhibitrices primaires afferent des neurones activés par des stimuli dans l’oreille contralatérale et le noyau cochléaire correspondant (CN). Une tranche de cerveau asymétrique a été conçue qui est la plus épaisse dans le domaine rostro-caudal au bord latéral d’un hémisphère, puis s’amince vers le bord latéral de l’hémisphère opposé. Cette tranche contient, sur le côté épais, la racine du nerf auditif transmettant des informations sur les stimuli auditifs au cerveau, les circuits intrinsèques du CN, et à la fois les voies afferentes excitatrices et trisynaptiques disynaptiques qui convergent vers les neurones moc contralatéraux. L’enregistrement est effectué à partir de neurones MOC sur le côté mince de la tranche, où ils sont visualisés à l’aide de l’optique DIC pour les expériences typiques patch-clamp. La stimulation directe du nerf auditif est effectuée à mesure qu’il pénètre dans le tronc cérébral auditif, ce qui permet à l’activité intrinsèque du circuit CN et à la plasticité synaptique de se produire aux synapses en amont des neurones MOC. Avec cette technique, on peut imiter l’activation du circuit in vivo aussi étroitement que possible dans la tranche. Cette préparation en tranches compensées s’applique à d’autres circuits cérébraux où les analyses de circuits bénéficieraient de la préservation de la connectivité en amont et des intrants à longue portée, en combinaison avec les avantages techniques de la physiologie des tranches in vitro.

Introduction

L’observation de l’activité des circuits neuronaux est idéalement effectuée avec les entrées sensorielles indigènes et la rétroaction, et la connectivité intacte entre les régions du cerveau, in vivo. Cependant, l’exécution d’expériences qui donnent une résolution à cellule unique de la fonction du circuit neuronal est encore limitée par des défis techniques dans le cerveau intact. Bien que des méthodes d’électrophysiologie extracellulaire in vivo ou d’imagerie multiphoton puissent être utilisées pour étudier l’activité dans les systèmes nerveux intacts, il reste difficile d’interpréter comment différents intrants intègrent ou mesurent les intrants synaptiques sous-marins. Les enregistrements in vivo à cellules entières surmontent ces limitations, mais sont difficiles à réaliser, même dans les régions du cerveau qui sont facilement accessibles. Les défis techniques des expériences de résolution à cellules uniques sont encore amplifiés dans certaines populations de neurones qui sont situées profondément dans le cerveau, ou dans des populations spatialement diffuses qui nécessitent soit des outils génétiques pour localiser les cellules in vivo (p. ex., expression génétique de la canalrhodopsine associée à l’enregistrement optrode) soit une identification histochimique post-hoc après l’étiquetage du site d’enregistrement (p. ex. avec des marqueurs spécifiques à la neurotransmission). Étant situés de façon diffuse près de la surface ventrale du tronc cérébral, les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) souffrent des limitationsci-dessus 1,ce qui les rend extrêmement difficiles d’accès pour l’expérimentation in vivo.

Les tranches de cerveau (~100-500 μm d’épaisseur) ont longtemps été utilisées pour étudier les circuits cérébraux, y compris les circuits auditifs de tronc cérébral, en raison de la ségrégation physique des neurones connectés qui sont contenus dans la mêmetranche 2,3,4,5,6,7,8,9. Des expériences utilisant des tranches beaucoup plus épaisses (>1 mm) ont été utilisées dans d’autres laboratoires pour comprendre comment les intrants bilatéraux s’intègrent dans les zones du complexe olivary supérieur (SOC) y compris l’olive supérieuremédiale 10,11. Ces tranches ont été préparées de telle sorte que les axones du nerf auditif (AN) sont restés intacts dans la tranche et ont été stimulés électriquement pour lancer la libération synaptique de neurotransmetteur dans le CN, imitant l’activité des neurones auditifs de premier ordre pendant qu’ils répondaient au bruit. Un inconvénient majeur de ces tranches épaisses est la visibilité des neurones pour les enregistrements électrophysiologiques patch-clamp (« patching »). Patching devient de plus en plus difficile que les nombreux axones dans ce domaine deviennent myélinated avecl’âge de 12,13,14,15, ce qui rend le tissu optiquement dense et obscurcissant neurones, même dans une typique, mince tranche de cerveau. Notre objectif est de créer des préparations in vitro qui ressemblent plus étroitement à la connectivité du circuit des enregistrements in vivo, mais avec les capacités d’enregistrement à haut débit et haute résolution de l’électrophysiologie visuellement guidée patch-clamp en tranches de cerveau.

Notre laboratoire étudie la physiologie des neurones du système auditif efferent, y compris les neurones MOC. Ces neurones cholinergiques fournissent une rétroaction efferent à la cochlée en modulant l’activité des cellules ciliées externes (OHCs)16,17,18,19,20. Des études antérieures ont montré que cette modulation joue un rôle dans le contrôle de la cochlée21,22,23,24,25,26 etla protection contre les traumatismesacoustiques 27,28,29,30,31,32,33. Chez la souris, les neurones MOC sont diffusement situés dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) dans le tronc cérébral auditif1. Notre groupe a utilisé la ligne de souris ChAT-IRES-Cre croisée avec la ligne de souris tdTomato reporter pour cibler les neurones MOC dans les tranches de tronc cérébral sous l’illumination épifluorescente. Nous avons montré que les neurones MOC reçoivent l’entrée inhibitrice afferent du noyau médial ipsilateral du corps trapézoïde (MNTB), qui est excité, à son tour, par les axones des cellules touffue globulaires (GBC) dans le noyau cochléaire contralatéral (CN)34,35,36,37,38. En outre, les neurones MOC reçoivent probablement leur apport excitateur des cellules T-stellate dans le CN contralatéral39,40,41. Pris ensemble, ces études montrent que les neurones MOC reçoivent à la fois des intrants excitatifs et inhibiteurs dérivés de la même oreille (contralatérale). Cependant, les neurones présynaptiques, et leurs axones convergeant vers les neurones MOC, ne sont pas assez proches les uns des autres pour être entièrement intacts dans une préparation typique de tranche coronale. Pour étudier comment l’intégration des intrants synaptiques aux neurones MOC affecte leurs modèles de tir potentiels d’action, en nous concentrant sur l’inhibition nouvellement décrite, nous avons développé une préparation dans laquelle nous pourrions stimuler les divers afferents aux neurones MOC d’une oreille de la manière la plus physiologiquement réaliste possible, mais avec les avantages techniques des expériences in vitro de tranches cérébrales.

La tranche compensée est une tranche épaisse modifiée conçue pour l’étude de l’intégration des circuits dans les neurones MOC (schématisé dans la figure 1A). Sur le côté épais de la tranche, le coin contient les axones sectionnés du nerf auditif (appelé « racine de nerf auditif » ci-après) lorsqu’ils pénètrent dans le tronc cérébral à partir de la périphérie et de la synapse du CN. La racine auditive de nerf peut être électriquement stimulée pour évoquer la libération de neurotransmetteur et l’activation synaptique des cellules du CN entièrement intact42,43,44,45,46. Ce format de stimulation a plusieurs avantages pour l’analyse de circuit. Tout d’abord, au lieu de stimuler directement les axones T-stellate et GBC qui fournissent une entrée afferent aux neurones MOC, nous stimulons l’AN pour permettre l’activation des circuits intrinsèques abondants dans le CN. Ces circuits modulent la production de neurones CN à leurs cibles dans tout le cerveau, y compris les neurones MOC46,47,48,49,50,51. Deuxièmement, l’activation polysynaptique des circuits afferents de l’AN à travers le CN en amont des neurones MOC permet un timing d’activation plus naturel et pour la plasticité de se produire à ces synapses comme ils le feraient in vivo pendant la stimulation auditive. Troisièmement, nous pouvons varier nos modèles de stimulation pour imiter une activité. Enfin, les projections monaurales excitatrices et inhibitrices des neurones MOC sont intactes dans la tranche compensée, et leur intégration peut être mesurée à un neurone MOC avec la précision de l’électrophysiologie patch-clamp. Dans l’ensemble, ce système d’activation fournit un circuit plus intact aux neurones MOC par rapport à une préparation typique des tranches de cerveau. Cette tranche de coin de tronc cérébral peut également être employée pour étudier d’autres secteurs auditifs qui reçoivent l’entrée inhibitrice du MNTB ipsilateral comprenant l’olive supérieure latérale, le noyau olivary supérieur et l’olive supérieure médiale10,11,52,53,54,55,56. Au-delà de notre préparation spécifique, cette méthode de tranchage peut être utilisée ou modifiée pour évaluer d’autres systèmes avec les avantages de maintenir la connectivité des entrées à longue portée et d’améliorer la visualisation des neurones pour une variété d’électrophysiologie à résolution unicellique ou de techniques d’imagerie.

Ce protocole nécessite l’utilisation d’un stade ou d’une plate-forme vibratoire qui peut être incliné d’environ 15°. Ici, nous utilisons une scène magnétique de 2 pièces disponible dans le commerce où la « scène » est un disque métallique avec un fond incurvé placé dans une concave magnétique « base de scène. » La scène peut ensuite être déplacée pour ajuster l’angle de la tranche. Des cercles concentriques sur la base de scène sont utilisés pour estimer l’angle reproductiblement. La scène et la base de la scène sont placées dans la chambre de tranchage, où la base de scène magnétique peut également être tournée.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Préparations expérimentales

REMARQUE : Les détails concernant la préparation des tranches, y compris la solution de tranchage, la température de tranchage, la température d’incubation des tranches et l’appareil (etc.), sont spécifiques à la préparation du tronc cérébral effectuée dans le but d’effectuer cette expérience. Les détails de l’incubation des tranches peuvent être modifiés par expérience de laboratoire.

  1. Préparez des solutions internes pour le serrage des correctifs.
    1. Préparer la solution de pince de tension contenant (en mM) 76 Cs-méthanesulfonate, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 QX-314, et 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Réglez le pH à 7,2 avec CsOH.
    2. Préparer la solution de pince actuelle contenant (en mM) 125 K-gluconate, 5 KCl, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine, et 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Réglez le pH à 7,2 avec KOH.
  2. Préparer 100 mL d’agar de 4 % en ajoutant 4 g d’agar à 100 mL d’eau chaude (presque bouillante). Déposer sur une plaque chauffante pour maintenir la température et remuer jusqu’à dissolution complète. Verser dans des boîtes de Pétri en plastique de 100 mm à environ 1 cm de profondeur et laisser refroidir. Réfrigérer jusqu’au besoin.
  3. Préparez 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant du mM : 124 NaCl, 1,2 CaCl2, 1,3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1,25 KH2PO4et 10 dextrose. Bulle avec carbogen (5% CO2 / 95% O2) pendant au moins 10 min, puis ajuster le pH final à 7,4 avec 1 M NaOH si nécessaire. Maintenir l’oxygénation et le pH de la solution en bouillonnant continuellement avec le carbogen tout au long de l’expérience.
  4. Préparer la solution de tranchage de 200 mL en ajoutant 1 mM d’acide kynurnique à l’ACSF. Solution sonicate dans un bain d’eau sonicating pendant 10 min jusqu’à ce que l’acide kynurnique soit dissous. Bouillonner continuellement avec du carbogen et le placer sur la glace.
    ATTENTION : Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de l’acide kynurnique.
  5. Montez une lame appropriée dans le vibratome suivant les instructions du fabricant. Réfrigérer la chambre de tranchage vibratome en l’entourant de glace.

2. Ablation du cerveau avec racine de nerf auditif intacte pour la stimulation

REMARQUE : Des souris pour ces expériences ont été obtenues en croisant des souris transgéniques ChAT-IRES-Cre sur un fond de C57BL/6J avec des souris de journaliste de tdTomato (Ai14). Les souris utilisées pour l’histologie et l’électrophysiologie étaient début post-audition (P14-P23), qui est autour de P12 chez la souris. Les neurones exprimant tdTomato dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) ont été précédemment caractérisés comme neurones MOC dans cette ligne de souris57.

  1. Euthanasier (p. ex., asphyxie au CO2) et décapiter l’animal à l’aide de procédures institutionnelles approuvées.
  2. À l’aide d’une lame de rasoir, couper la peau au milieu du crâne du nez à l’arrière du cou. Peler la peau arrière pour exposer le crâne.
  3. À l’aide de petits ciseaux, faire une incision dans le crâne à travers la ligne médiane à partir de la base (extrémité caudale près de la moelle épinière) du crâne et en continuant vers le nez.
  4. À la suture lambda, faire des coupures dans le crâne de la ligne médiane, latérale vers l’oreille des deux côtés. Peler le crâne pour exposer le cerveau.
  5. À partir de l’extrémité rostrale, soulevez doucement le cerveau loin du crâne à l’aide d’une petite spatule de laboratoire ou de forceps contondants. Coupez le nerf optique et continuez à travailler doucement le cerveau vers l’arrière, exposant la surface ventrale.
  6. Coupez les nerfs trigeminaux en les pinçant avec de fines forceps près de la surface ventrale du tronc cérébral.
    REMARQUE : Faites ceci soigneusement pendant que le nerf vestibulocochlear se trouve juste en dessous de ceci et doit être intact pour la stimulation éventuelle.
  7. Placer la préparation dans une boîte de Pétri en verre remplie de solution de tranchage froid. Placer le plat sous un microscope disséquant. Bouillonner délicatement de carbogen.
  8. Coupez le nerf facial près du tronc cérébral et exposez le nerf vestibulocochlear.
  9. À l’aide de forceps fins, poussez les pointes dans le foramina où le nerf vestibulocochlear sort du crâne autant que possible et pincez le nerf pour le couper, laissant la racine nerveuse attachée au tronc cérébral. Répétez ceci de l’autre côté.
  10. Une fois que les deux racines nerveuses sont libres, retirez les méninges et la vascularisation de la surface ventrale du tronc cérébral près du corps trapézoïde.
  11. Libérez complètement le cerveau du crâne en pinçant les nerfs crâniens restants et le tissu conjonctif en prenant soin de préserver le reste de la moelle épinière si possible.

3. Bloquer et monter le cerveau sur scène (disque magnétique)

  1. Préparer la surface du cerveau à fixer au stade en bloquant le cerveau au niveau du chiasm optique.
    1. Avec la surface ventrale vers le haut, stabilisez le cerveau à l’aide d’un outil contondant pour immobiliser doucement la moelle épinière de sorte que le cerveau ne s’incline pas pendant l’étape suivante.
    2. Au niveau du chiasm optique, utilisez des forceps ouverts pour créer le plan pour bloquer le cerveau en insérant à travers le cerveau jusqu’au fond du plat. Insérez les forceps à un angle d’environ 20° de la verticale de sorte que les extrémités sortent de la surface dorsale du cerveau caudale au chiasm optique.
    3. Couper le long des forceps à l’aide de la lame de rasoir.
  2. Collez le cerveau à la surface de la scène.
    1. Préparer un petit bloc (~1 cm3) de4% d’agar pour soutenir le cerveau.
    2. Placez une petite goutte de colle sur la scène et étalez-la dans un rectangle afin que le cerveau et le bloc d’agar puissent être collés vers le bas.
    3. À l’aide de forceps, soulevez soigneusement le cerveau et tamponnez doucement l’excès de liquide à l’aide du bord d’une serviette en papier. Placez la surface bloquée sur la colle, la surface ventrale sera vers la lame pendant le tranchage.
    4. Poussez doucement le bloc d’agar contre la surface dorsale du cerveau pour le soutenir pendant le tranchage et pour assurer un bon positionnement cérébral (c.-à-d. angle).

4. Trancher le cerveau pour créer une tranche de coin

REMARQUE : Préparez une tranche de cerveau à l’aide d’un vibratome qui a la racine du nerf cochléaire sur le côté épais et les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) et le noyau médial du corps trapézoïde (MNTB) sur le côté mince.

  1. Placez le disque magnétique avec le cerveau attaché sur la base de scène et placez-le dans la chambre de tranchage avec la surface ventrale du cerveau orientée vers la lame.
  2. Remplissez la chambre d’une solution de tranchage glacé et d’une bulle de carbogen.
  3. Abaissez la lame dans la solution et coupez les tranches caudales à la région d’intérêt pour vous assurer que les tranches sont symétriques. Si les tranches semblent asymétriques, inclinez légèrement le stade pour obtenir une symétrie.
    REMARQUE : Les vitesses des pales entre 0,05 et 0,10 mm/s étaient efficaces pour couper des tranches saines et peuvent varier selon l’âge des animaux et la région du cerveau.
  4. Une fois que les tranches sont symétriques, déplacez la scène ~15° (correspondant à environ 3 anneaux concentriques sur la base de la scène) d’un côté.
    REMARQUE : Éloignez la scène de la racine nerveuse auditive que vous souhaitez conserver dans la tranche.
  5. Continuer à trancher soigneusement jusqu’à ce que la racine nerveuse auditive soit proche de la surface d’un côté, et que le nerf facial puisse être vu à la surface de l’autre côté.
  6. Déplacez la scène vers 15° vers la position d’origine.
  7. Éloignez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène à 90° de sorte que le bord latéral du côté mince soit orienté vers la lame. Abaissez la lame de plusieurs centaines de microns, puis amenez lentement la lame près du bord du tissu. Répétez cette répétition jusqu’à ce que la lame touche le bord latéral. Abaissez la lame à l’épaisseur désirée du bord mince de la tranche, ici deux cents microns supplémentaires.
    REMARQUE : La tranche résultante est idéalement ~300 mm d’épaisseur au niveau du noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) sur le côté où le serrage de correction aura lieu.
  8. Éloignez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène vers l’arrière de sorte que la surface ventrale lui soit face.
  9. Faire la coupe qui désigne la surface rostrale de la tranche compensée. Transférer la tranche sur un morceau de papier d’interface (1 cm2)surface caudale vers le bas. Déplacez la tranche dans la chambre d’incubation ou tout autre appareil d’incubation approprié pour la récupération (30 min à 35 °C).
    REMARQUE : Le nerf facial doit être visible sur les deux hémisphères de la tranche à la surface du rostral (voir la figure 1B).

5. Mise en place et enregistrement d’électrophysiologie

  1. Placer la tranche compensée dans la chambre d’enregistrement et fixer la tranche à l’aide d’une harpe ou d’un système stabilisateur. Imprèdre le tissu en continu à une vitesse de 7-10 mL/min avec chaud (35 °C) ACSF bouillonné avec du carbogen.
  2. Identifier les neurones MOC génétiquement étiquetés dans le VNTB à l’aide de l’épifluorescence avec des filtres d’émission de 561 nm pour les enregistrements patch-clamp. Retourner la tranche s’il n’y a pas de cellules potentiellement patchables.
  3. À l’aide de l’optique DIC, concentrez-vous sur la racine nerveuse auditive sur le côté épais de la tranche et utilisez un micromanipulateur pour déplacer l’électrode bipolaire stimulant le tungstène jusqu’à la racine nerveuse auditive et doucement à la surface du tissu.
    REMARQUE : Des électrodes d’aspiration ont été employées dans des expériences auditives de stimulation de nerf dans d’autres laboratoires. Les électrodes en verre theta, ou méthodes de stimulation optique peuvent être utilisées si applicable à d’autres préparations spécifiques.
  4. Déplacez le champ de vision vers le VNTB pour choisir un neurone MOC à cibler pour l’électrophysiologie de pince de correction.
  5. Remplissez une pipette d’enregistrement avec une solution interne appropriée pour l’expérience proposée.
  6. Patch et enregistrer à partir du neurone MOC dans la configuration de l’ensemble des cellules. Compenser la capacité membranaire et la résistance aux séries si nécessaire.
  7. Ajustez l’amplitude électrique de stimulation de la racine auditive de nerf pour obtenir des événements postsynaptiques cohérents dans le neurone de MOC.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire de déplacer l’électrode de stimulation.
  8. Exécutez des protocoles de stimulation appropriés pour observer les courants synaptiques évoqués dans le MOC (pince de tension) ou les modèles potentiels d’action (pince actuelle).
    REMARQUE : La préparation des tranches compensées peut être utilisée avec tous les outils typiques de pince à timbres tels que les enregistrements de patchs en vrac, la pharmacologie, l’optogénétique, l’imagerie calcique, le déballage du neurotransmetteur, etc.

6. Confirmation histologique des noyaux de tronc cérébral

REMARQUE : Ceci est fait avec la coloration violette crésyle, dans la tranche fixe et re-sectionnée de coin. Cette méthode permet de visualiser les noyaux contenus dans la tranche.

  1. Après avoir préparé une tranche de quartier, submerger la tranche dans fixatif (4% de PFA en PBS) pendant la nuit. Rincer la tranche 3x pendant 10 min en PBS (température ambiante sur un shaker), puis placer dans 30% saccharose en PBS pendant la nuit à 4 °C pour cryoprotect.
  2. Re-sectionner la tranche sur une microtome congélation (40-70 mm) et recueillir des sections en série dans une plaque de puits 24 en PBS.
  3. Monter les sections sur les glissières enduites de gélatine et laisser sécher complètement. Placez les glissières dans le chariot à glissières.
  4. Préparer des solutions de violette cresyl
    1. Préparer 1% d’acétate de violette crésyle en mélangeant 5 g d’acétate de violette crésyle dans 500 mL dH2O
    2. Préparer le tampon d’acétate en préparant d’abord la solution A de 90 mL (acide acétique glaciaire de 540 mL + 89,46 mL dH2O) et la solution B de 10 mL (acétate de sodium de 10 mL dH2O). Combinez la solution A et la solution B donnant le tampon d’acétate.
    3. Mélanger 1% d’acétate de violette crésyle avec le tampon d’acétate 1:1 pour 0,5% de violette crésyle dans un tampon d’acétate. Filtrer avant utilisation.
    4. Préparer 95 % et 70 % d’éthanol en diluant 100 % d’éthanol avec des volumes appropriés de dH2O
  5. Effectuez le protocole de coloration de violette cresyl. Déplacez le chariot de glissière à travers les plateaux de solution, buvard solution excédentaire sur une serviette en papier entre les plateaux: xylène - 5 min; 95% d’éthanol – 3 min; 70% d’éthanol – 3 min; dH2O - 3 min; Solution violette cresyl de 0,5 % – surveillance de 8 à 14 min fréquemment jusqu’à ce que la coloration nucléaire devienne pourpre foncé; dH2O - 3 min; 70% d’éthanol – 3 min; 95% d’éthanol – 1-2 min; 100 % éthanol – la trempette glisse deux fois; xylène – 5 min; xylène : 25 min jusqu’à ce que le montage soit effectué.
    AVERTISSEMENT : N’utilisez des xylènes que sous un capot de fumée.
  6. Retirez les glissières du xylène une à la fois et placez immédiatement les glissements de couverture sur les glissières à l’aide d’un support de montage. Laisser sécher le milieu de montage (toute la nuit).
  7. Sections d’image.

7. Étiquetage de biocytine pour le traçage antét dégrade des axones dans le tissu vivant et nonfixé

  1. Préparer une tranche de quartier comme ci-dessus (étapes 2-4).
  2. Transférer la tranche sur du papier d’interface (~1 cm2). Sous un microscope disséquant, localiser le CN sur le côté épais de la tranche.
  3. Retirez soigneusement l’excès d’ACSF de la zone entourant la tranche en tordant un coin d’un papier de soie pour éloigner l’ACSF du tissu. Cela empêche la biocytine de se propager aux zones environnantes de la tranche, ce qui pourrait mener à l’absorption dans les cellules à l’extérieur du CN.
  4. Avec des forceps fins, choisissez un petit cristal de biocytine et placez-le à la surface du CN. Pressez doucement le cristal dans le tissu pour favoriser le contact avec les neurones et l’absorption subséquente dans le somata. Répétez cette étape pour couvrir la région d’intérêt désirée, dans ce cas les régions du CN contenant des neurones T-stellate et GBC.
  5. Placer la tranche dans une chambre d’incubation. Laisser la tranche couver pendant 2-4 h à 35 °C pour permettre l’absorption et le transport de la biocytine. Après l’incubation, rincer la tranche dans l’ACSF pour éliminer les particules de biocytine.
  6. Placer la tranche dans le fixatif (4% de PFA dans PBS) pendant la nuit. Rincer 3x pendant 10 min en PBS.
  7. Tranche cryoprotect en saccharose à 30% en PBS pendant la nuit à 4 °C ou jusqu’à ce que la tranche coule.
  8. Resect le tissu pour produire des sections transversales sur une microtome congélation à 70-100 mm.
  9. Traiter le tissu à l’aide de méthodes immunohistochimiques standard avec une streptavidine conjuguée fluorescente.
    REMARQUE : Une immunohistochimie supplémentaire peut être effectuée sur les sections si elle est utile pour étiqueter les corps cellulaires présynaptiques, les axones, les récepteurs ou d’autres molécules synaptiques importantes pour la visualisation des circuits (c.-à-d. que les étapes primaires des anticorps ne devraient pas nuire à la visualisation secondaire de la biocytine).
  10. Imagez le tissu.

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Résultats

Examen histologique de la tranche de coin
Pour notre étude de la fonction auditive des neurones du tronc cérébral, la préparation de la tranche compensée a été conçue pour contenir la racine nerveuse auditive et le CN contralatéral aux neurones MOC ciblés pour les enregistrements (tranche d’exemple indiquée à la figure 1B). L’examen histologique initial de la préparation est important pour confirmer que la tranche contient les noyaux nécessaires à l’a...

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Discussion

La procédure de tranchage décrite ici appelée tranche compensée est puissante pour maintenir des circuits neuronaux présynaptiques intacts, mais avec l’accessibilité de l’expérimentation de tranche de cerveau pour l’analyse de la fonction neuronale. Un grand soin doit être pris en plusieurs étapes initiales afin de maximiser l’utilité de la préparation à l’analyse du circuit. Les dimensions du coin doivent être confirmées à l’aide de l’examen histologique, qui fait partie intégrante de la co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

Références

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