JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Интеграция различных синаптических входов в нейроны лучше всего измеряется в препарате, который сохраняет все до синаптические ядра для естественного времени и пластичности цепи, но ломтики мозга обычно разрывают многие соединения. Мы разработали модифицированный срез мозга, чтобы имитировать активность цепи in vivo, сохраняя при этом возможности экспериментов в пробирке.

Аннотация

Электрофизиологические методы in vitro измеряют одноклеточную активность с точным электрическим и временным разрешением. Мозг ломтики должны быть относительно тонкими, чтобы правильно визуализировать и доступ к нейронам для патч-зажима или изображения, и в пробирке изучение схемы мозга ограничивается только то, что физически присутствует в острой ломтик. Чтобы сохранить преимущества экспериментов в пробирке, сохраняя при этом большую часть пресинаптических ядер, мы разработали новую подготовку ломтика. Этот "клин ломтик" был разработан для патч-зажим электрофизиологии записей для характеристики различных монауральных, звуковых входов в медиальной olivocochlear (MOC) нейронов в стволе мозга. Эти нейроны получают свои первичные возбудительные и ингибирующие входы от нейронов, активированных стимулами в контралатеральной уха и соответствующего кохлеарного ядра (CN). Был разработан асимметричный кусочек мозга, который является самым толстым в ростро-каудальном домене на боковом краю одного полушария, а затем истончается к боковому краю противоположного полушария. Этот ломтик содержит, на толстой стороне, корень слухового нерва, передающий информацию о слуховых стимулах к мозгу, внутренней схеме CN, и как дисинаптическом возбуждающих и трисинаптических ингибирующие афферентные пути, которые сходятся на контралатеральных нейронов MOC. Запись выполняется из нейронов MOC на тонкой стороне ломтика, где они визуализированы с помощью оптики DIC для типичных экспериментов патч-зажим. Прямая стимуляция слухового нерва осуществляется при входе в слуховой ствол мозга, что позволяет внутренней активности цепи CN и синаптической пластичности происходит в синапсах вверх по течению нейронов MOC. С помощью этого метода можно имитировать активацию цепи in vivo как можно ближе в пределах среза. Этот клин срез подготовки применима к другим схемам мозга, где схема анализы выиграют от сохранения подключения вверх по течению и дальнего ввода, в сочетании с техническими преимуществами физиологии в пробирке ломтик.

Введение

Наблюдение за активностью нейронных цепей идеально выполняется с помощью местных сенсорных входов и обратной связи, а также нетронутой связи между областями мозга, in vivo. Тем не менее, выполнение экспериментов, которые дают одноклеточное разрешение функции нейронной цепи по-прежнему ограничивается техническими проблемами в нетронутом мозге. В то время как экстрацеллюлярная электрофизиология in vivo или многофотонные методы визуализации могут быть использованы для исследования активности в нетронутой нервной системе, интерпретация того, как различные входные данные интегрируются или измеряют синаптические входы подразводки, остается трудной. In vivo цельноклеточные записи преодолевают эти ограничения, но являются сложными для выполнения, даже в областях мозга, которые легко доступны. Технические проблемы одноклеточного разрешения экспериментов еще более усиливаются в определенных популяциях нейронов, которые расположены глубоко в головном мозге, или в пространственно диффузных популяциях, которые требуют либо генетических инструментов для обнаружения клеток in vivo (например, генетическое выражение channelrhodopsin в паре с optrode записи) или пост-специальной гистохимической идентификации после записи сайта маркировки (например, с нейротрансмиссии конкретных маркеров). Находясь диффузно вблизи брюшной поверхности ствола мозга, медиальные оливокохлеарные (MOC) нейроны страдают отвышеуказанных ограничений 1, что делает их чрезвычайно трудно получить доступ для in vivo экспериментов.

Мозг ломтики (толщиной 100-500 мкм) уже давно используются для изучения схем мозга, в том числе слуховой ствол мозга схемы, из-за физической сегрегации подключенных нейронов, которые содержатсяв том же ломтик 2,3,4,5,6,7,8,9. Эксперименты с использованием гораздо толще ломтиками (Nogt;1 мм) были использованы в других лабораториях, чтобыпонять,как двусторонние входы интегрировать в областях высшего оливариального комплекса (SOC), включая медиальный превосходныйоливковый 10,11. Эти ломтики были подготовлены таким образом, что аксоны слухового нерва (АН) остались нетронутыми в ломтик и были электрически стимулировали инициировать синаптический нейромедиатор релиз в CN, имитируя активность первого порядка слуховых нейронов, как они будут реагировать на звук. Одним из основных недостатков этих толстых ломтиков является видимость нейронов для патч-зажим электрофизиологических записей ("патч"). Патчирование становится все болеетрудным,как многочисленные аксоны в этой области становятся myelinatedс возрастом 12,13,14,15, что делает ткань оптически плотной и заслоняющих нейронов даже в типичный, тонкий срез мозга. Наша цель состоит в том, чтобы создать в пробирке препараты, которые больше напоминают цепи подключения in vivo записей, но с высокой пропускной способностью и высоким разрешением записи способности визуально управляемых патч-зажим электрофизиологии в мозге ломтиками.

Наша лаборатория исследует физиологию нейронов слуховой эфферентной системы, включая нейроны MOC. Эти холинергические нейроны обеспечивают эфферентную обратную связь с улиткой, модулируя активность наружных волосковых клеток (OHCs)16,17,18,19,20. Предыдущие исследования показали, что эта модуляция играет определенную роль вусилении контроля в улитке 21,22,23,24,25,26 изащитеот акустической травмы 27,28,29,30,31,32,33. У мышей, MOC нейроны диффузно расположены в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) в слуховой стволмозга 1. Наша группа использовала chAT-IRES-Cre мыши линии пересекли с tdTomato репортер мыши линии для целевой MOC нейронов в ствол мозга ломтиками под эпифлуоресцентным освещением. Мы показали, что нейроны MOC получают афферентный ингибильный вход от ипсилатерального медиального ядра трапециевидного тела (MNTB), который возбуждается, в свою очередь, аксонами из шаровых густых клеток (GBC) в контралатерального кохлеарного ядра (CN)34,35,36,37,38. Кроме того, нейроны MOC, вероятно, получают их возбудительный вход от Т-стеллат клеток в контралатеральной CN39,40,41. Взятые вместе, эти исследования показывают, MOC нейроны получают как возбуждательные и ингибирующие входы, полученные из того же (контралатерального) уха. Тем не менее, пресинаптические нейроны, и их аксоны сходятся на нейронах MOC, не совсем достаточно близко друг к другу, чтобы быть полностью нетронутыми в типичной подготовки корональной ломтик. Чтобы исследовать, как интеграция синаптических входов в нейроны MOC влияет на их действия потенциальных моделей стрельбы, с акцентом на недавно описанные ингибирования, мы разработали препарат, в котором мы могли бы стимулировать различные афференты MOC нейронов из одного уха в наиболее физиологически реалистичным способом возможно, но с техническими преимуществами in vitro мозга ломтик экспериментов.

Срез клина является модифицированным толстым ломтиком подготовки, предназначенной для исследования цепи интеграции в нейронах MOC (схематизирована на рисунке 1A). На толстой стороне ломтика, клин содержит отрубленные аксоны слухового нерва (так называют "корень слухового нерва" в дальнейшем), как они входят в ствол мозга с периферии и синапса в CN. Корень слухового нерва можно электрически стимулировать, чтобы вызвать высвобождение нейромедиатора и синаптической активации клеток полностью нетронутыми CN42,43,44,45,46. Этот формат стимуляции имеет ряд преимуществ для анализа схемы. Во-первых, вместо того, чтобы непосредственно стимулировать T-stellate и GBC аксоны, которые обеспечивают афферентный вход в нейроны MOC, мы стимулируем AN, чтобы позволить активацию внутренних цепей, обильных в CN. Эти схемы модулировать выход нейронов CN к своим целям по всему мозгу, в том числе MOCнейронов 46,47,48,49,50,51. Во-вторых, полисинаптическая активация афферентных цепей от AN через CN вверх по течению нейронов MOC позволяет более естественное время активации и для пластичности происходить на этих синапсах по мере того как они in vivo во время слуховой стимуляции. В-третьих, мы можем изменять наши модели стимуляции, чтобы имитировать активность АН. Наконец, как возбуждательные, так и ингибирующие монауральные проекции на нейроны MOC не повреждены в срезе клина, и их интеграция может быть измерена в нейроне MOC с точностью электрофизиологии патч-зажима. В целом, эта схема активации обеспечивает более нетронутой цепи нейронов MOC по сравнению с типичной подготовки ломтик мозга. Этот срез клина ствола мозга также может быть использован для исследования других слуховыхобластей,которые получают ингибирующие входы от ипсилатерального MNTB, включая боковое превосходное оливковое, превосходное оливариальное ядро и медиальное превосходноеоливковое 10,11,52,53,54,55,56. Помимо нашей конкретной подготовки, этот метод нарезки может быть использован или изменен для оценки других систем с преимуществами поддержания подключения дальнего ввода и улучшения визуализации нейронов для различных одноклеточного разрешения электрофизиологии или методов визуализации.

Этот протокол требует использования вибромной сцены или платформы, которые могут быть наклонены примерно на 15 градусов. Здесь мы используем коммерчески доступные 2-кусок магнитной стадии, где "этап" является металлический диск с изогнутым дном помещены в вогнутой магнитной "стадии базы". Этап может быть сдвинут для регулировки угла разреза. Концентрические круги на сценической базе используются для оценки угла воспроизведения. Этапная и сценическая основа помещаются в камеру нарезки, где также может вращаться основание магнитной сцены.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта / Национальный институт по глухоте и другим коммуникационным расстройствам ухода за животными и использования комитета.

1. Экспериментальные препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о подготовке ломтика, включая нарезку раствора, температуру нарезки, температуру инкубации ломтика и аппарат (и т.д.), специфичны для подготовки ствола мозга, выполненной в этом эксперименте. Детали инкубации ломтиков могут быть изменены в ходе лабораторных исследований.

  1. Подготовь внутренние решения для зажима патчей.
    1. Подготовка раствора зажима напряжения, содержащего (в mM) 76 Cs-метансульфонат, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-фосфокреатин, 5 х-314, и 0,01 Alexa Fluor-488 гидразида. Отрегулируйте pH до 7.2 с CsOH.
    2. Подготовка текущего раствора зажима, содержащего (в mM) 125 K-глюконат, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine, и 0.01 Alexa Fluor-488 гидразида. Отрегулируйте рН до 7,2 с KOH.
  2. Приготовьте 100 мл 4% агара, добавив 4 г агара в горячую (около кипения) воду 100 мл. Поместите на нагретую тарелку для поддержания температуры и перемешайте до полного растворения. Налейте в 100 мм пластиковые чашки Петри примерно на 1 см глубины и дайте остыть. Охладить до необходимости.
  3. Подготовка 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащейся в mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, и 10 декстрозы. Пузырь с карбогеном (5% CO2 / 95% O2) по крайней мере 10 мин, а затем настроить окончательный рН до 7,4 с 1 М NaOH, если это необходимо. Поддерживайте оксигенацию и рН раствора, постоянно пузырись карбогеном на протяжении всего эксперимента.
  4. Приготовьте раствор нарезки 200 мл, добавив 1 мМ кинуреновую кислоту в ACSF. Раствор Sonicate в звуковой водяной бане в течение 10 мин, пока кинуреновая кислота не растворяется. Непрерывно пузыриться карбогеном и высовывьте на лед.
    ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующее средства индивидуальной защиты при обращении с кинуреновой кислотой.
  5. Намонтировать соответствующее лезвие в виброме в соответствии с инструкциями производителя. Охладите вибромную нарезку камеры, окружив ее льдом.

2. Удаление мозга с нетронутыми слуховой нервный корень для стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши для этих экспериментов были получены путем пересечения ChAT-IRES-Cre трансгенных мышей на фоне C57BL/6J с tdTomato репортер мышей (Ai14). Мыши, используемые для гистологии и электрофизиологии, были послесвешательным началом (P14-P23), который составляет около P12 у мышей. Нейроны, выражаюющие tdTomato в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) ранее были охарактеризованы как нейроны MOC в этойлинии мыши 57.

  1. Euthanize (например, удушье CO2) и обезглавить животное с помощью утвержденных институциональных процедур.
  2. Используя лезвие бритвы, вырезать кожу в средней линии черепа от носа до задней части шеи. Очистите кожу спины, чтобы разоблачить череп.
  3. Используя маленькие ножницы, сделайте разрез в черепе через середину, начиная с основания (хвостовой конец возле спинного мозга) черепа и продолжая к носу.
  4. На шве лямбды, сделать порезы в черепе от средней линии, боковой к уху с обеих сторон. Очистите череп, чтобы разоблачить мозг.
  5. Начиная с рострального конца, аккуратно поднимите мозг от черепа с помощью небольшого лабораторного шпателя или тупых типсов. Вырезать зрительный нерв и продолжать мягко работать мозг назад, подвергая брюшной поверхности.
  6. Вырезать тригеминальные нервы, ущипнув их с тонкой щипся вблизи брюшной поверхности ствола мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте это тщательно, как вестибюльно-охлеарный нерв лежит чуть ниже этого и должен быть нетронутым для возможной стимуляции.
  7. Поместите препарат в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным нарезаным раствором. Поместите блюдо под рассечение микроскопа. Аккуратно пузырь с карбогеном.
  8. Обрезать лицевой нерв близко к стволу мозга и подвергать вестибюльно-скелетного нерва.
  9. Используя тонкие щипцы, нажмите кончики в foramina, где вестибюльно-бликохлеарный нерв выходит из черепа, насколько это возможно, и ущипнуть нерв, чтобы разорвать его, оставляя нервный корень прилагается к стволу мозга. Повторите это на другой стороне.
  10. После того, как оба нервных корня свободны, удалить оверинги и сосуды с брюшной поверхности ствола мозга вблизи трапециевидного тела.
  11. Освободите мозг полностью от черепа, ущипнув оставшиеся черепные нервы и соединительной ткани, заботясь, чтобы сохранить оставшийся спинной мозг, если это возможно.

3. Блок и монтировать мозг на сцене (магнитный диск)

  1. Подготовьте поверхность мозга, чтобы исправить на сцену, блокируя мозг на уровне оптического чиазма.
    1. С брюшной поверхности вверх, стабилизировать мозг с помощью тупого инструмента, чтобы мягко обездвижить спинной мозг так, что мозг не наклоняется в течение следующего шага.
    2. На уровне оптического чиазма, использовать открытые миппы для создания плоскости для блокирования мозга, вставив через мозг вниз к нижней части блюда. Вставьте типсы под углом около 20 градусов от вертикального, так что кончики выйти спинной поверхности мозга caudal к оптической чиазмы.
    3. Вырезать вдоль типсов с помощью лезвия бритвы.
  2. Приклейте мозг к поверхности сцены.
    1. Приготовьте небольшой блок (1 см3) 4% агара для поддержки мозга.
    2. Поместите небольшую каплю клея на сцену и распределите его в прямоугольник, чтобы мозг и агар блок могут быть приклеены вниз.
    3. Используя миппы, осторожно поднимите мозг и аккуратно мазите лишнюю жидкость, используя край бумажного полотенца. Поместите заблокированную поверхность на клей, вентрал поверхности будет к лезвию во время нарезки.
    4. Нажмите агар блок осторожно против спинной поверхности мозга, чтобы поддержать его во время нарезки и обеспечить надлежащее позиционирование мозга (т.е. угол).

4. Нарежьте мозг, чтобы создать клин ломтик

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте ломтик мозга с помощью вибромы, которая имеет корень кохлеарного нерва на толстой стороне и медиальной оливокохлеарных (MOC) нейронов и медиальное ядро трапециевидного тела (MNTB) на тонкой стороне.

  1. Поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на сценическое основание и поместите его в камеру нарезки с брюшной поверхностью мозга, ориентированной на лезвие.
  2. Заполните камеру раствором ледяной нарезки и пузырь карбогеном.
  3. Опустите лезвие в раствор и вырезать ломтики caudal в область интереса, чтобы убедиться, что ломтики симметричны. Если срезы кажутся асимметричными, слегка наклоните сцену, чтобы получить симметрию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость лезвия между 0.05-0.10 мм/с были эффективны для резки здоровых ломтиков и может варьироваться в зависимости от возраста животных и области мозга.
  4. После того, как ломтики симметричны, переложите этап на 15 градусов (соответствующий примерно 3 концентрическим кольцам на сцене) в одну сторону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сдвиг этапе от слухового корня нерва, что вы хотите сохранить в ломтик.
  5. Продолжить нарезки тщательно, пока слуховой нервный корень близко к поверхности с одной стороны, и лицевой нерв можно увидеть на поверхности другой стороны.
  6. Сдвиг этапе обратно 15 "в исходное положение.
  7. Перемести лезвие от ткани и закрути основание сцены на 90 градусов, чтобы боковой край тонкой стороны обращен к лезвию. Опустите лезвие на несколько сотен микрон, а затем медленно принесите лезвие близко к краю ткани. Повторяйте это до тех пор, пока лезвие не коснется бокового края. Опустите лезвие до нужной толщины тонкого края ломтика, здесь еще двести микрон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный срез идеально толщиной 300 мм на уровне брюшного ядра трапециевидного тела (VNTB) на стороне, где патч зажима будет иметь место.
  8. Перемести лезвие обратно от ткани и спина стадии базы назад так, что брюшной поверхности сталкивается с ним.
  9. Сделайте разрез, который обозначает ростральной поверхности клина ломтик. Перенесите срез на кусок интерфейсной бумаги (1см 2)хвостовой поверхности вниз. Переместите срез в инкубационую камеру или другой подходящий инкубационный аппарат для восстановления (30 мин при 35 градусов по Цельсию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях ломтика на ростральной поверхности (см. Рисунок 1B).

5. Электрофизиологическая настройка и запись

  1. Поместите ломтик клина в камеру записи и закрепите ломтик арфой или стабилизирующей системой. Перелив ткани непрерывно со скоростью 7-10 мл/мин с теплым (35 градусов по Цельсию) ACSF пузырились карбогеном.
  2. Определите генетически помеченные нейроны MOC в VNTB с помощью эпифлюоресценции с 561 нм фильтров выбросов для записи патч-зажима. Переверните срез, если нет потенциально патчируемых ячеек.
  3. Используя оптику DIC, сосредоточьтесь на корень слухового нерва на толстой стороне ломтика и используйте микроманипулятор для перемещения биполярного вольфрама, стимулирующего электрод до корня слухового нерва и осторожно в поверхность ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всасывающие электроды были использованы в экспериментах по стимуляции слухового нерва в других лабораториях. Эти стеклянные электроды, или методы оптической стимуляции могут быть использованы, если это применимо к другим конкретным препаратам.
  4. Перемести поле зрения обратно в VNTB, чтобы выбрать нейрон MOC для целевой для электрофизиологии зажима патча.
  5. Заполните записывающую пипетут соответствующим внутренним решением для предлагаемого эксперимента.
  6. Патч и запись с нейрона MOC в конфигурации всей клетки. При необходимости компенсируют емкость мембраны и сопротивление сериям.
  7. Отрегулируйте амплитуду электрической стимуляции корня слухового нерва, чтобы получить последовательные постсинаптические события в нейроне MOC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть необходимо для перемещения стимула электрода.
  8. Вы запустите соответствующие протоколы стимуляции для наблюдения вызванных синаптических течений в MOC (зажим напряжения) или потенциальных моделей действия (текущий зажим).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат клина ломтик может быть использован с любыми типичными патч-зажим инструменты, такие как свободные записи патч, фармакология, оптогенетика, кальций изображений, нейромедиатор uncaging, и т.д.

6. Гистологическое подтверждение ядер ствола мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается с cresyl фиолетовый окрашивания, в фиксированной, повторно секционированы клин ломтик. Этот метод позволяет визуализировать ядра, которые содержатся в срезе.

  1. После подготовки клина ломтик, погрузить ломтик в фиксатор (4% PFA в PBS) на ночь. Промыть ломтик 3x в течение 10 мин в PBS (комнатная температура на шейкер), а затем поместить в 30% сахарозы в PBS ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, чтобы криопротектор.
  2. Повторно раздел ломтик на замораживание микротом (40-70 мм) и собирать серийные разделы в 24 хорошо пластины в PBS.
  3. Гора разделы на желатин покрытием слайды и дайте высохнуть полностью. Поместите слайды в слайд-карету.
  4. Подготовка кресиле фиолетовых решений
    1. Приготовьте 1% крезилового фиолетового ацетата, смешивая 5 г крезилового фиолетового ацетата в 500 мл dH2O
    2. Подготовьте буфер ацетата, сначала подготовив раствор А (540 мл ледниковой уксусной кислоты и 89,46 мл dH2O) и раствор 10 мл B (136 мг ацетата натрия в 10 мл dH2O). Объедините решение A и решение B, дать буфер ацетата.
    3. Комбинат 1% cresyl фиолетовый ацетат с буфером ацетата 1:1 для 0,5% cresyl фиолетовый в буфер ацетата. Фильтр перед использованием.
    4. Подготовка 95% и 70% этанола путем разбавления 100% этанола с соответствующими объемами dH2O
  5. Выполните протокол окрашивания кресилей. Перемещение слайд перевозки через раствор лотки, blotting избыток раствора на бумажное полотенце между лотки: ксилен - 5 мин; 95% этанола - 3 мин; 70% этанола - 3 мин; dH2O - 3 мин; 0,5% крезил фиолетовый раствор - 8-14 мин мониторинга часто, пока ядерное окрашивание становится темно-фиолетовый; dH2O - 3 мин; 70% этанола - 3 мин; 95% этанола - 1-2 мин; 100% этанол - падение слайды в два раза; ксилен - 5 мин; ксилен: 25 мин. до монтажа.
    ВНИМАНИЕ: Используйте ксилены только под капотом дыма.
  6. Удалите слайды из ксилена по одному и сразу же поместите крышку скользит на слайдах с помощью монтажной среды. Разрешить монтаж средних до сухих (на ночь).
  7. Разделы изображений.

7. Маркировка биоцитина для антероградного отслеживания аксонов в живой, нефиксированной ткани

  1. Подготовьте ломтик клина, как указано выше (Шаги 2-4).
  2. Перенесите срез в интерфейсную бумагу (1 см2). Под рассечением микроскопа, найти CN на толстой стороне ломтика.
  3. Тщательно удалите избыток ACSF из области, окружающей ломтик, скручивая угол бумаги ткани, чтобы привлечь ACSF от ткани. Это предотвращает распространение биоцитина на окружающие участки ломтика, что может привести к поглощению в клетки за пределами CN.
  4. С тонкой типсов, выберите небольшой кристалл биоцитина и поместите его на поверхность CN. Аккуратно нажмите кристалл в ткань, чтобы способствовать контакту с нейронами и последующего поглощения в сомата. Повторите этот шаг, чтобы покрыть желаемую область интереса, в данном случае CN регионов, содержащих T-stellate и GBC нейронов.
  5. Поместите кусочек в инкубационую камеру. Разрешить ломтик инкубировать в течение 2-4 ч при 35 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить поглощение и транспортировку биоцитина. После инкубации, промыть ломтик в ACSF, чтобы удалить любые частицы биоцитина.
  6. Поместите ломтик в фиксатор (4% PFA в PBS) на ночь. Промыть 3x в течение 10 мин в PBS.
  7. Cryoprotect ломтик в 30% сахарозы в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию или до тех пор, пока ломтик раковины.
  8. Переразделите ткань для получения поперечных секций на замерзающую микротому на 70-100 мм.
  9. Процесс ткани с использованием стандартных иммуноистохимических методов с флуоресцентно конъюгированных стрептавидин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная иммуногистохимия может быть выполнена на секциях, если полезно для маркировки пресинаптических клеток органов, аксонов, рецепторов или других синаптических молекул, важных для визуализации цепи (т.е. основные шаги антитела не должны негативно влиять на вторичную визуализацию биоцитина).
  10. Изображение ткани.

Результаты

Гистологическое исследование ломтика клина
Для нашего исследования слуховой функции нейрона ствола мозга, препарат ломтика клина был разработан, чтобы содержать корень слухового нерва и CN контралатеральных нейронов MOC, предназначенных для записи (пример ломтик показано

Обсуждение

Процедура нарезки, описанная здесь, называют ломтик клина является мощным для поддержания нетронутыми пресинаптических нейрональных схем, но с доступностью мозга ломтик экспериментов для анализа нейрональной функции. Необходимо принять меры в несколько первоначальных шагов, с тем ч?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIH, NIDCD, No01 DC000091 (CJCW).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

Ссылки

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406 (2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018 (2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688 (2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824 (2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены