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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

Zusammenfassung

In-vitro-Scheibenelektrophysiologie-Techniken messen die einzellige Aktivität mit präziser elektrischer und zeitlicher Auflösung. Gehirnscheiben müssen relativ dünn sein, um Neuronen für Patch-Clamping oder Bildgebung richtig zu visualisieren und zugreifen, und die In-vitro-Untersuchung der Gehirnschaltung ist auf das beschränkt, was physisch in der akuten Scheibe vorhanden ist. Um die Vorteile von In-vitro-Scheibenexperimenten bei gleichzeitiger Erhaltung eines größeren Anteils präsynaptischer Kerne zu erhalten, haben wir eine neuartige Scheibenzubereitung entwickelt. Diese "Keilscheibe" wurde für Patch-Clamp-Elektrophysiologie-Aufnahmen entwickelt, um die vielfältigen monauralen, schallgetriebenen Eingänge zu medialen Olivocochlearen (MOC)-Neuronen im Hirnstamm zu charakterisieren. Diese Neuronen erhalten ihre primären afferenten erregenden und hemmenden Eingänge von Neuronen, die durch Reize im kontralateralen Ohr und entsprechenden Cochlea-Kern (CN) aktiviert werden. Es wurde eine asymmetrische Hirnscheibe entwickelt, die am dicksten in der rostro-kaudalen Domäne am seitlichen Rand einer Hemisphäre ist und dann zum seitlichen Rand der gegenüberliegenden Hemisphäre dünnt. Diese Scheibe enthält auf der dicken Seite die auditive Nervenwurzel, die Informationen über auditive Reize an das Gehirn, die intrinsische CN-Schaltung und sowohl die disynaptischen exzitattischen als auch trisynaptischen hemmenden affetiveren Bahnen, die auf kontralateralen MOC-Neuronen konvergieren, transportiert. Die Aufnahme erfolgt von MOC-Neuronen auf der dünnen Seite der Scheibe, wo sie mit DIC-Optik für typische Patch-Clamp-Experimente visualisiert werden. Die direkte Stimulation des Hörnervs wird beim Eintritt in den auditiven Hirnstamm durchgeführt, wodurch die intrinsische CN-Kreisaktivität und die synaptische Plastizität an Synapsen vor den MOC-Neuronen auftreten können. Mit dieser Technik kann man die In-vivo-Schaltungsaktivierung so nah wie möglich innerhalb der Scheibe imitieren. Diese Keilscheibenpräparation ist auf andere Gehirnkreise anwendbar, bei denen Schaltungsanalysen von der Erhaltung der vorgelagerten Konnektivität und der langfristigen Eingänge in Kombination mit den technischen Vorteilen der In-vitro-Slice-Physiologie profitieren würden.

Einleitung

Die Beobachtung der Aktivität neuronaler Schaltkreise wird idealerweise mit nativen sensorischen Eingaben und Rückkopplungen sowie einer intakten Konnektivität zwischen Hirnregionen in vivo durchgeführt. Die Durchführung von Experimenten, die eine einzellige Auflösung der funktionalen Schaltkreise geben, ist jedoch immer noch durch technische Herausforderungen im intakten Gehirn begrenzt. Während in vivo extrazelluläre Elektrophysiologie oder Multiphotonen-Bildgebungsverfahren zur Untersuchung von Aktivitäten in intakten Nervensystemen eingesetzt werden können, bleibt die Interpretation, wie verschiedene Eingänge integrieren oder die subschwelligen synaptischen Eingänge zu messen, schwierig. In vivo Vollzellaufnahmen überwinden diese Einschränkungen, sind aber selbst in Leicht zugänglichen Hirnregionen anspruchsvoll. Technische Herausforderungen von Einzelzell-Auflösungsexperimenten werden in bestimmten Neuronenpopulationen, die sich tief im Gehirn befinden, oder in räumlich diffusen Populationen, die entweder genetische Werkzeuge zur Lokalisierung von Zellen in vivo (z. B. genetische Expression von Channelrhodopsin gepaart mit Optrode-Aufzeichnung) oder post-hoc-histochemische Identifizierung nach der Erfassung von Standortkennzeichnungen (z. B. mit neurotransmissionsspezifischen Markern) weiter verstärkt. Die medialen Olivocochlear-Neuronen, die sich diffus in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms befinden, leiden unter den oben genannten Einschränkungen1, was den Zugang zu In-vivo-Experimenten extrem erschwert.

Gehirn-Scheiben (100-500 m Dicke) sind seit langem verwendet worden, um Gehirn-Schaltungen zu studieren, einschließlich auditive Hirnstamm Schaltung, wegen der physischen Segregation der verbundenen Neuronen, die in der gleichen Scheibeenthaltensind 2,3,4,5,6,7,8,9. Experimente mit viel dickeren Scheiben (>1 mm) wurden in anderen Labors eingesetzt, um zu verstehen, wie sich bilaterale Inputs in Bereichen des überlegenen Olivary-Komplexes (SOC) integrieren, einschließlich der medialen überlegenen Olive10,11. Diese Scheiben wurden so hergestellt, dass Axone des Hörnervs (AN) innerhalb der Scheibe intakt blieben und elektrisch stimuliert wurden, um synaptische Neurotransmitter-Freisetzung in der CN zu initiieren, die Aktivität von Hörneuronen erster Ordnung imitiert, wie sie auf Schall reagieren würden. Ein großer Nachteil dieser dicken Scheiben ist die Sichtbarkeit von Neuronen für elektrophysiologische Aufnahmen mit Patch-Clamp ("Patching"). Patching wird immer schwieriger, da die zahlreichen Axone in diesem Bereich mit12,13,14,15Myelinatiert werden, wodurch das Gewebe auch in einer typischen, dünnen Hirnscheibe optisch dicht und verdunkelt wird. Unser Ziel ist es, In-vitro-Präparate zu entwickeln, die eher der Schaltungskonnektivität von In-vivo-Aufnahmen ähneln, aber mit den hochdurchsatz- und hochauflösenden Aufnahmefähigkeiten der visuell geführten Patch-Clamp-Elektrophysiologie in Hirnscheiben.

Unser Labor untersucht die Physiologie von Neuronen des auditiven efferenten Systems, einschließlich MOC-Neuronen. Diese cholinergen Neuronen liefern efferent Essrücke an die Cochlea durch Modulation der Aktivität der äußeren Haarzellen (OHCs)16,17,18,19,20. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Modulation eine Rolle bei der Gain-Kontrolle in der Cochlea21,22,23,24,25,26 und Schutz vor akustischen Trauma27,28,29,30,31,32,33. Bei Mäusen befinden sich MOC-Neuronen diffus im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) im auditiven Hirnstamm1. Unsere Gruppe hat die ChAT-IRES-Cre Mauslinie verwendet, die mit der tdTomato Reporter-Mauslinie gekreuzt wurde, um MOC-Neuronen in Hirnstammscheiben unter epifluoreszierender Beleuchtung anzuvisieren. Wir zeigten, dass MOC-Neuronen einen afferent hemmenden Input aus dem ipsilateralen Medialkern des Trapezkörpers (MNTB) erhalten, der wiederum durch Axone aus kugelförmigen Buschzellen (GBC) im kontralateralen Cochlea-Kern (CN)34,35,36,37,38angeregt wird. Zusätzlich erhalten MOC-Neuronen wahrscheinlich ihren exzitatorischen Input von T-Stellatzellen im kontralateralen CN39,40,41. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass MOC-Neuronen sowohl erregende als auch hemmende Eingaben erhalten, die vom gleichen (kontralateralen) Ohr abgeleitet werden. Jedoch, die präsynaptischen Neuronen, und ihre Axone konvergieren auf MOC Neuronen, sind nicht ganz nah genug aneinander, um vollständig intakt in einem typischen koronalen Scheibenpräparat zu sein. Um zu untersuchen, wie die Integration von synaptischen Inputs in MOC-Neuronen ihre Wirkungspotenziale beeinflusst, mit einem Fokus auf neu beschriebene Hemmung, entwickelten wir ein Präparat, bei dem wir die verschiedenen Afferents zu MOC-Neuronen von einem Ohr aus auf physiologisch realistische Weise stimulieren konnten, aber mit den technischen Vorteilen von In-vitro-Gehirnscheibenexperimenten.

Die Keilscheibe ist ein modifiziertes dickes Scheibenpräparat, das für die Untersuchung der Schaltungsintegration in MOC-Neuronen entwickelt wurde (schematisiert in Abbildung 1A). Auf der dicken Seite der Scheibe enthält der Keil die abgetrennten Axone des Hörnervs (nachfolgend "auditorische Nervenwurzel" genannt), wenn sie aus der Peripherie in das Hirnstamm gelangen und in der KN Synapsen synapsisch. Die auditive Nervenwurzel kann elektrisch stimuliert werden, um Neurotransmitter-Freisetzung und synaptische Aktivierung von Zellen der vollständig intakten CN42,43,44,45,46zu evozieren. Dieses Stimulationsformat hat mehrere Vorteile für die Schaltungsanalyse. Erstens stimulieren wir die AN, anstatt die Initiativ- und GBC-Axone, die einen affeten Input in die MOC-Neuronen liefern, direkt zu stimulieren, um die Aktivierung von intrinsischen Schaltkreisen zu ermöglichen, die in der CN reichlich vorhanden sind. Diese Schaltkreise modulieren die Ausgabe von CN-Neuronen zu ihren Zielen im gesamten Gehirn, einschließlich MOC-Neuronen46,47,48,49,50,51. Zweitens ermöglicht die polysynaptische Aktivierung von affemittenten Schaltkreisen vom AN über die CN vor dem CN von MOC-Neuronen ein natürlicheres Aktivierungs-Timing und eine Plastizität an diesen Synapsen, wie sie es in vivo während der auditiven Stimulation tun würden. Drittens können wir unsere Stimulationsmuster variieren, um AN-Aktivität nachzuahmen. Schließlich sind sowohl erregende als auch hemmende monaurale Projektionen auf MOC-Neuronen in der Keilscheibe intakt, und ihre Integration kann an einem MOC-Neuron mit der Präzision der Patch-Clamp-Elektrophysiologie gemessen werden. Insgesamt bietet dieses Aktivierungsschema einen intakteren Kreislauf zu den MOC-Neuronen im Vergleich zu einer typischen Gehirnscheibenpräparation. Diese Hirnstamm-Keilscheibe kann auch verwendet werden, um andere gehörive Bereiche zu untersuchen, die hemmende Inputs von ipsilateralem MNTB erhalten, einschließlich der lateralen überlegenen Olive, des überlegenen Olivary-Kerns und der medialen Superior Olive10,11,52,53,54,55,56. Über unsere spezifische Präparation hinaus kann diese Schneidemethode verwendet oder modifiziert werden, um andere Systeme zu bewerten, mit den Vorteilen der Aufrechterhaltung der Konnektivität von Langzeiteingaben und der Verbesserung der Visualisierung von Neuronen für eine Vielzahl von einzelligen Elektrophysiologie- oder Bildgebungstechniken.

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Vibram-Stufe oder Plattform, die ca. 15° geneigt werden kann. Hier verwenden wir eine handelsübliche 2-teilige magnetische Bühne, bei der die "Bühne" eine Metallscheibe mit einem gekrümmten Boden in einer konkaven magnetischen "Bühnenbasis" ist. Die Bühne kann dann verschoben werden, um den Schnittwinkel anzupassen. Konzentrische Kreise auf der Bühnenbasis werden verwendet, um den Winkel reproduzierbar abzuschätzen. Die Bühnen- und Bühnenbasis befindet sich in der Schneidkammer, wo auch die magnetische Bühnenbasis gedreht werden kann.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Experimentelle Präparate

HINWEIS: Details zur Scheibenvorbereitung einschließlich Schneidlösung, Schnitttemperatur, Inkubationstemperatur und Apparat (etc.) sind spezifisch für die Inkubation des Gehirns, die in diesem Experiment durchgeführt wird. Slice-Inkubationsdetails können pro Laborerfahrung geändert werden.

  1. Bereiten Sie interne Lösungen für die Patch-Klemmung vor.
    1. Vorbereiten von Spannungsklemmenlösung mit (in mM) 76 Cs-Methansulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatin, 5 QX-314 und 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,2 ein.
    2. Bereiten Sie aktuelle Klemmlösung mit (in mM) 125 K-Gluconat, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatin und 0.01 Alexa Fluor-488 Hydrazid vor. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein.
  2. Bereiten Sie 100 ml 4% Agar vor, indem Sie 4 g Agar zu 100 ml heißem (nahezu kochendem) Wasser hinzufügen. Auf erhitzte Rührplatte stellen, um die Temperatur zu halten und rühren, bis sie vollständig gelöst sind. In 100 mm Kunststoff-Petrischalen auf ca. 1 cm Tiefe gießen und abkühlen lassen. Kühlen, bis es gebraucht wird.
  3. Bereiten Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4und 10 dextrose vor. Blase mit Carbogen (5% CO2 / 95% O2) für mindestens 10 min, dann den letzten pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH einstellen, falls erforderlich. Erhalten Sie die Sauerstoffversorgung und den pH-Wert der Lösung, indem Sie während des Experiments kontinuierlich mit Carbogen sprudeln.
  4. Bereiten Sie 200 ml Schneidlösung vor, indem Sie ACSF 1 mM Kynurensäure hinzufügen. Beschallunglösung in einem beschallenden Wasserbad für 10 min, bis Kynurensäure gelöst ist. Kontinuierlich mit Autobogen sprudeln und auf Eis legen.
    VORSICHT: Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Kynurensäure.
  5. Montieren Sie eine geeignete Klinge im Vibratom gemäß den Anweisungen des Herstellers. Chill Vibratome Schneidkammer, indem Sie es mit Eis umgeben.

2. Hirnentfernung mit intakter Hörnerv-Wurzel zur Stimulation

HINWEIS: Mäuse für diese Experimente wurden durch Kreuzung von transgenen ChAT-IRES-Cre-Mäusen auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit tdTomato-Reportermäusen (Ai14) gewonnen. Mäuse, die für Histologie und Elektrophysiologie verwendet wurden, waren nach hörendes Beginn (P14-P23), das bei Mäusen um P12 liegt. Neuronen, die tdTomato im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) exemiten, wurden zuvor in dieser Mauslinie57als MOC-Neuronen charakterisiert.

  1. Euthanisieren (z. B. CO2-Erstickung) und enthaupten Sie das Tier nach zugelassenen institutionellen Verfahren.
  2. Schneiden Sie die Haut an der Schädelmitte mit einer Rasierklinge von der Nase bis zum Nacken. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
  3. Mit einer kleinen Schere, machen Sie einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie beginnend an der Basis (kaudal endes Ende in der Nähe des Rückenmarks) des Schädels und weiter in Richtung der Nase.
  4. An der Lambda-Nähte, machen Schnitte im Schädel von der Mittellinie, seitlich in Richtung des Ohres auf beiden Seiten. Schälen Sie den Schädel zurück, um das Gehirn freizulegen.
  5. Beginnend am rostralen Ende, heben Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel mit einem kleinen Laborspachtel oder stumpfen Zangen. Schneiden Sie den Sehnerv und arbeiten Sie das Gehirn vorsichtig nach hinten, indem Sie die ventrale Oberfläche freisetzen.
  6. Schneiden Sie die Trigeminusnerven, indem Sie sie mit feinen Zangen in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms kneifen.
    HINWEIS: Tun Sie dies sorgfältig, da der Vestibulocochlea-Nerv direkt darunter liegt und für eine eventuelle Stimulation intakt sein muss.
  7. Die Zubereitung in eine glasende Petrischale geben, die mit kalter Schneidlösung gefüllt ist. Legen Sie die Schale unter ein Sezieren des Mikroskops. Sanft mit Carbogen sprudeln.
  8. Trimmen Sie den Gesichtsnerv in der Nähe des Hirnstamms und setzen Sie den Vestibulocochlea-Nerv aus.
  9. Mit feinen Zangen schieben Sie die Spitzen in die Foramina, wo der Vestibulocochlea-Nerv den Schädel so weit wie möglich verlässt und den Nerv kneifen, um ihn zu trennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt bleibt. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite.
  10. Sobald beide Nervenwurzeln frei sind, entfernen Sie die Hirnhaut und Vaskulatur von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers.
  11. Befreien Sie das Gehirn vollständig aus dem Schädel, indem Sie die verbleibenden Hirnnerven und Bindegewebe kneifen, wobei sie darauf achten, das verbleibende Rückenmark nach Möglichkeit zu erhalten.

3. Blockieren und montieren Gehirn auf der Bühne (magnetische Scheibe)

  1. Bereiten Sie die Oberfläche des Gehirns vor, um sich an der Bühne zu fixieren, indem Sie das Gehirn auf der Ebene des optischen Chiasmus blockieren.
    1. Mit der ventralen Oberfläche nach oben, stabilisieren Sie das Gehirn mit einem stumpfen Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren, so dass das Gehirn während des folgenden Schritts nicht kippt.
    2. Verwenden Sie auf der Ebene des optischen Chiasmus offene Zangen, um die Ebene zur Blockierung des Gehirns zu erstellen, indem Sie durch das Gehirn bis zum Boden der Schale einfügen. Setzen Sie die Zange in einem Winkel von ca. 20° von vertikal, so dass die Spitzen verlassen die dorsale Oberfläche des Gehirns kaudal zum optischen Chiasm.
    3. Schneiden Sie entlang der Zange mit der Rasierklinge.
  2. Kleben Sie das Gehirn an die Oberfläche der Bühne.
    1. Bereiten Sie einen kleinen Block (ca. 1 cm3) von 4% Agar zur Unterstützung des Gehirns vor.
    2. Legen Sie einen kleinen Tropfen Kleber auf die Bühne und verteilen Sie ihn in ein Rechteck, damit sowohl das Gehirn als auch der Agarblock verklebt werden können.
    3. Mit Zangen, vorsichtig heben Sie das Gehirn und sanft die überschüssige Flüssigkeit mit dem Rand eines Papiertuchs zu tappen. Legen Sie die blockierte Oberfläche auf den Kleber, ventrale Oberfläche wird in Richtung der Klinge während des Schneidens sein.
    4. Drücken Sie den Agarblock sanft gegen die Rückenoberfläche des Gehirns, um ihn beim Schneiden zu unterstützen und eine korrekte Gehirnpositionierung (d. h. Winkel) zu gewährleisten.

4. Schneiden Sie Gehirn, um Keilscheibe zu erstellen

HINWEIS: Bereiten Sie eine Gehirnscheibe mit Vibratom vor, das die Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und mediale Olivocochlear(MOC) Neuronen und den medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) auf der dünnen Seite hat.

  1. Legen Sie die Magnetscheibe mit angeschlossenem Gehirn auf die Bühnenbasis und legen Sie sie in die Schnittkammer mit der ventralen Oberfläche des Gehirns, die auf die Klinge ausgerichtet ist.
  2. Füllen Sie die Kammer mit eiskalten Schneidlösung und Blase mit Carbogen.
  3. Senken Sie die Klinge in die Lösung und schneiden Sie Scheiben kaudal zu dem Bereich von Interesse, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Wenn die Scheiben asymmetrisch erscheinen, neigen Sie die Bühne leicht, um Symmetrie zu erhalten.
    HINWEIS: Klingengeschwindigkeiten zwischen 0,05-0,10 mm/s waren wirksam zum Schneiden gesunder Scheiben und können je nach Alter und Hirnregion variieren.
  4. Sobald die Scheiben symmetrisch sind, verschieben Sie die Bühne um 15° (entsprechend ca. 3 konzentrischen Ringen auf der Bühnenbasis) auf eine Seite.
    HINWEIS: Verschieben Sie die Bühne weg von der hörnerwährenden Nervenwurzel, die Sie in der Scheibe bewahren möchten.
  5. Schneiden Sie vorsichtig weiter, bis die hörnerale Nervenwurzel auf der einen Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite zu sehen ist.
  6. Verschieben Sie die Bühne um 15° zurück in die ursprüngliche Position.
  7. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg und drehen Sie die Bühnenbasis um 90°, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite der Klinge zugewandt ist. Senken Sie die Klinge mehrere hundert Mikrometer und bringen Sie die Klinge dann langsam in die Nähe der Kante des Gewebes. Wiederholen Sie dies, bis die Klinge die seitliche Kante berührt. Senken Sie die Klinge auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe, hier weitere 200 Mikrometer.
    HINWEIS: Die resultierende Scheibe ist idealerweise 300 mm dick auf der Ebene des ventralen Kerns des Trapezkörpers (VNTB) an der Seite, an der die Patchklemmung stattfindet.
  8. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg und drehen Sie die Bühnenbasis zurück, so dass die ventrale Oberfläche ihr zugewandt ist.
  9. Machen Sie den Schnitt, der die rostrale Oberfläche der Keilscheibe bezeichnet. Übertragen Sie die Scheibe auf ein Stück Interface-Papier (1 cm2) kaudaloberfläche nach unten. Bewegen Sie die Scheibe zur Rückgewinnung in die Inkubationskammer oder andere geeignete Inkubationsvorrichtungen (30 min bei 35 °C).
    HINWEIS: Der Gesichtsnerv sollte auf beiden Hemisphären der Scheibe auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein (siehe Abbildung 1B).

5. Elektrophysiologie-Einrichtung und -Aufzeichnung

  1. Legen Sie die Keilscheibe in die Aufnahmekammer und sichern Sie die Scheibe mit einer Harfe oder einem Stabilisierungssystem. Durchdringen Sie das Gewebe kontinuierlich mit einer Rate von 7-10 ml/min mit warmem (35 °C) ACSF blasen mit Carbogen.
  2. Identifizieren Sie genetisch markierte MOC-Neuronen im VNTB mithilfe von Epifluoreszenz mit 561 nm Emissionsfiltern für Patch-Clamp-Aufnahmen. Flip Slice, wenn keine potenziell patchfähigen Zellen vorhanden sind.
  3. Mit DIC-Optik, konzentrieren Sie sich auf die auditive Nervenwurzel auf der dicken Seite der Scheibe und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die bipolare Wolfram stimulierende Elektrode nach unten auf die auditive Nervenwurzel und sanft in die Oberfläche des Gewebes zu bewegen.
    HINWEIS: Saugelektroden wurden in auditiven Nervenstimulationsexperimenten in anderen Labors eingesetzt. Theta-Glaselektroden oder optische Stimulationsmethoden können eingesetzt werden, wenn sie auf andere spezifische Präparate anwendbar sind.
  4. Verschieben Sie das Sichtfeld zurück zum VNTB, um ein MOC-Neuron für die Patchklemmen-Elektrophysiologie auszuwählen.
  5. Füllen Sie eine Aufnahmepipette mit einer geeigneten internen Lösung für das vorgeschlagene Experiment.
  6. Patch und Aufzeichnung aus dem MOC-Neuron in der Ganzzellkonfiguration. Kompensieren Sie bei Bedarf Membrankapazität und Serienwiderstand.
  7. Passen Sie die elektrische Stimulationsamplitude der auditiven Nervenwurzel an, um konsistente postsynaptische Ereignisse im MOC-Neuron zu erhalten.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Stimulationselektrode zu bewegen.
  8. Führen Sie geeignete Stimulationsprotokolle aus, um evozierte synaptische Ströme in MOC (Spannungsklemme) oder Aktionspotentialmuster (Stromklemme) zu beobachten.
    HINWEIS: Die Keilscheibenpräparation kann mit allen typischen Patch-Clamp-Tools wie Lose-Patch-Aufnahmen, Pharmakologie, Optogenetik, Kalzium-Bildgebung, Neurotransmitter-Unkaging usw. verwendet werden.

6. Histologische Bestätigung von Hirnstammkernen

HINWEIS: Dies geschieht mit Cresylviolettfärbung, in fester, neu geschnittener Keilscheibe. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Kernen, die in der Scheibe enthalten sind.

  1. Nach dem Vorbereiten einer Keilscheibe, tauchen Sie Die scheibe in fixative (4% PFA in PBS) über Nacht. Spülen Sie die Scheibe 3x für 10 min in PBS (Raumtemperatur auf einem Shaker), dann in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C zum Kryoprotect legen.
  2. Schneiden Sie die Scheibe auf einem gefrierenden Mikrotom (40-70 mm) neu und sammeln Sie serielle Abschnitte in einer 24-Well-Platte in PBS.
  3. Abschnitte auf gelatinebeschichteten Dias montieren und vollständig trocknen lassen. Platzieren Sie Dias in einem Schiebewagen.
  4. Vorbereiten von Cresylviolett-Lösungen
    1. Bereiten Sie 1% Cresylviolettacetat durch Mischen von 5 g Cresylviolettacetat in 500 mL dH2O vor
    2. Vorbereiten des Acetatpuffers durch erste Vorbereitung der 90 ml Lösung A (540 ml Eisessigsäure + 89,46 ml dH2O) und 10 ml Lösung B (136 mg Natriumacetat in 10 ml dH2O). Kombinieren Sie Lösung A und Lösung B, die den Acetatpuffer ergibt.
    3. Kombinieren Sie 1% Cresylviolettacetat mit dem Acetatpuffer 1:1 für 0,5% Cresylviolett in Acetatpuffer. Filtern Sie vor der Verwendung.
    4. Herstellung von 95% und 70% Ethanol durch Verdünnung von 100% Ethanol mit entsprechenden Mengen von dH2O
  5. Führen Sie das Cresylviolett-Färbungsprotokoll durch. Bewegen Sie den Schlitten durch Lösungsschalen, blotting überschüssige Lösung auf einem Papiertuch zwischen den Schalen: Xylol – 5 min; 95% Ethanol – 3 min; 70% Ethanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% Cresylviolettlösung – 8-14 min Überwachung häufig, bis die nukleare Färbung dunkelviolett wird; dH2O – 3 min; 70% Ethanol – 3 min; 95% Ethanol – 1-2 min; 100% Ethanol – Dip gleitet zweimal; Xylol – 5 min; Xylol: 25 min bis zur Montage.
    VORSICHT: Verwenden Sie Xylole nur unter einer Dunstabzugshaube.
  6. Entfernen Sie Die syxylen nacheinander und platzieren Sie die Deckschlipse sofort mit dem Montagemedium auf den Dias. Montagemedium trocknen lassen (über Nacht).
  7. Bildabschnitte.

7. Biocytin-Kennzeichnung zur anterogragraden Rückverfolgung von Axonen in lebendem, unfixiertem Gewebe

  1. Bereiten Sie eine Keilscheibe wie oben (Schritte 2-4).
  2. Übertragen Sie die Scheibe auf Schnittstellenpapier (ca. 1 cm2). Lokalisieren Sie die CN unter einem Sezierender Mikroskop auf der dicken Seite der Scheibe.
  3. Entfernen Sie überschüssiges ACSF vorsichtig aus dem Bereich um die Scheibe, indem Sie eine Ecke eines Tissuepapiers verdrehen, um den ACSF aus dem Gewebe zu ziehen. Dadurch wird verhindert, dass sich das Biocytin in die umliegenden Bereiche der Scheibe ausbreitet, was zu einer Aufnahme in Zellen außerhalb der CN führen könnte.
  4. Mit feinen Zangen wählen Sie einen kleinen Kristall aus Biocytin und legen Sie ihn auf die Oberfläche der CN. Drücken Sie den Kristall vorsichtig in das Gewebe, um den Kontakt mit Neuronen und die anschließende Aufnahme in Somata zu fördern. Wiederholen Sie diesen Schritt, um den gewünschten Interessenbereich abzudecken, in diesem Fall CN-Regionen, die T-Stellat- und GBC-Neuronen enthalten.
  5. Legen Sie die Scheibe in eine Inkubationskammer. Lassen Sie die Scheibe für 2-4 h bei 35 °C brüten, um die Aufnahme und den Transport des Biozytins zu ermöglichen. Nach der Inkubation spülen Sie die Scheibe in ACSF, um Biozytinpartikel zu entfernen.
  6. Slice über Nacht in fixative (4% PFA in PBS) legen. 3x für 10 min in PBS abspülen.
  7. Cryoprotect-Scheibe in 30% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C oder bis die Scheibe sinkt.
  8. Resektieren Sie das Gewebe, um Querabschnitte auf einem gefrierenden Mikrotom bei 70-100 mm zu produzieren.
  9. Prozessgewebe mit standard immunhistochemischen Methoden mit einem fluoreszierend konjugierten Streptavidin.
    HINWEIS: Zusätzliche Immunhistochemie kann auf den Abschnitten durchgeführt werden, wenn hilfreich für die Etikettierung von präsynaptischen Zellkörpern, Axonen, Rezeptoren oder anderen synaptischen Molekülen, die für die Schaltungsvisualisierung wichtig sind (d. h. primäre Antikörperschritte sollten die sekundäre Visualisierung von Biozytin nicht beeinträchtigen).
  10. Bild das Gewebe.

Ergebnisse

Histologische Untersuchung der Keilscheibe
Für unsere Untersuchung der auditiven Hirnstamm-Neuron-Funktion wurde das Keilscheibenpräparat entwickelt, um die auditive Nervenwurzel und CN kontralateral zu den MOC-Neuronen zu enthalten, die für Aufnahmen bestimmt sind (Beispielscheibe in Abbildung 1B). Eine erste histologische Untersuchung der Zubereitung ist wichtig, um zu bestätigen, dass die Scheibe die für die Schaltungsaktivierung notwendigen Kerne enthält und das...

Diskussion

Das hier beschriebene Schneidverfahren, das als Keilscheibe bezeichnet wird, ist mächtig für die Aufrechterhaltung intakter präsynaptischer neuronaler Schaltkreise, aber mit der Zugänglichkeit von Gehirnscheibenexperimenten zur Analyse der neuronalen Funktion. In mehreren ersten Schritten muss große Vorsicht geboten sein, um den Nutzen der Vorbereitung für die Schaltungsanalyse zu maximieren. Die Abmessungen des Keils sollten durch histologische Untersuchung bestätigt werden, die integral für die Bestätigung ist...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

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