JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Resumo

Técnicas de eletrofisiologia de fatias in vitro medem a atividade unicelular com resolução elétrica e temporal precisa. As fatias cerebrais devem ser relativamente finas para visualizar adequadamente e acessar neurônios para fixação de patches ou imagens, e o exame in vitro dos circuitos cerebrais é limitado apenas ao que está fisicamente presente na fatia aguda. Para manter os benefícios da experimentação de fatias in vitro, preservando uma porção maior de núcleos pré-sinápticos, desenvolvemos uma nova preparação de fatias. Esta "fatia de cunha" foi projetada para gravações de eletrofisiologia de grampos para caracterizar as diversas entradas monaurais, orientadas ao som para neurônios olivococlear medial (MOC) no tronco cerebral. Esses neurônios recebem suas entradas excitatórias e inibitórias primárias de neurônios ativados por estímulos no ouvido contralateral e núcleo coclear correspondente (CN). Uma fatia cerebral assimétrica foi projetada que é mais espessa no domínio rostro-caudal na borda lateral de um hemisfério e, em seguida, se inclina em direção à borda lateral do hemisfério oposto. Esta fatia contém, no lado grosso, a raiz nervosa auditiva transmitindo informações sobre estímulos auditivos para o cérebro, os circuitos intrínsecos de CN, e tanto o inibidor excitatório e trissináptico aferentes caminhos que convergem em neurônios MOC contralaterais. A gravação é realizada a partir de neurônios MOC no lado fino da fatia, onde são visualizados usando óptica DIC para experimentos típicos de grampo de remendo. A estimulação direta do nervo auditivo é realizada à medida que entra no tronco cerebral auditivo, permitindo que a atividade intrínseca do circuito CN e a plasticidade sináptica ocorram em sinapses a montante dos neurônios MOC. Com essa técnica, pode-se imitar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível dentro da fatia. Esta preparação de fatia de cunha é aplicável a outros circuitos cerebrais onde as análises de circuitos se beneficiariam da preservação da conectividade upstream e de entradas de longo alcance, em combinação com as vantagens técnicas da fisiologia de fatias in vitro.

Introdução

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são desafiadoras de realizar, mesmo em regiões cerebrais que são facilmente acessadas. Os desafios técnicos dos experimentos de resolução unicelular são ainda mais amplificados em certas populações de neurônios que estão localizadas nas profundezas do cérebro, ou em populações espacialmente difusas que requerem ferramentas genéticas para localizar células in vivo (por exemplo, expressão genética de channelrhodopsin emparelhada com gravação optrode) ou identificação histoquímica pós-hoc após a gravação do local (por exemplo, com marcadores específicos de neurotransmissão). Estando localizados difusamente perto da superfície ventral do tronco cerebral, os neurônios olivococleares medial (MOC) sofrem das limitações acima1, tornando-os extremamente difíceis de acessar para experimentação in vivo.

As fatias cerebrais (~100-500 μm de espessura) têm sido usadas há muito tempo para estudar circuitos cerebrais, incluindo circuitos de tronco cerebral auditivo, devido à segregação física de neurônios conectados que estão contidos dentro da mesma fatia2,3,4,5,6,7,8,9. Experimentos com fatias muito mais grossas (>1 mm) têm sido empregados em outros laboratórios para entender como os insumos bilaterais se integram em áreas do complexo olivary superior (SOC), incluindo a azeitona superior medial10,11. Estas fatias foram preparadas de tal forma que os axônios do nervo auditivo (AN) permaneceram intactos dentro da fatia e foram eletricamente estimulados a iniciar a liberação de neurotransmissores sinápticos no CN, imitando a atividade dos neurônios auditivos de primeira ordem como eles responderiam ao som. Uma grande desvantagem dessas fatias grossas é a visibilidade dos neurônios para gravações eletrofisiológicas de grampo de remendo ("patching"). A remenda torna-se cada vez mais difícil à medida que os numerosos axônios nesta área tornam-se mieliados com12,13,14,15anos, tornando o tecido opticamente denso e obscurecendo neurônios mesmo em uma típica fatia cerebral fina. Nosso objetivo é criar preparações in vitro que se assemelham mais à conectividade do circuito de gravações in vivo, mas com as habilidades de gravação de alta produtividade e alta resolução da eletrofisiologia de grampos visualmente guiados em fatias cerebrais.

Nosso laboratório investiga a fisiologia dos neurônios do sistema auditivo e diferente, incluindo neurônios MOC. Estes neurônios colinérgicos fornecem feedback eferente à cóclea, modulando a atividade das células ciliares externas (OHCs)16,17,18,19,20. Estudos anteriores mostraram que essa modulação desempenha um papel no controle de ganhos na cóclea21,22,23,24,25,26 e proteção contra trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. Em camundongos, os neurônios MOC estão divididos no núcleo ventral do corpo trapezoide (VNTB) no tronco cerebral auditivo1. Nosso grupo utilizou a linha de mouse ChAT-IRES-Cre cruzada com a linha de rato repórter tdTomato para atingir neurônios MOC em fatias de tronco cerebral sob iluminação epifluorescente. Mostramos que os neurônios MOC recebem uma entrada inibitória diferente do núcleo medial ipsilateral do corpo trapezoide (MNTB), que é animado, por sua vez, por axônios de células espessas globulares (GBC) no núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Além disso, os neurônios MOC provavelmente recebem sua entrada excitatória de células T-estelares no CN39,40,41. Juntos, esses estudos mostram que os neurônios MOC recebem insumos excitatórios e inibitórios derivados do mesmo ouvido (contralateral). No entanto, os neurônios pré-sinápticos, e seus axônios convergindo em neurônios MOC, não são suficientemente próximos um do outro para estarem totalmente intactos em uma típica preparação de fatias coronais. Para investigar como a integração de entradas sinápticas aos neurônios MOC afeta seus padrões potenciais de ação, com foco na inibição recém-descrita, desenvolvemos uma preparação na qual poderíamos estimular os diversos afferents aos neurônios MOC de um ouvido da maneira mais fisiologicamente realista possível, mas com os benefícios técnicos de experimentos in vitro de fatias cerebrais.

A fatia de cunha é uma preparação de fatia grossa modificada projetada para a investigação da integração do circuito em neurônios MOC (esquematizado na Figura 1A). No lado grosso da fatia, a cunha contém os axônios decepados do nervo auditivo (denominado "raiz nervosa auditiva" daqui em diante) à medida que entram no tronco cerebral da periferia e da sinapse no CN. A raiz nervosa auditiva pode ser estimulada eletricamente para evocar a liberação de neurotransmissores e a ativação sináptica das células do CN42,43,44,45,46. Este formato de estimulação tem vários benefícios para a análise do circuito. Primeiro, em vez de estimular diretamente os axônios T-stellate e GBC que fornecem uma entrada diferente aos neurônios MOC, estimulamos o AN para permitir a ativação de circuitos intrínsecos abundantes no CN. Esses circuitos modulam a saída de neurônios CN para seus alvos em todo o cérebro, incluindo neurônios MOC46,47,48,49,50,51. Em segundo lugar, a ativação polissináptica de circuitos diferentes do AN através do a montante CN dos neurônios MOC permite que um tempo de ativação mais natural e para a plasticidade ocorra nessas sinapses como ocorreriam in vivo durante a estimulação auditiva. Terceiro, podemos variar nossos padrões de estimulação para imitar uma atividade. Finalmente, tanto as projeções monaural excitatórias quanto inibitórias para os neurônios MOC estão intactas na fatia da cunha, e sua integração pode ser medida em um neurônio MOC com a precisão da eletrofisiologia de grampo de remendo. Como um todo, este esquema de ativação fornece um circuito mais intacto para os neurônios MOC em comparação com uma preparação típica de fatia cerebral. Esta fatia de cunha do tronco cerebral também pode ser usada para investigar outras áreas auditivas que recebem insumos inibitórios do MNTB ipsilateral, incluindo a azeitona superior lateral, o núcleo olivary superior e a azeitona superior medial10,11,52,53,54,55,56. Além de nossa preparação específica, este método de corte pode ser usado ou modificado para avaliar outros sistemas com os benefícios de manter a conectividade de entradas de longo alcance e melhorar a visualização de neurônios para uma variedade de técnicas de eletrofisiologia de resolução unicelular ou de imagem.

Este protocolo requer o uso de um estágio ou plataforma vibratome que pode ser inclinado aproximadamente 15°. Aqui usamos um estágio magnético de 2 peças comercialmente disponível onde o "palco" é um disco de metal com um fundo curvo colocado em uma "base de estágio" magnética côncava. O estágio pode então ser deslocado para ajustar o ângulo da fatia. Círculos concêntricos na base do palco são usados para estimar o ângulo de forma reprodutível. O estágio e a base do palco são colocados na câmara de corte, onde a base do estágio magnético também pode ser girada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC/Instituto Nacional de Surdez e Outros Transtornos de Comunicação Do Comitê de Cuidado e Uso de Animais.

1. Preparações experimentais

NOTA: Detalhes sobre a preparação de fatias, incluindo solução de corte, temperatura de corte, temperatura de incubação de fatias e aparelhos (etc.) são específicos para a preparação do tronco cerebral realizada neste experimento. Os detalhes da incubação da fatia podem ser alterados por experiência de laboratório.

  1. Prepare soluções internas para fixação de correção.
    1. Prepare a solução de grampo de tensão contendo (em mM) 76 Cs-metanosulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosphocreatine, 5 QX-314, e 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com CsOH.
    2. Prepare a solução de grampo atual contendo (em mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine e 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com KOH.
  2. Prepare 100 mL de 4% de ágar adicionando 4 g de ágar a 100 mL de água quente (perto de ferver). Coloque na placa de mexida aquecida para manter a temperatura e mexa até dissolver completamente. Despeje em pratos de Petri de plástico de 100 mm até aproximadamente 1 cm de profundidade e deixe esfriar. Leve à geladeira até que seja necessário.
  3. Prepare 1 L fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo em mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, e 10 dextrose. Bolha com carbogen (5% CO2 / 95% O2) por pelo menos 10 min, depois ajuste o pH final para 7,4 com 1 M NaOH se necessário. Mantenha a oxigenação e pH de solução borbulhando continuamente com carbogen durante todo o experimento.
  4. Prepare a solução de fatiamento de 200 mL adicionando ácido kynurenic de 1 mM ao ACSF. Solução sonicate em um banho de água sonicating por 10 minutos até que o ácido kynurnic seja dissolvido. Bolha contínua com carbogen e coloque no gelo.
    ATENÇÃO: Utilize equipamentos de proteção individual adequados ao manusear ácido kynurnic.
  5. Monte uma lâmina apropriada no vibratome seguindo as instruções do fabricante. Frio vibratome cortando câmara cercando-a com gelo.

2. Remoção cerebral com raiz nervosa auditiva intacta para estimulação

NOTA: Os ratos para esses experimentos foram obtidos cruzando camundongos transgênicos ChAT-IRES-Cre em um fundo C57BL/6J com ratos repórteres tdTomato (Ai14). Camundongos usados para histologia e eletrofisiologia foram início pós-audição (P14-P23), que é em torno de P12 em camundongos. Neurônios que expressam tdTomato no núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) têm sido previamente caracterizados como neurônios MOC nesta linha de camundongos57.

  1. Eutanize (por exemplo, asfixia por CO2) e decapite o animal utilizando procedimentos institucionais aprovados.
  2. Usando uma lâmina de barbear, corte a pele na linha média do crânio do nariz para a parte de trás do pescoço. Descasque a pele para expor o crânio.
  3. Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão no crânio através da linha média começando na base (extremidade caudal perto da medula espinhal) do crânio e continuando em direção ao nariz.
  4. Na sutura lambda, faça cortes no crânio a partir da linha média, lateral em direção à orelha em ambos os lados. Descasque o crânio para expor o cérebro.
  5. Começando na extremidade rostral, levante suavemente o cérebro do crânio com uma pequena espátula de laboratório ou fórceps contundentes. Corte o nervo óptico e continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral.
  6. Corte os nervos trigêmeos beliscando-os com fórceps finos perto da superfície ventral do tronco cerebral.
    NOTA: Faça isso cuidadosamente, pois o nervo vestibulococochlear está logo abaixo disso e precisa estar intacto para uma eventual estimulação.
  7. Coloque a preparação em uma placa de vidro Petri cheia de solução de corte frio. Coloque o prato sob um microscópio dissecando. Bolha suavemente com carbogen.
  8. Corte o nervo facial perto do tronco cerebral e exponha o nervo vestibulocochlear.
  9. Usando fórceps finos, empurre as pontas para a foramina onde o nervo vestibulocochlear sai do crânio o mais longe possível e belisque o nervo para cortá-lo, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral. Repita isso do outro lado.
  10. Uma vez que ambas as raízes nervosas estejam livres, remova as meninges e vasculatura da superfície ventral do tronco cerebral perto do corpo trapezoide.
  11. Liberte o cérebro completamente do crânio beliscando os nervos cranianos restantes e o tecido conjuntivo tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.

3. Bloqueie e monte o cérebro no palco (disco magnético)

  1. Prepare a superfície do cérebro para se fixar no estágio bloqueando o cérebro ao nível do quiasma óptico.
    1. Com a superfície ventral para cima, estabilize o cérebro usando uma ferramenta contundente para imobilizar suavemente a medula espinhal para que o cérebro não se incline durante a etapa seguinte.
    2. Ao nível do quiasmo óptico, use fórceps abertos para criar o plano para bloquear o cérebro inserindo através do cérebro até o fundo do prato. Insira as fórceps em um ângulo de aproximadamente 20° da vertical para que as pontas saiam da superfície dorsal do cérebro caudal para o quiasmo óptico.
    3. Corte ao longo dos fórceps usando a lâmina de barbear.
  2. Cole o cérebro à superfície do palco.
    1. Prepare um pequeno bloco (~1 cm3) de 4% de ágar para suportar o cérebro.
    2. Coloque uma pequena gota de cola no palco e espalhe-a em um retângulo para que o cérebro e o bloco de ágar possam ser colados.
    3. Usando fórceps, levante cuidadosamente o cérebro e dobre suavemente o excesso de líquido usando a borda de uma toalha de papel. Coloque a superfície bloqueada sobre a cola, a superfície ventral será em direção à lâmina durante o corte.
    4. Empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal do cérebro para apoiá-lo durante o corte e para garantir o posicionamento cerebral adequado (ou seja, ângulo).

4. Corte o cérebro para criar fatia de cunha

NOTA: Prepare uma fatia cerebral usando vibratome que tenha a raiz nervosa coclear no lado grosso e neurônios olivococlear medial (MOC) e o núcleo medial do corpo trapezoide (MNTB) no lado fino.

  1. Coloque o disco magnético com cérebro preso na base do palco e coloque-o na câmara de corte com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina.
  2. Encha a câmara com solução de corte gelado e bolha com carbogen.
  3. Abaixe a lâmina na solução e corte fatias caudais para a região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Se as fatias parecerem assimétricas, incline o palco ligeiramente para obter simetria.
    NOTA: As velocidades da lâmina entre 0,05-0,10 mm/s foram eficazes para cortar fatias saudáveis e podem variar dependendo da idade animal e região cerebral.
  4. Uma vez que as fatias sejam simétricas, mude o palco ~15° (correspondente a aproximadamente 3 anéis concêntricos na base do palco) para um lado.
    NOTA: Desperte o palco da raiz nervosa auditiva que você deseja preservar na fatia.
  5. Continue cortando cuidadosamente até que a raiz nervosa auditiva esteja perto da superfície de um lado, e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado.
  6. Mude o palco 15° para a posição original.
  7. Mova a lâmina para longe do tecido e gire a base do palco 90° para que a borda lateral do lado fino esteja voltada para a lâmina. Abaixe a lâmina várias centenas de mícrons e, em seguida, lentamente traga a lâmina perto da borda do tecido. Repita isso até que a lâmina toque a borda lateral. Abaixe a lâmina para a espessura desejada da borda fina da fatia, aqui mais 200 mícrons.
    NOTA: A fatia resultante tem idealmente ~300 mm de espessura ao nível do núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) no lado onde ocorrerá a fixação do patch.
  8. Mova a lâmina para trás do tecido e gire a base do palco para trás para que a superfície ventral esteja voltada para ela.
  9. Faça o corte que designa a superfície rostral da fatia da cunha. Transfira a fatia para um pedaço de papel de interface (1 cm2) superfície caudal para baixo. Mova a fatia para a câmara de incubação ou outro aparelho de incubação adequado para recuperação (30 min a 35 °C).
    NOTA: O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios da fatia na superfície rostral (ver Figura 1B).

5. Configuração e gravação de eletrofisiologia

  1. Coloque a fatia da cunha na câmara de gravação e fixe a fatia com uma harpa ou sistema estabilizador. Perfunda o tecido continuamente a uma taxa de 7-10 mL/min com ACSF quente (35 °C) borbulhado com carbogen.
  2. Identifique neurônios MOC geneticamente rotulados no VNTB usando epifluorescência com filtros de emissão de 561 nm para gravações de grampos de remendo. Vire fatia se não houver células potencialmente remendáveis.
  3. Usando óptica DIC, concentre-se na raiz nervosa auditiva no lado grosso da fatia e use um micromanipulador para mover o eletrodo estimulante de tungstênio bipolar até a raiz nervosa auditiva e suavemente para a superfície do tecido.
    NOTA: Eletrodos de sucção têm sido usados em experimentos auditivos de estimulação nervosa em outros laboratórios. Eletrodos de vidro de ou métodos de estimulação óptica podem ser empregados se aplicável a outras preparações específicas.
  4. Mova o campo de visão de volta para o VNTB para escolher um neurônio MOC para atingir a eletrofisiologia do grampo de remendo.
  5. Encha uma pipeta de gravação com solução interna apropriada para o experimento proposto.
  6. Remendar e gravar do neurônio MOC na configuração de células inteiras. Compense a capacitância da membrana e a resistência da série, se necessário.
  7. Ajuste a amplitude de estimulação elétrica da raiz nervosa auditiva para obter eventos postsináspticos consistentes no neurônio MOC.
    NOTA: Pode ser necessário mover o eletrodo de estimulação.
  8. Execute protocolos de estimulação adequados para observar correntes sinápticas evocadas em MOC (grampo de tensão) ou padrões potenciais de ação (grampo de corrente).
    NOTA: A preparação da fatia de cunha pode ser usada com quaisquer ferramentas típicas de grampo de remendo, como gravações de remendo soltos, farmacologia, optogenética, imagem de cálcio, neurotransmissor sem corte, etc.

6. Confirmação histológica dos núcleos do tronco cerebral

NOTA: Isso é feito com coloração violeta de cresito, em fatia de cunha fixa e re-seccionada. Este método permite a visualização de núcleos que estão contidos na fatia.

  1. Depois de preparar uma fatia de cunha, submergir fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe a fatia 3x por 10 min em PBS (temperatura ambiente em um shaker), depois coloque em 30% de sacarose na PBS durante a noite a 4 °C para crioprotetor.
  2. Remendo a fatia em um microtome congelante (40-70 mm) e colete seções seriais em uma placa de 24 poços em PBS.
  3. Monte seções em lâminas revestidas de gelatina e deixe secar completamente. Coloque slides no vagão de slides.
  4. Prepare soluções violetas de cresyl
    1. Prepare acetato violeta de 1% de cresílico misturando acetato violeta de 5 g em 500 mL dH2O
    2. Prepare o tampão de acetato preparando pela primeira vez a solução A de 90 mL (ácido acético glacial de 540 mL + 89,46 mL dH2O) e 10 mL solução B (acetato de sódio de 136 mg em 10 mL dH2O). Combine a solução A e a solução B que produz o tampão de acetato.
    3. Combine 1% de acetato violeta de crestil com o tampão de acetato 1:1 para 0,5% de violeta de crestil no tampão de acetato. Filtrar antes de usar.
    4. Prepare 95% e 70% de etanol diluindo 100% etanol com volumes apropriados de dH2O
  5. Execute o protocolo de coloração violeta cresyl. Mova o carro de slides através de bandejas de solução, manchando a solução em excesso em uma toalha de papel entre as bandejas: xileno – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; Solução violeta de 0,5% cresyl – monitoramento de 8 a 14 min com frequência até que a coloração nuclear fique roxa escura; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – deslizamentos de mergulho duas vezes; xileno – 5 min; xileno: 25 min até que a montagem seja realizada.
    ATENÇÃO: Use xileno apenas sob um capô de fumaça.
  6. Remova slides do xileno um de cada vez e coloque imediatamente os deslizamentos de cobertura em slides usando meio de montagem. Permitir a montagem de meio a seco (durante a noite).
  7. Seções de imagem.

7. Rotulagem de biocittina para rastreamento anterograde de axônios em tecido vivo e não fixado

  1. Prepare uma fatia de cunha como acima (Passos 2-4).
  2. Transfira a fatia para papel de interface (~1 cm2). Sob um microscópio dissecando, localize o CN no lado grosso da fatia.
  3. Remova cuidadosamente o excesso de ACSF da área ao redor da fatia torcendo um canto de um papel de tecido para retirar o ACSF do tecido. Isso evita que a biocittina se espalhe para áreas circundantes da fatia que poderiam levar à absorção em células fora do CN.
  4. Com fórceps finos, selecione um pequeno cristal de biocitna e coloque-o na superfície do CN. Pressione suavemente o cristal no tecido para promover o contato com os neurônios e posterior absorção em somata. Repita esta etapa para cobrir a região de interesse desejada, neste caso regiões CN contendo neurônios T-stellate e GBC.
  5. Coloque a fatia em uma câmara de incubação. Deixe a fatia incubar por 2-4 h a 35 °C para permitir a absorção e o transporte da biocittina. Após a incubação, enxágue a fatia em ACSF para remover quaisquer partículas de biocittina.
  6. Coloque a fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe 3x por 10 min em PBS.
  7. Corte crioproteto em 30% de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C ou até que a fatia afunde.
  8. Ressectar o tecido para produzir seções transversais em um microtome congelante a 70-100 mm.
  9. Tecido de processo usando métodos imunohistoquímicos padrão com um streptavidin fluorescentemente conjugado.
    NOTA: A imunohistoquímica adicional pode ser realizada nas seções se útil para rotular corpos de células pré-sinápticas, axônios, receptores ou outras moléculas sinápticas importantes para a visualização do circuito (ou seja, as etapas primárias de anticorpos não devem afetar negativamente a visualização secundária da biocittina).
  10. Imagem do tecido.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Exame histológico da fatia de cunha
Para nossa investigação da função auditiva do neurônio brainstem, a preparação da fatia de cunha foi projetada para conter a raiz nervosa auditiva e o contralateral CN aos neurônios MOC destinados às gravações (exemplo de fatia mostrada na Figura 1B). O exame histológico inicial da preparação é importante para confirmar que a fatia contém os núcleos necessários para a ativação do circuito e que as projeções axonai...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O procedimento de corte descrito aqui chamado de fatia de cunha é poderoso para manter circuitos neuronais pré-sinápticos intactos, mas com a acessibilidade da experimentação de fatias cerebrais para análise da função neuronal. Deve-se tomar muito cuidado em várias etapas iniciais, a fim de maximizar a utilidade da preparação para a análise do circuito. As dimensões da cunha devem ser confirmadas por meio do exame histológico, que é essencial para a confirmação de que tanto os núcleos pré-sinápticos q...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, NIDCD, Z01 DC0000091 (CJCW).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

Referências

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406(2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018(2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688(2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824(2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Neuroci nciaEdi o 162neur nios olivococleares medialeletrofisiologia de fatias in vitrointegra o sin pticanervo auditivotronco cerebral auditivon cleo coclearneurotransmiss o inibit ria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados