测量生物控制产品的挥发性和非挥发性抗真菌活性

摘要

我们描述了一种基于阿加的改进方法，旨在量化植物衍生产品的抗真果效应。可通过本议定书评估对抗真果活动的挥发性和非挥发性贡献。此外，在一项实验设置中，可在关键发育阶段测量对真菌的疗效。

摘要

所述协议基于插头传输技术，可准确确定微生物数量及其发育阶段。特定数量的孢子分布在阿加板上。这种阿加板的孵育期为一定时期，使真菌达到预期的发展阶段，但不需要孵化的孢子除外。下一步，由孢子、催眠或菌斑覆盖的 Agar 插头将被提取并转移到含有抗真菌化合物的 agar 介质中，以测试放置在离真菌或接触的距离。此方法适用于测试液体提取物和固体样品（粉末）。它特别适合量化挥发性和非挥发性制剂在生物活性混合物中的相对贡献，并确定其影响，特别是对孢子、早期催眠和菌精的影响。

该方法与生物控制产品，特别是植物衍生产品抗真菌活性的定性具有高度相关性。事实上，对于植物处理，结果可用于指导应用模式的选择和建立触发阈值。

引言

全球水果和蔬菜损失可能^{高达产量的}50%，主要由于田间或收获后储存^2，3的真菌变质造成的食物腐烂，尽管自²⁰世纪4世纪中叶以来大量使用合成杀菌剂。正在重新考虑使用这些物质，因为它对环境和健康构成严重危害。由于这些药物的有害后果正在整个生态系统中显现出来，而且潜在的健康影响的证据已经累积了^5，6，新的替代旧的预防策略正在开发用于收获前和收获后治疗^7，8，9。因此，我们面临的挑战是双重的。新的杀菌策略首先必须保持食品保护对植物病原体的功效水平，其次，有助于大幅减少农业做法的环境足迹。为了实现这一雄心勃勃的目标，在植物进化的自然防御的启发下，提出了战略，因为超过1000种植物因其抗^菌特性而得到强调。例如，开发天然杀菌剂对抗植物病原体的植物是探索开发新的生物控制产品^{的新资源。}精油是这类的旗舰分子。例如，Origanum精油保护番茄植物免受¹⁰号温室的灰霉菌的侵害，而Solideago甘蔗剂L.和卡西亚精油已被证明可以保护收获后的草莓免受灰霉菌的损害11，12。这些例子说明，生物控制，特别是植物衍生产品，是一种结合了生物功效和环境可持续性的解决方案。

因此，植物是作物保护行业潜在利益分子的重要资源。然而，只有少数植物产品被建议用作生物控制产品，即使它们被普遍认为是安全的，非植物毒性和环保^的2。观察到从实验室到现场的转换存在一些困难，例如在体内^2、9中应用后疗效降低。因此，提高实验室测试的能力以更好地预测现场效果变得非常重要。在这方面，植物衍生产品的抗真果测试方法对于评估其抗真果效果和确定其最佳使用条件都是必要的。具体来说，生物控制产品通常不如化学杀菌剂有效，因此更好地了解其作用模式对于提出适当的配方、确定在田间的应用模式以及确定病原体的哪个发育阶段容易受到候选生物制品的影响非常重要。

目前处理抗菌和抗真菌活动的方法包括扩散方法，如阿加盘扩散、稀释、生物电图和流动细胞测量¹³.这些技术中，更具体地说，标准的抗真菌易感性测试（agar-磁盘扩散和稀释检测）非常适合评估液体悬浮剂中细菌和真菌孢子上可溶性化合物的抗菌活性¹⁴.然而，这些方法通常不适合测试固体化合物，如干植物粉末或量化在霉菌生长期间的抗真菌活性，因为它们需要孢子稀释或孢子在阿加板上传播和/或稀释抗真菌化合物¹³.在食物中毒方法中，含有抗真菌剂的阿加板接种了直径为5-7毫米的磁盘，从7天老真菌培养物中采样，而不考虑启动菌的精确数量。孵化后，抗真菌活性被确定为径向生长抑制的百分比^17,18,19.通过这种方法，我们可以评估我天体生长的反真菌活动。相比之下，进行阿加稀释法可以确定直接接种含有抗真菌化合物的阿加板表面孢子上的抗真菌活性^13,20,21.这两种方法在抗真果活动方面具有互补性。然而，这是两种并行使用的独立技术，不能提供准确并排比较孢子和菌体上抗真菌化合物的相对功效^17,20,22 由于启动真菌材料的数量在两种方法中有所不同。此外，植物衍生产品的抗真菌活性往往来自植物合成的抗真菌分子与面对病原体的组合。这些分子包括蛋白质、肽^23,24代谢物具有广泛的化学多样性，属于不同类别的分子，如多酚、三苯、藻类²⁵，葡萄糖素⁸，和有机硫化合物²⁶.其中一些分子在病原体攻击期间挥发性或变挥发性²⁷.这些制剂通常是水溶性差和高蒸汽压力化合物，必须通过水蒸馏作为精油回收，其中一些抗菌活动已经建立²⁸.已开发出蒸汽相介导易感性检测，以测量蒸发和通过蒸汽相迁移后挥发性化合物的抗菌活性²⁹.这些方法基于在距离微生物培养物较远的地方引入抗真菌化合物^{29,30,31,32,33}.在常用的蒸汽相阿加检测中，精油沉积在纸盘上，并放置在培养皿盖的中心，距离细菌或真菌孢子悬架（在 agar 介质上传播）很远。然后以与 agar-磁盘扩散方法相同的方式测量生长抑制区的直径^20,24.还开发了其他方法，以提供对精油的蒸汽相抗真菌性的定量测量，这种测量方法来自计算抑制性蒸汽相介导抗菌活性的肉汤稀释方法³²，或从阿加磁盘扩散检测中提取³¹.这些方法通常特定于蒸汽相活动研究，不适合接触抑制检测。这排除了确定挥发性和非挥发性制剂对复杂生物活性混合物抗真菌活动的相对贡献。

我们开发的定量方法旨在测量干植物粉末对受控孢子数量的抗真菌作用，并生长沉积在阿加介质表面的菌株，以再现植物病变在^{感染植物15} 期间的空中生长，以及相互连接的my天体网络^16。该方法是基于阿加稀释和食物中毒方法的改进实验设置，在同一实验设置中，还允许并排量化挥发性和非挥发性抗真果代谢物的贡献。在这项研究中，该方法以三种特征良好的抗真真药制剂的活动为基准。

研究方案

1. 伊诺库拉准备

1. 在实验之前，铺设5μL的三叶草。SBT10-2018 孢子储存在马铃薯脱糖agar介质（PDA）的4°C，在30°C下孵育4天，定期照射光线，促进锥状形成^42（图1，面板A）。
   注: 特里乔德玛。SBT10-2018已被与木材分离，并作为本研究的模型，以快速生长和容易孢子回收。我们的实验室保存了这种菌株。
2. 恢复锥体（图1，面板A）
   1. 将3 mL的0.05%补间-20放在 三叶草 上。
   2. 使用铲子从锥体中释放锥形;避免压在骨髓上，以防止催眠被撕掉。
   3. 用微皮迅速恢复溶液，以避免它被阿加介质吸收并转移到 15 mL 管中。
   4. 使用测高仪计算孢子总数，并准备包含 3 x 10⁶ 孢子/mL 的溶液。
      注意:必须谨慎执行此步骤，以防止催眠被提取。然后在显微镜下检查孢子制备。最终，对于呈现高度空中和蓬松的菌株，可以添加使用 40μM 过滤器过滤的步骤，以消除残留的菌片。

2. 真菌板制备（图1，面板B）

1. 将 100 μL 的 3 x 10⁶ 孢子/mL 与微皮条放在直径 9 厘米的 Petri 盘上，其中含有 PDA 介质，以获得 4，800 孢子/厘米^2， 相当于 925 孢子/5 mm 直径 agar 插头。
2. 用无菌铲加入直径为 10 克的直径为 2 毫米的玻璃珠，向前和向后移动，平行垂直于操作员的手臂，均匀地将孢子分布在 agar 表面。
3. 将板旋转 90° 并重复旋转运动（如第 2.2 节）;重复这些步骤，直到板已完全旋转。
4. 立即使用板来设置实验，要求孢子或孵育板在30°C为17小时或24小时时，分别早期催眠或骨髓，分别。
   注意:要比较在骨髓插头转移和菌盘转移后测量的反真菌活性，使用无菌钳子，并在孢子扩散后将无菌5毫米纤维素盘随机放置在阿加板表面。

3. 抗真面体化合物制备

1. 植物衍生产品制备:大蒜粉制备
   1. 剥开新鲜大蒜的丁香，用手术刀刀片将丁香切成2-3毫米宽的切片。
   2. 在 40 °C 下将切片空气干燥 2 天。
   3. 使用刀磨机将切片磨碎 3 x 15 秒以获得细粉末。
   4. 使用前将大蒜粉存放在 50 mL 管中，以 4 °C 的速度储存。
      注意:由于大蒜不自封（防止温度敏感抗真菌化合物的降解），使用前用70%乙醇清洁研磨机、手术刀和空气干燥机。
2. 精油制备
   1. 准备 0.5%， 1%， 2.5%， 5% 和 20% 提穆斯低俗是 精油解决方案在 0.5% Tween-80.
   2. 在将其添加到 PDA 介质之前，混合好以形成乳液（参见第 4.2 节）。
3. 卡本达齐姆准备
   1. 称量卡本达齐姆准备200毫克/升乙醇溶液（卡本达齐姆在水中溶性差）。
   2. 在将溶液添加到 PDA 介质之前，在室温下存储溶液（参见第 4.2 节）。
      警告:卡本达齐姆对健康和环境造成危害。处理此产品时，戴上手套和口罩。将其存放在通风空间中。

4. 接触抑制检测

1. 准备含有大蒜粉的阿加板
   1. 准备和高压灭菌PDA介质。
   2. 使用无菌铲将所需的大蒜粉量称重到 50 mL 管中，以获得浓度，浓度一般从 0.25 毫克/mL 到 16 毫克/mL 不等。
   3. 检查手腕内侧介质温度后，添加 10 mL PDA。温度必须尽可能低，以防止敏感分子的降解。理想情况下，这个温度应该是45°C。
   4. 通过将管子倒置以均匀地将粉末分配到 PDA 介质中，小心地同质化。快速将 10 mL 倒入直径为 5 厘米的培养皿中（图 1，面板 C）。
   5. 将培养皿置于室温下，等待，直到凝固。
2. 准备含有精油或卡本达齐姆的阿加板
   1. 将 10 mL 的 PDA 引入 50 mL 管中。检查温度，了解第 4.1.3 节。
   2. 在 PDA 中加入 100 μL 的 Thymus 低俗 精油不同解决方案，以获得 0.005% 、0.01%、0.025% 、0.05% 和 0.2% 的解决方案（见第 3.2.1 节）。
   3. 从 200 毫克/升溶液中添加所需的卡本达齐姆体积，以获取 0.0625-2 毫克/升（参见第 3.3.1 节）的解决方案。
   4. 通过将管子倒置，小心地同质化，快速将 10 mL 倒入直径为 5 厘米的培养皿（图 1，面板 C）中。
   5. 将培养皿置于室温下，等待，直到凝固。
3. 接触抑制检测 （图 1）
   1. 使用直径为 5 毫米的无菌不锈钢管，在培养皿中心绘制一个圆圈，内含 PDA 或 PDA，包括抗真菌化合物。使用无菌牙签（面板 C）处理 agar 圆柱体。
   2. 用一个直径为5毫米的无菌不锈钢管，地块从第2节随机进入真菌板。每板（面板 B）的绘图为 15-20 圈。
   3. 小心地取出由孢子、早期催眠或无菌牙签覆盖的麦片缸，并将插头放入含有 PDA 或 PDA（包括抗真菌化合物（面板 C）的培养皿的空腔中。
   4. 在 30 °C 时将含有孢子的板孵化 48 小时，在含有早期催眠的板上孵化 31 小时，在覆盖着 mycelium（面板 C） 的板上孵化 24 小时。
   5. 测量径向生长的直径，并使用公式（面板 D）计算真菌生长抑制控制百分比
      % 真菌生长抑制 = （C - A/C）* 100
      其中C是PDA介质径向生长的直径，A是含有抗真菌化合物的PDA介质径向生长的直径。
      注意:要比较在菌塞转移和菌斑盘转移后测量的抗真菌活性，使用无菌钳子，将先前沉积在培养皿中心的真菌盘表面（第 2 节注）中，其中含有含有抗真菌化合物的 PDA 或 PDA，并完全按照 agar-插头转移进行

5. 蒸汽-相抑制检测

1. 准备含有大蒜粉的阿加板
   1. 按照第 3.1 节进行。
2. 准备含有精油或卡本达齐姆的阿加板
   1. 按照第3.2节和第3.3节进行。
3. 准备真菌板
   1. 继续按第 2 节进行。
4. 蒸汽相抗真果抑制检测 （图1）
   1. 将 10 mL 的 PDA 介质倒入直径为 5 厘米的培养皿的盖子中，其中含有 10 mL PDA 介质或含有抗真面化合物的 10 mL PDA 介质到菜肴底部。等到室温（面板 C）完全凝固。
   2. 使用 50 mL 离心管作为校准工具，在盖子中心获得一圈 PDA:用无菌铲（面板 C）取出圆圈周围的 PDA。
   3. 用直径为 5 毫米的无菌不锈钢管在 PDA 介质的中心绘制一个圆圈。"用无菌牙签（面板 C）丢弃 agar 缸。
   4. 形成直径为 5 毫米的无菌不锈钢管的插头，随机插入真菌板，如第 4.3.2 节（面板 B）。
   5. 使用无菌牙签，小心地将覆盖着孢子、早期催眠或菌斑的插头从真菌板转移到检测板（面板 C）的盖子中。
   6. 在 30 °C 下孵化，如第 4.3.4 节（面板 C）。
   7. 测量径向生长的直径，并使用第 4.3.5 节（面板 D） 中的公式计算真菌生长抑制百分比。

结果

为了评估定量方法区分不同类型抗真果化合物作用模式的能力，我们比较了三种知名抗真果剂的疗效。卡本达齐姆是一种非挥发性合成杀菌剂，已广泛用于控制^植物中广泛的真菌疾病^39，40。提木斯粗俗精油主要被描述为其抗菌和抗真菌活性，并被用作天然食品防腐剂^41。大蒜粉被选为植物衍生生物制品的模型。传统上，它一直?...

讨论

此处介绍的方法允许评估最小加工植物衍生产品的抗真菌特性。在此协议中，使用 2 mm 玻璃珠实现在 agar 表面上孢子的均质分布。这一步骤要求处理技能正确分配珠子并获得可重复的结果，最终允许比较真菌生长不同阶段的抗真菌效果。我们发现，5毫米玻璃珠或过度旋转，而在传播过程中均质可能导致可变的生长直径。因此，我们建议在实验前进行培训，以掌握孢子分布。此外，当必须测试植物...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 - 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 - 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 - 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/