从细胞和组织样本中分离和功能评估人类乳腺癌干细胞

摘要

该实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样品中分离BCSC以及可用于评估BCSC表型和功能的 体外 和 体内 测定。

摘要

乳腺癌干细胞（BCSC）是具有遗传或获得性干细胞样特征的癌细胞。尽管它们的频率很低，但它们是乳腺癌发生、复发、转移和治疗耐药性的主要贡献者。了解乳腺癌干细胞的生物学必须确定治疗乳腺癌的新治疗靶点。乳腺癌干细胞是根据独特的细胞表面标志物（如CD44、CD24）和醛脱氢酶（ALDH）的酶活性）的表达进行分离和表征的。这些 ALDH^高CD44⁺CD24^- 细胞构成了 BCSC 群体，可通过荧光激活细胞分选 （FACS） 进行下游功能研究。根据科学问题，可以使用不同的 体外 和 体内 方法来评估BCSC的功能特征。在这里，我们提供了一个详细的实验方案，用于从乳腺癌细胞的异质群体以及从乳腺癌患者获得的原发性肿瘤组织中分离人类BCSC。此外，我们还重点介绍了下游体 外 和 体内 功能测定，包括集落形成测定、乳腺球测定、3D 培养模型和可用于评估 BCSC 功能的肿瘤异种移植测定。

引言

了解人类乳腺癌干细胞（BCSC）的细胞和分子机制对于解决乳腺癌治疗中遇到的挑战至关重要。BCSC概念的出现可以追溯到21^世纪初，当时发现少量CD44 ⁺ CD24^-/低乳腺癌细胞能够在小鼠中产生异质肿瘤^1，2。随后，观察到具有高酶活性的醛脱氢酶（ALDH^高）的人乳腺癌细胞也表现出类似的干细胞样性质³。这些BCSC代表能够自我更新和分化的细胞群，有助于本体肿瘤的异质性1，^2，3。越来越多的证据表明，进化保守信号通路的改变推动了BCSC的存活和维持⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，¹²，^13，14.此外，细胞外在微环境已被证明在决定不同的BCSC功能中起着关键作用¹⁵，^16，17。这些分子途径和调节BCSC功能的外部因素有助于乳腺癌复发，转移¹⁸和对治疗耐药性的发展¹⁹，²⁰，²¹，治疗后BCSC的残留存在对乳腺癌患者的总体生存构成重大挑战^22，23.因此，这些因素的临床前评估对于确定BCSC靶向疗法非常重要，这些疗法可能有利于实现更好的治疗结果和提高乳腺癌患者的总生存期。

几种体外人乳腺癌细胞系模型和体内人异种移植模型已被用于表征BCSCs24，^25，26，27，^28，29。细胞系在每次连续传代后不断重新填充的能力使其成为进行基于组学和药物基因组学研究的理想模型系统。然而，细胞系通常无法概括在患者样本中观察到的异质性。因此，用患者来源的样本补充细胞系数据非常重要。以最纯净的形式分离BCSC对于实现BCSC的详细表征非常重要。 实现这种纯度取决于BCSC特有的表型标记的选择。 目前，ALDH^高CD44⁺CD24^- 细胞表型最常用于使用荧光活化细胞分选 （FACS） 从大量乳腺癌细胞群中区分和分离人 BCSC，以获得最大纯度^1，3，26.此外，可以使用体外和体内技术评估分离的BCSCs的特性，例如自我更新，增殖和分化。

例如，体外集落形成测定可用于评估单个细胞在不同治疗条件下自我更新以形成50个或更多细胞集落的能力³⁰。乳腺球测定也可用于评估乳腺癌细胞在锚定非依赖条件下的自我更新潜力。该测定法测量单细胞在无血清非贴壁培养条件下每次连续传代时以球体（BCSC 和非 BCSC 的混合物）生成和生长的能力³¹。此外，三维（3D）培养模型可用于评估BCSC功能，包括细胞-细胞和细胞-基质相互作用，这些相互作用密切概括了体内微环境，并允许研究潜在的BCSC靶向疗法的活性³²。尽管体外模型的应用多种多样，但仅使用体外测定很难模拟体内条件的复杂性。这一挑战可以通过使用小鼠异种移植模型来评估体内BCSC行为来克服。特别是，这些模型可作为评估乳腺癌转移³³，研究疾病进展期间与微环境的相互作用34，体内成像³⁵以及预测患者特异性毒性和抗肿瘤药物功效的理想系统³⁴。

该协议详细描述了从大量异质乳腺癌细胞群中以最大纯度分离人ALDH^高CD44 ⁺ CD24-BCSC。我们还详细介绍了三种体外技术（集落形成测定、乳腺球测定和 3D 培养模型）和可用于评估 BCSC 不同功能的体内肿瘤异种移植测定。这些方法适合于有兴趣从人类乳腺癌细胞系或原发性患者来源的乳腺癌细胞和肿瘤组织中分离和表征BCSC的研究人员使用，以了解BCSC生物学和/或研究新的BCSC靶向疗法。

研究方案

直接从同意的乳腺癌患者那里收集患者来源的手术或活检样本是根据机构伦理委员会批准的批准的人类伦理协议进行的。所有用于生成患者来源的异种移植模型的小鼠均被维持并饲养在机构批准的动物设施中。使用小鼠的患者来源的异种移植模型的肿瘤组织是根据机构动物护理委员会批准的批准的伦理方案生成的。

1. 细胞系的制备

1. 在生物安全柜的无菌条件下执行所有细胞培养和染色程序。使用无菌细胞培养皿/烧瓶和试剂。
2. 在补充有胎牛血清（FBS）和每个细胞系特异性的必要生长因子的定义培养基中用5%CO₂ 将人乳腺癌细胞维持在37°C。
3. 将小鼠NIH3T3成纤维细胞培养物（用于集落形成测定）保持在37°C，在补充有10%FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中含有5%CO₂ 。
4. 对于所有培养物，每 2-3 天用新培养基补充旧培养基。一旦培养物达到75-80%汇合度，传代培养到多个无菌细胞培养瓶中。

2.乳腺癌肿瘤组织的制备

1. 根据机构伦理委员会批准的人类伦理协议，直接从同意的乳腺癌患者中收集患者来源的手术或活检样本。
2. 随后，根据机构动物护理委员会批准的动物伦理协议，使用小鼠从患者来源的异种移植模型中收集和生成肿瘤组织。
3. 在无菌条件下将所有肿瘤组织收集到含有 50 mL DMEM:F12 培养基的 30 mL 无菌锥形管中，保持在冰上，并在收集后 2 小时内按下述方式处理样品。

3. 乳腺癌细胞单细胞悬液的产生

1. 从含有60-80%汇合的单层乳腺癌细胞（选择细胞系）的烧瓶中吸出培养基。用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。吸出PBS并加入适当的细胞解离溶液（例如，胰蛋白酶:EDTA;刚好足以覆盖单层细胞），并在室温（推荐）或37°C下孵育5分钟。
2. 加入 5 mL 培养基以中和细胞解离溶液的活性。
3. 将所得解离的细胞溶液转移到50 mL锥形管中，并以1000 x g 离心5分钟。
4. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 5 mL 的 1x PBS 中。使用血细胞计数器和显微镜计数细胞。
   注意:观察血细胞计数器中的细胞聚集。如果未形成单细胞悬液，则重复细胞解离步骤。
5. 细胞计数后，以 1000 x g 重新离心细胞悬液 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 ALDH 底物缓冲液中，浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。

4. 从组织样本中产生单细胞悬液

1. 使用纵横交错技术用手术刀片切碎肿瘤组织，以获得约 1 毫米大小的较小碎片。将组织碎片转移到含有 10 mL 解离缓冲液（DMEM:F12 中的 1X 胶原酶）的新鲜 50 mL 锥形管中。用封口膜密封锥形管，并在37°C下在摇床培养箱中孵育40分钟。
   注意:如果没有摇床培养箱，请将管放入37°C水浴中，每5-10分钟涡旋一次管。
2. 通过将样品以530 x g 离心5分钟来沉淀消化的组织。弃去上清液并加入5mL胰蛋白酶。使用 1 mL 移液器（设置为 750 μL 标记）上下移液以破坏沉淀并在 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。孵育后，剧烈上下移液以释放单个细胞。
3. 用 DMEM:F12 培养基将管中的总体积加满至 25 mL，并以 1000 x g 离心 5 分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于 1 mL 分散酶-DNase 溶液中。在37°C水浴中孵育5分钟。
4. 用 PBS 将管中的总体积加满至 10 mL。通过上下移液混合，将所得细胞悬液通过连接到新鲜 50 mL 锥形管的 40 μm 细胞过滤器。以1000× g 离心5分钟。
5. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 5 mL 的 1x PBS 中。计数细胞并按照步骤3.4和3.5中所述完成细胞悬液的制备。

5. 乳腺癌干细胞的分离

1. 标记用于未染色对照、单细胞染色对照（DEAB 对照、ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7、7AAD）、阴性对照管（用 DEAB、CD44-PE、CD24-PE-Cy7 和 7AAD 染色）、荧光减一 （FMO） 对照和"分选"管（用 ALDH、CD44、CD24 和 7AAD 染色）的流管。
2. 将步骤3.5或步骤4.5的500μL（0.5 x 10⁶ 个细胞）的细胞悬液转移到仅标记细胞CD44，CD24和7AAD的每个管中。将试管放在冰上直至使用。
3. 将 2 mL 样品（2 x 10⁶ 个细胞）转移到相应的"ALDH"试管中。将 5 μL DEAB 加入"DEAB 对照"和"阴性对照"管中，并盖紧。将 10 μL ALDH 底物加入"ALDH"试管中，通过涡旋充分混合，并立即将 500 μL 转移到相应的"DEAB 对照"和"阴性对照"试管中。回顾"DEAB对照"，"阴性对照"和"ALDH管"，并在37°C孵育30-60分钟（不要超过60分钟）。
   注意:最佳孵育时间可能需要优化，具体取决于细胞系。始终保护 ALDH 活性基材和含有染色细胞的试管免受光照。
4. 孵育后，将所有样品以250× g离心5分钟。将细胞重悬于 500 μL ALDH 底物缓冲液中。加入制造商推荐或用户优化浓度的抗CD44-PE和抗CD24-PE-Cy7抗体混合物，并在4°C孵育30分钟。将抗 CD44-PE 和抗 CD24-PE-Cy7 抗体添加到相应的"CD44"和"CD24"标记的试管中。
5. 孵育后，将所有样品以250 x g 离心5分钟。将细胞重悬于 500 μL ALDH 底物缓冲液中。将"阴性对照"管，"分选管"和"7ADD"管与7AAD（建议浓度:0.25μg/ 1 x 10⁶ 个细胞）在冰上孵育10分钟。
   注意:在绿色荧光通道中检测到 ALDH 活性，因此应使用具有不同兼容发射光谱的荧光染料。如果在多参数流式细胞术中观察到光谱重叠，则应使用单色对照和FMO对照作为指导，以允许荧光染料之间进行补偿，以最大程度地减少荧光信号溢出到其他通道。
6. 在FACS仪器上设置分析协议，为样品分析做准备。创建散点图（前向散射与侧向散射、前向散射与荧光通道）。
7. 使用未染色的对照，调整光电倍增管以从整个细胞群中分离碎片，并调整荧光电压以将整个细胞群移动到第一个对数刻度（10¹）。使用DEAB对照，通过调整绿色荧光电压通道，在第二个对数刻度（10²）内移动整个细胞群。
8. 首先分析所有单染色对照（ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7）和7AAD和FMO对照，调整电压以将染色细胞与未染色细胞分离，并最大限度地减少荧光信号溢出到其他通道。
9. 对每个染色细胞样品的阳性群体进行门控。使用阴性对照管，对活性（7AAD阴性）、ALDH^低 细胞群和ALDH^高 细胞群进行门控（代表性门控策略如图 1B所示）。
10. 分析感兴趣的多参数染色样品以分离BCSC。 使用活的ALDH^低门和ALDH^高门，分别选择CD44 ⁺ CD24^-（BCSC）和CD44-CD24 ⁺（非BCSC）细胞群（图1B）。
11. 在无菌收集管中的收集培养基中收集活的BCSC和非BCSC（来自 图2A&B所示的两个代表性细胞系的群体）。如下所述，使用分选的细胞进行下游 体外 和 体内 测定。
    注意:除了下面描述的 体外 和 体内 测定外，还可以通过标准免疫印迹技术测量多能标志物（如SOX2，OCT4和NANOG）的表达来验证BCSC。

图 1:用于从乳腺癌细胞系和组织样本中分离 BCSC 的 FACS 门控策略。 （A）描述BCSC隔离程序的流程图。（B）代表性FACS图，显示了用于从异质细胞池中分离活的BCSC和非BCSC的分类策略。MDA-MB-231人乳腺癌细胞同时与7-AAD，CD44-APC，CD24-PE和ALDH底物标记。在FACS机器上使用四色方案分离细胞亚群。根据预期的光散射选择细胞，然后选择单线细胞，并根据7-AAD排除选择活力。然后分析细胞的 ALDH 活性，并选择前 20% 最阳性的细胞作为 ALDH^高群体，而底部 20% 具有最低 ALDH 活性的细胞被认为是^低 ALDH。最后，根据CD44低^/-CD24⁺表型进一步选择50%的ALDH^低细胞，根据CD44⁺CD24^-表型选择50%的ALDH^高细胞。该图改编自Chu等人¹⁷。请点击此处查看此图的大图。

图2:BCSCs的比例在不同的乳腺癌细胞系中是可变的。 代表性图像显示了（A）SUM159和（B）MDA-MD-468三阴性乳腺癌细胞系中BCSC和非BCSC的差异比例，如图 1所示进行标记和分类。 请点击此处查看此图的大图。

6. 菌落形成测定

1. 将感兴趣的细胞（步骤5.11中的分选细胞或步骤3.5或4.5中的未分选细胞）重悬于完整的培养基中。
2. 标记三个流管，分别用于 1 x 10 2、2 x 10 2 和 5 x 10^{2 细胞}。加入 2 mL 完整培养基，并在相应的管中转移适当的细胞数（从步骤 5.11 分选或从步骤 3.5 或 4.5 分选的未分选细胞）。通过上下移液5次彻底混合细胞溶液。
3. 将细胞接种在6孔板中，并通过轻轻旋转板来分配细胞悬液以获得均匀的细胞分布。
4. 将板在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育直至出现菌落（其中菌落= ≥每个菌落50个细胞）。每周两次仔细补充培养基，不要干扰菌落形成。
5. 吸出培养基并用 1 mL PBS 洗涤一次。向每个孔中加入 0.5 mL 的 0.05% 结晶紫溶液，并将板孵育 30 分钟。用 2 mL 水洗涤去除多余的结晶紫污渍。重复洗涤步骤，直到去除背景染色。
6. 使用4倍和10倍放大倍率的显微镜，计数并记录产生的菌落总数（代表性图像如图 3A所示）。
7. 计算集落形成的频率如下:频率（%）=（#形成的菌落/接种的细胞数）x 100。例如，如果从 1 x 10² 个细胞产生 25 个菌落，则菌落形成的频率为 Frequency = （25/100） x100 = 25%。
8. 或者，将步骤6.1至6.4替换为涉及与成纤维细胞共培养的替代方法，该方法通过产生必要的生长和存活因子为BCSC提供微环境支持。
9. 预涂细胞 60 mm 培养皿，含有 I 型牛胶原蛋白（3 mg/mL 胶原蛋白稀释度为 1/30）。让胶原蛋白在37°C培养箱中聚合30分钟。吸出未聚合的胶原蛋白，并用1x PBS洗涤板两次。用 1 mL PBS 覆盖胶原蛋白包被的板，并在室温下放在一边直至使用。
10. 标记 1 x 10 3、5 x 10³ 和 1 x 10⁴ 细胞的三个流管。加入 4 mL 菌落形成测定培养基，并将适当数量的细胞（从步骤 5.11 分选或从步骤 3.5 或 4.5 分选的未分选细胞）转移到相应的管中。加入照射的小鼠NIH3T3成纤维细胞（4 x 10⁴细胞/ mL培养基）。通过上下移液 5 次彻底混合细胞溶液。
11. 从步骤6.1中的胶原蛋白包被的培养皿中吸出PBS，并按照步骤6.3中所述将细胞混合物接种到每个细胞培养板上。
12. 将板在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育，并使其不受干扰7-10天或直到菌落形成，而不补充培养基。计数并记录如步骤6.6和6.7中所述产生的菌落总数。

7. 乳腺球测定

1. 将感兴趣的细胞（步骤5.11中的分选细胞或步骤3.5或4.5中的未分选细胞）重悬于完整的乳腺培养基中，并以5 x 10² 细胞/ cm² 面积的接种密度将细胞板重悬在96孔超低附着细胞培养板中。
   注意:细胞接种密度应针对不同的细胞系进行优化。
2. 将培养板在含有5%CO₂的37°C培养箱中孵育5-10天。每周两次仔细补充培养基，不要干扰乳腺球的形成。
3. 孵育后，使用显微镜计算每个孔中产生的乳腺球的数量;其中乳腺球定义为直径大于100μm的乳腺癌细胞簇（代表性图像如图 3B所示）。
4. 计算乳腺球形成效率（MFE）如下:MFE（%）=（每孔乳腺球数）/（每孔接种的细胞数）x 100（即，如果孔中的1 x 10² 个细胞产生5个乳腺球，则MFE = （5/100） x 100 = 5%）。
5. 为了传代培养乳腺球，小心地将含有乳腺球内容物的培养基转移到新鲜的50mL锥形管中，并以1000× g 离心培养基5分钟。小心地除去上清液，将细胞沉淀重悬于500μL胰蛋白酶中，并在室温下孵育5分钟。
6. 弃去上清液并将沉淀重悬于 1 mL 完全乳腺球培养基中。使用血细胞计数器计数细胞，并按照步骤7.1所述将细胞重新铺在超低附着细胞培养板中。
   注意:除了亚培养外，FACS还可以进一步分析乳腺球来源的细胞，以评估BCSC表型和/或获得纯BCSC群体以进行其他下游测定。
7. 要确定细胞群中包含的乳腺球起始细胞的数量，请使用涉及球体限制稀释分析 （SLDA） 的替代方法。在 96 孔超低附着细胞培养板中连续稀释高到低细胞数的细胞，最高稀释度导致每孔少于一个细胞。
8. 将培养板在含有5%CO₂ 的37°C培养箱中孵育10-14天，并使其不受干扰以避免细胞聚集。
9. 孵育后，使用显微镜计算每个孔中产生的乳腺球的数量;其中乳腺球被定义为直径大于100μm的乳腺癌细胞簇。使用极限稀释分析 （ELDA） 在线软件 （http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/） 计算球体起始频率和显著性。

8.3D培养模型

1. 根据实验问题，使用基底膜提取物（BME）有或没有生长因子（减少）。为了评估个体生长因子对癌细胞的影响，使用生长因子降低BME。它还有助于最大限度地减少BME中存在的内源性生长因子的非特异性影响。
   注意:BME在10°C以上固化。 即使在解冻步骤中，也始终将BME保持在冰上。
2. 在96孔板中小心地每孔加入50μL的BME，而不会产生气泡，并使其在37°C下聚合1小时。孵育 10 分钟后，加入 100 μL PBS 以避免凝胶层干燥。
3. 将步骤5.11中的分选细胞或步骤3.5或4.5的未分选细胞以5 x 10^3至 5 x 10⁴/200μL的浓度重悬于3D培养基中。
4. 一旦BME聚合，除去PBS，向每个孔中加入200μL细胞悬液，并在含有5%CO₂的37°C培养箱中孵育。将PBS添加到周围的孔中以避免介质蒸发。
   注意:应在设置实验之前确定用于接种的最佳细胞数。根据实验问题，BCSC可以单独培养，也可以与其他细胞类型（成纤维细胞/内皮细胞/免疫细胞等）一起培养。
5. 每周两次向培养板中加入新鲜培养基。在分析类器官的形成之前，将培养物维持10-14天（ 图3C所示的代表性图像）。
6. 对于亚培养，小心吸出培养基并向每个含有细胞的孔中加入 200 μL 分散酶。将板在37°C培养箱中孵育1小时。孵育期（30分钟）进行到一半时，取出板，轻轻上下移液5次，然后放回培养箱中再放置30分钟。
7. 1小时后，将解离的细胞溶液转移到流管中。用含有2%FBS（fPBS）的1x PBS清洗孔，并将其转移到流管中。将管以1000× g 离心5分钟。小心吸出上清液并加入500μL胰蛋白酶，在37°C孵育5分钟。通过加入等量的fPBS灭活胰蛋白酶，并以1000× g 离心5分钟。
8. 弃去上清液并将沉淀重悬于 1 mL 3D 培养基中。计数细胞并重新铺板BME中所需数量的细胞，如步骤8.2至8.4所示。
   注意:可以汇集多个孔以进一步分析或分类感兴趣的细胞群。

图 3:评估 BCSC 细胞功能的 体外 测定。体外 测定按照方案第6.1至6.5（A）、7.1至7.4（B）或81节所述进行。至 8.4 + 8.6 （C）。（A）显示MDA-MB-231人乳腺癌细胞产生的菌落的代表性图像;（B）代表性图像显示MCF7，SUM159或MDA-MB-468人类细胞系以及患者来源的LRCP17乳腺癌细胞形成的乳腺球。（C）代表性图像显示MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞在3D培养模型中形成的3D结构。 请点击此处查看此图的大图。

注意:根据机构动物护理委员会批准的动物伦理协议进行动物实验。

9. 体内 异种移植模型

1. 为了确定乳腺癌干细胞的肿瘤起始能力，使用限制稀释方法制备细胞（步骤5.7中的分类群体或步骤3.5或4.5中的未分类群体）。使用 1 到 5 个不同的稀释组连续稀释 PBS 中的细胞，剂量低至 0.01-0.2 x 10² 个细胞/100 μL，高至 1 x 10⁶ 个细胞/100 μL。
   注意:未排序/整个总体单元格可用作对照。使用的稀释组的数量将取决于所需的科学结果（例如，如果仅测试肿瘤原性，则可以使用1个细胞数较高的组，而在计算肿瘤起始容量时，最好测试5个限制稀释剂量）。
2. 要从人类乳腺癌细胞生成异种移植模型，请使用免疫功能低下的雌性小鼠（无胸腺裸鼠[nu / nu]，非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷[NOD / SCID]或NOD / SCID IL2γ[NGS]菌株）。
   注意:虽然每组至少可以使用4只动物，但建议每组8-12只动物以获得可靠的结果，特别是对于限制稀释分析。
3. 在生物安全柜中的无菌条件下，使用每种细胞制剂的100μL /小鼠进行标准乳腺脂肪垫（MFP）注射。
   注意:为了获得最佳的乳腺肿瘤生长和自发转移到远处器官，建议使用胸部多功能一体机。或者，也可以使用腹股沟多功能一体机。
4. 注射后，每天监测小鼠的一般健康状况和注射部位的肿瘤生长。检测到可触及的肿瘤后，开始用卡尺在两个垂直维度上测量肿瘤大小，并每周记录直到终点。
   注意:实验终点是根据机构动物伦理协议规定的法规确定的;通常，一旦肿瘤体积达到1500mm³，通常需要安乐死结束。对于BCSC群体和/或更高剂量的细胞（例如>1 x 104个细胞），该终点可能会在MFP注射后4-8周内达到。对于非常低的细胞剂量和/或非BCSC细胞群，应允许肿瘤生长在注射后长达8个月。
5. 从这些测量中，使用以下公式计算肿瘤体积:mm³ = 0.52 x （宽度）² x 长度。如果使用限制稀释方法，请使用ELDA在线软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）计算肿瘤起始容量和意义。
6. 或者，为了人道地延长终点，手术切除原发性肿瘤并继续监测小鼠的健康和/或远处器官自发转移的发展。使用切除的肿瘤组织生成连续异种移植。
7. 在终点，从原发肿瘤和远处器官（淋巴结，肺，肝，脑，骨）中收获组织并进行组织病理学和/或免疫组织化学分析或解离肿瘤组织并用于第6-8节所述的体外测定。

结果

所描述的方案允许从异质的乳腺癌细胞群中分离人BCSC，无论是来自细胞系还是从解离的肿瘤组织中。对于任何给定的细胞系或组织样品，产生均匀的单细胞悬液以最大纯度分离BCSC至关重要，因为污染的非BCSC群体可能导致不同的细胞反应，特别是如果研究目的是评估靶向BCSC的治疗剂的功效。 应用严格的分选策略将最大限度地减少污染非BCSC的存在，并导致收集乳腺癌细胞比例的能力具有干细胞样?...

讨论

乳腺癌转移和对治疗的抵抗已成为全世界妇女死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（BCSC）亚群的存在有助于增强转移26，43，44，45，⁴⁶和治疗耐药^性21，^47，48。因此，未来治疗的重点应旨在根除BCSC以达到更好?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD)	BD	51-68981E	suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone	Fisher	A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate	Stemcell Technologies	1700	Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME)	Corning	354234	Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well	Corning	877218
Cell culture plates: 60mm	Corning	353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment	Corning	3474
Cell strainer: 40 micron	BD	352340
Collagen	Stemcell Technologies	7001	Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase	Sigma	11088807001	1x
Conical tubes: 50 mL	Fisher scientific	05-539-7
Crystal violet	Sigma	C6158	Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase	Stemcell Technologies	7913	5U/mL
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse	Sigma	D5052	0.1 mg/mL final concentration
FBS	Avantor Seradigm Lifescience	97068-085
Flow tubes: 5ml	BD	352063	Polypropylene round-bottom tubes
Methanol	Fisher	84124
mouse anti-Human CD24 antibody	BD	561646	R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody	BD	555479	R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stemcell Technologies	1700	Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS	Wisent Inc	311-425-CL	1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Mammosphere Media Composition
B27	Gibco	17504-44	1x
bFGF	Sigma	F2006	10 ng/mL
BSA	Bioshop	ALB003	04%
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	20 ng/mL
Insulin	Sigma	16634	5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301	Tocris	2939	500 nM
B27	Gibco	17504-44	1x
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	5 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMax	Invitrogen	35050-061	1x
HEPES	Gibco	15630-080	10 mM
N-acetylcysteine	Sigma	A9165	1.25 mM
Neuregulin β1	Peprotech	100-03	5 nM
Nicotinamide	Sigma	N0636	5 mM
Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
R-spondin3	R&D	3500	250 ng/mL
SB202190	Sigma	S7067	500 nM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM