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Resumen

Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.

Resumen

El protocolo descrito se basa en una técnica de transferencia plug-transfer que permite la determinación precisa de las cantidades de microorganismos y sus etapas de desarrollo. Un número especificado de esporas se extienden en una placa de agar. Esta placa de agar se incuba durante un período definido para permitir que los hongos lleguen a la etapa de desarrollo esperada, excepto para las esporas donde no se requiere incubación. Los tapones de agar cubiertos por esporas, hifas o micelio se retiran y transfieren a continuación a los medios de agar que contienen el compuesto antifúngico para ser probados a distancia de los hongos o en contacto. Este método es aplicable para probar extractos líquidos y muestras sólidas (polvos). Es particularmente adecuado para cuantificar las contribuciones relativas de los agentes volátiles y no volátiles en las mezclas bioactivas y para determinar sus efectos, específicamente en esporas, hifas tempranas y micelio.

El método es altamente relevante para la caracterización de la actividad antifúngica de los productos de biocontrol, en particular los productos derivados de plantas. De hecho, para el tratamiento de plantas, los resultados se pueden utilizar para guiar la elección del modo de aplicación y para establecer los umbrales de activación.

Introducción

Las pérdidas globales de frutas y verduras pueden alcanzar hasta el 50% de la producción1 y resultar principalmente de la descomposición de los alimentos causada por el deterioro de hongos en el campo o durante el almacenamiento posterior a la cosecha2,3,a pesar del amplio empleo de fungicidas sintéticos desde mediados del siglo XX4. El uso de estas sustancias se está reconsiderando, ya que representa graves riesgos ambientales y para la salud. A medida que las consecuencias dañinas de su uso están apareciendo en todos los ecosistemas y la evidencia de posibles impactos en la salud ha acumulado5,6,nuevas alternativas a las viejas estrategias profilácticas se están desarrollando para los tratamientos pre y post-cosecha7,8,9. De ahí que el reto al que nos enfrentamos sea doble. En primer lugar, las nuevas estrategias fungicidas deben mantener los niveles de eficacia de la protección alimentaria contra los fitopatógenos y, en segundo lugar, contribuir a reducir drásticamente la huella ambiental de las prácticas agrícolas. Para cumplir con este ambicioso objetivo, se están proponiendo estrategias inspiradas en las defensas naturales evolucionadas en las plantas, ya que se han destacado más de 1000 especies de plantas por sus propiedades antimicrobianas8. Por ejemplo, las plantas que han desarrollado fungicidas naturales para luchar contra los fitopatógenos son un recurso novedoso para explorar el desarrollo de nuevos productos de biocontrol2. Los aceites esenciales son moléculas emblemáticas de este tipo. Por ejemplo, el aceite esencial origanum protege las plantas de tomate contra el moho gris en invernaderos 10 y se ha demostrado que los aceites esenciales de solidago canadensis L. y cassia preservan las fresas postcosechadas de daños en el moho gris11,12. Estos ejemplos ilustran que el biocontrol y, en particular, los productos derivados de plantas representan una solución que combina eficacia biológica y sostenibilidad ambiental.

Por lo tanto, las plantas son un recurso importante de moléculas de interés potencial para la industria de protección de cultivos. Sin embargo, sólo se ha propuesto que un puñado de productos vegetales se utilicen como productos de biocontrol, aunque generalmente se les reconoce como seguros, no fitotóxicos y respetuosos con el medio ambiente2. Se han observado algunas dificultades en la transposición desde el laboratorio al campo, como la disminución de la eficacia una vez aplicada in vivo2,9. Por lo tanto, se vuelve importante mejorar la capacidad de las pruebas de laboratorio para predecir mejor la eficacia del campo. En este contexto, los métodos de ensayo antifúngicos para productos derivados de plantas son necesarios tanto para evaluar su eficacia antifúngica como para definir sus condiciones óptimas de uso. Específicamente, los productos de biocontrol son generalmente menos eficientes que los fungicidas químicos, por lo que es importante una mejor comprensión de su modo de acción para proponer formulaciones adecuadas, identificar el modo de aplicación en los campos y definir qué etapa de desarrollo del patógeno es vulnerable al bioproducto candidato.

Los enfoques actuales que abordan las actividades antibacterianas y antifúngicas incluyen métodos de difusión como la difusión de agar-disco, dilución, bioautografía y citometría de flujo13. La mayoría de estas técnicas, y más específicamente, las pruebas estándar de susceptibilidad antifúnggica - ensayos de difusión y dilución de disco de agar - están bien adaptadas para evaluar la actividad antimicrobiana de compuestos solubles en esporas bacterianas y fúngicas en suspensiones líquidas14. Sin embargo, estos métodos generalmente no son adecuados para probar compuestos sólidos como el polvo vegetal seco o cuantificar la actividad antifúngica durante el crecimiento del micelio, ya que requieren dilución de esporas o esporas que se extienden en placas de agar y/o dilución de compuestos antifúngicos13. En el método envenenado por alimentos, las placas de agar que contienen el agente antifúngico se inoculan con un disco de 5-7 mm de diámetro muestreado a partir de un cultivo de hongos de 7 días de antigüedad sin tener en cuenta la cantidad precisa de micelio inicial. Después de la incubación, la actividad antifúngica se determina como un porcentaje de la inhibición del crecimiento radial17,18,19. Con este enfoque podemos evaluar la actividad antifúnggica en el crecimiento micelial. Por el contrario, se realiza el método de dilución del agar para determinar la actividad antifúngica en esporas directamente inoculadas en la superficie de la placa de agar que contiene los compuestos antifúngicos13,20,21. Estos dos enfoques dan resultados complementarios sobre la actividad antifúnggica. Sin embargo, se trata de dos técnicas independientes utilizadas en paralelo que no proporcionan una comparación precisa en paralelo de la eficacia relativa de los compuestos antifúngicos en esporas y micelio17,20,22 a medida que la cantidad de material fúngico inicial difiere en los dos enfoques. Además, la actividad antifúngica de un producto derivado de la planta a menudo es el resultado de la combinación de moléculas antifúngicas sintetizadas por las plantas para hacer frente a patógenos. Estas moléculas abarcan proteínas, péptidos23,24, y metabolitos con amplia diversidad química y pertenecientes a diferentes clases de moléculas como polifenoles, terpenos, alcaloïds25, glucosinolatos8, y compuestos de organosulfur26. Algunas de estas moléculas son volátiles o se vuelven volátiles durante el ataque de patógenos27. Estos agentes suelen ser compuestos solubles en agua y de alta presión de vapor que deben recuperarse a través de la destilación de agua como aceites esenciales, algunas de cuyas actividades antimicrobianas han sido bien establecidas28. Se han desarrollado ensayos de susceptibilidad mediada en fase de vapor para medir la actividad antimicrobiana de compuestos volátiles después de la evaporación y migración a través de la fase de vapor29. Estos métodos se basan en la introducción de compuestos antifúngicos a distancia del cultivo microbiano29,30,31,32,33. En el ensayo de agar de fase de vapor comúnmente utilizado, los aceites esenciales se depositan en un disco de papel y se colocan en el centro de la cubierta de la placa De Petri a distancia de la suspensión de esporas bacterianas o fúngicas, que se propaga en medio de agar. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento se mide de la misma manera que para el método de difusión del agar-disco20,24. Se han desarrollado otros enfoques para proporcionar medición cuantitativa de la susceptibilidad antifúngica de la fase de vapor de los aceites esenciales, derivada del método de dilución de caldos a partir del cual se calculó una actividad antimicrobiana mediada en fase de vapor inhibitorio32, o derivado de ensayos de difusión de agar-disco31. Estos métodos son generalmente específicos de los estudios de actividad de fase de vapor y no son apropiados para los ensayos de inhibición de contacto. Esto excluye la determinación de la contribución relativa de agentes volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica de una mezcla bioactiva compleja.

El método cuantitativo que hemos desarrollado tiene como objetivo medir el efecto antifúngico del polvo de planta seca en cantidades controladas de esporas y micelio cultivado depositado en la superficie de un medio de agar para reproducir el crecimiento aéreo de fitopatógenos durante la infección de las plantas15, así como una red micelial interconectada16. El enfoque es una configuración experimental modificada basada en la dilución del agar y los métodos envenenados por alimentos que también permite, en la misma configuración experimental, cuantificar en paralelo la contribución de metabolitos antifúngicos volátiles y no volátiles. En este estudio, el método ha sido comparado con la actividad de tres preparaciones antifúngicas bien caracterizadas.

Protocolo

1. Preparación de Inocula

  1. Antes del experimento, poner 5 μL de Trichoderma spp. Esporas SBT10-2018 almacenadas a 4 °C en medio agar dextrosa de patata (PDA) e incubar durante 4 días a 30 °C con exposición a la luz regular para promover la formación de conidia42 (Figura 1,panel A).
    NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 ha sido aislado de la madera y se utiliza como modelo en este estudio por su rápido crecimiento y facilidad de recuperación de esporas. Esta cepa es preservada por nuestro laboratorio.
  2. Recuperar conidia (Figura 1, panel A)
    1. Poner 3 ml de 0.05% Tween-20 en el micelio de Trichoderma.
    2. Utilice un rastrillo para liberar conidia de conidioforos; evitar presionar hacia abajo en el micelio para evitar que la hipófago sea arrancada.
    3. Recupere la solución rápidamente con un micropipette para evitar que sea absorbida por el medio del agar y transfiérala a un tubo de 15 ml.
    4. Cuente el número total de esporas utilizando un hemociclomómetro y prepare una solución que contenga 3 x 106 esporas/ml.
      NOTA: Este paso debe realizarse cuidadosamente para evitar que se extraigan hifas. La preparación de esporas se comprueba en el microscopio. Eventualmente, para las cepas que presentan micelio altamente aéreo y esponjoso, se puede añadir un paso de filtración usando filtro colador de 40 μM para eliminar el fragmento residual de micelio.

2. Preparación de placas fúngicas(Figura 1,panel B)

  1. Deposite 100 μL de 3 x 106 esporas/ml con un micropipette en una placa Petri de 9 cm de diámetro que contenga PDA medium para obtener 4.800 esporas/cm2 correspondientes a 925 esporas/5 mm de diámetro-enchufe de agar.
  2. Añadir 10 g de cuentas de vidrio de 2 mm de diámetro con una espátula estéril y realizar movimientos hacia adelante y hacia atrás paralelos y perpendiculares al brazo del operador para distribuir uniformemente las esporas en la superficie del agar.
  3. Gire la placa 90° y repita los movimientos giratorios (como en la sección 2.2); repetir estos pasos hasta que la placa se haya girado por completo.
  4. Utilice la placa inmediatamente para configurar experimentos que requieran esporas o incubar las placas a 30 °C durante 17 h o 24 h cuando se necesiten hifas o micelio tempranos, respectivamente.
    NOTA: Para comparar la actividad antifúngica medida después de la transferencia de micolio y la transferencia de disco de micelio, utilice pinzas estériles y coloque discos estériles de celulosa de 5 mm al azar en la superficie de la placa de agar después de la propagación de esporas.

3. Preparación de compuestos antifúngicos

  1. Preparación de productos derivados de la planta: preparación del ajo en polvo
    1. Pelar los dientes de ajo fresco y cortar los clavos en rodajas de 2-3 mm de ancho usando una hoja de bisturí.
    2. Seque al aire las rodajas durante 2 días a 40 °C.
    3. Moler las rodajas durante 3 x 15 segundos usando un molino de cuchillos para obtener un polvo fino.
    4. Guarde el ajo en polvo a 4 °C en tubos de 50 ml antes de usarlo.
      NOTA: Como el ajo no está autoclavado (para evitar la degradación de compuestos antifúngicos sensibles a la temperatura) limpie la amoladora, el bisturí y el secador de aire con un 70% de etanol antes de su uso.
  2. Preparación esencial del aceite
    1. Preparar 0.5%, 1%, 2.5%, 5% y 20% Thymus vulgaris soluciones de aceite esencial en 0.5% Tween-80.
    2. Mezcle bien para formar una emulsión antes de agregarla al medio PDA (ver sección 4.2).
  3. Preparación de carbendazim
    1. Pesar carbendazim para preparar una solución de etanol de 200 mg/L (carbendazim es poco soluble en agua).
    2. Almacene la solución a temperatura ambiente antes de agregarla al medio PDA (ver sección 4.2).
      PRECAUCIÓN: Carbendazim presenta un riesgo para la salud y el medio ambiente. Use guantes y máscara al manipular este producto. Guárdalo en un espacio ventilado.

4. Ensayo de inhibición de contacto

  1. Preparación de platos de agar que contengan ajo en polvo
    1. Preparar y autoclave medio PDA.
    2. Pesar la cantidad deseada de ajo en polvo en un tubo de 50 ml utilizando una espátula estéril, para obtener concentraciones que generalmente van desde 0,25 mg/ml hasta 16 mg/ml.
    3. Añadir 10 ml de PDA después de haber comprobado la temperatura del medio en el interior de la muñeca. La temperatura debe ser lo más baja posible para evitar la degradación de moléculas sensibles. Idealmente, esta temperatura debe ser de 45 °C.
    4. Homogeneice cuidadosamente girando el tubo boca abajo para distribuir uniformemente el polvo en el medio PDA. Vierta rápidamente 10 ml en una placa Petri de 5 cm de diámetro(Figura 1,panel C).
    5. Con la placa De Petri colocada a temperatura ambiente, espere hasta que el agar se solidifique.
  2. Preparación de placas de agar que contengan aceite esencial o carbendazim
    1. Introduzca 10 ml de PDA en un tubo de 50 ml. Compruebe la temperatura en cuanto a la sección 4.1.3.
    2. Añadir 100 μL de las diferentes soluciones de aceite esencial Thymus vulgaris en PDA para obtener soluciones de 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% y 0,2% (ver sección 3.2.1).
    3. Añada el volumen requerido de carbendazim de la solución de 200 mg/L para obtener soluciones que van desde 0,0625-2 mg/L (ver sección 3.3.1).
    4. Homogeneizar cuidadosamente girando el tubo al revés, verter rápidamente 10 mL en una placa Petri de 5 cm de diámetro(Figura 1,panel C).
    5. Con la placa De Petri colocada a temperatura ambiente, espere hasta que el agar se solidifique.
  3. Ensayo de inhibición de contacto (Figura 1)
    1. Con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro, traza un círculo en el centro de las placas Petri que contienen PDA o PDA, incluyendo compuestos antifúngicos. Deseche el cilindro del agar con un palillo estéril (panel C).
    2. Con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro, la parcela gira aleatoriamente en las placas fúngicas de la sección 2. Trazado entre 15-20 círculos por placa (panel B).
    3. Retire cuidadosamente los cilindros de agar cubiertos por esporas, hifas tempranas o micelio con un palillo de dientes estéril y coloque los tapones en el espacio vacío de las placas Petri que contengan PDA o PDA, incluidos compuestos antifúngicos (panel C).
    4. Incubar las placas que contienen esporas durante 48 h a 30 °C, 31 h para las placas que contienen hifas tempranas y, 24 h para las placas cubiertas con micelio (panel C).
    5. Medir el diámetro del crecimiento radial y calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico sobre el control utilizando la fórmula (panel D)
      % inhibición del crecimiento fúngico = (C - A/C)* 100
      donde C es el diámetro del crecimiento radial en PDA medio y A el diámetro del crecimiento radial en el medio PDA que contiene los compuestos antifúngicos.
      NOTA: Para comparar la actividad antifúngica medida después de la transferencia de tapón de micelio y la transferencia de disco de micelio, utilizando pinzas estériles, transfiera un disco de 5 mm de diámetro previamente depositado en la superficie de las placas fúngicas (nota de la sección 2) en el centro de placas Petri que contengan PDA o PDA que contengan compuestos antifúngicos y proceda exactamente en cuanto a la transferencia de enchufe de agar

5. Ensayo de inhibición de fase de vapor

  1. Preparación de platos de agar que contengan ajo en polvo
    1. Proceda como en la sección 3.1.
  2. Preparación de placa de agar que contenga aceite esencial o carbendazim
    1. Proceda como en las secciones 3.2 y 3.3.
  3. Preparación de placas fúngicas
    1. Proceda como en la sección 2.
  4. Ensayo de inhibición antifúngico de fase de vapor (Figura 1)
    1. Vierta 10 ml de medio PDA en la tapa de las placas Petri de 5 cm de diámetro que contengan 10 ml de PDA medio o 10 ml de medio PDA que contenga compuestos antifúngicos en la parte inferior de los platos. Espere hasta la solidificación completa del agar a temperatura ambiente (panel C).
    2. Utilice un tubo centrífugo de 50 ml como herramienta de calibración para obtener un círculo de PDA en el centro de la tapa; retire el PDA alrededor del círculo con una espátula estéril (panel C).
    3. Trace un círculo en el centro del medio PDA colocado en la tapa con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro. Deseche el cilindro del agar con un palillo de dientes estéril (panel C).
    4. Enchufa los tapones de forma con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro al azar en las placas fúngicas como en la sección 4.3.2 (panel B).
    5. Usando un palillo de dientes estéril, transfiera cuidadosamente los enchufes cubiertos con esporas, hifas tempranas o micelio de placas fúngicas a las tapas de las placas de ensayo (panel C).
    6. Incubar a 30 °C como en la sección 4.3.4 (panel C).
    7. Mida el diámetro del crecimiento radial y calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico utilizando la fórmula en la sección 4.3.5 (panel D).

Resultados

Para evaluar la capacidad del método cuantitativo para discriminar el modo de acción de diferentes tipos de compuestos antifúngicos, comparamos la eficacia de tres agentes antifúngicos conocidos. Carbendazim es un fungicida sintético no volátil que ha sido ampliamente utilizado para controlar una amplia gama de enfermedades fúngicas en las plantas39,40. El aceite esencial Thymus vulgaris ha sido descrito en gran medida por su actividad antibacteri...

Discusión

El enfoque presentado aquí permite la evaluación de las propiedades antifúngicas de los productos derivados de plantas mínimamente procesados. En este protocolo, la distribución homogénea de esporas en la superficie del agar se logra utilizando cuentas de vidrio de 2 mm. Este paso requiere habilidades de manejo para distribuir correctamente las cuentas y obtener resultados reproducibles, permitiendo en última instancia la comparación de efectos antifúngicos en diferentes etapas de crecimiento fúngico. Encontram...

Divulgaciones

ninguno

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a Frank Yates por su precioso consejo. Este trabajo fue apoyado por Sup'Biotech.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave-vacuclav 24B+Melag
CarbendazimSigma 378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubesSarstedt72.7061.5 mL
Falcons tubesSarstedt54725450 mL
Five millimeters diameter stainless steel tuberetail store/
Food dehydratorSancustosix trays
Garlic powderOrganic shop
Glass beadsCLOUP65020figure-materials-690 2 mm
Hemocytometer counting cellJeulin713442/
IncubatorMemmert UM40030 °C
Knife millBoschTSM6A013B
Manual cell counterLabboxHCNT-001-001/
Measuring rulerretail store
Microbiological safety cabinetsFASTERFASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
MicropipetteMettler-Toledo17014407100 - 1000 µL
MicropipetteMettler-Toledo1701441120 - 200 µL
MicropipetteMettler-Toledo170144122 - 20 µL
Petri dishSarstedt82-1194500figure-materials-1622 55 mm
Petri dishSarstedt82-1473 figure-materials-1770 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60LabboxEASY-P60-001/
Potato Dextrose AgarSigma 70139-500G
Precision scale-RADWAGGrosseronB126698AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
RakeSarstedt86-1569001/
Reverse microscope AE31E trinocularGrosseronM097917/
Sterile graduated pipetteSarstedt125400110 mL
Thymus essential oilDrugstoreEssential oil 100%
Tips 1000 µL Sarstedt70.762010
Tips 20 µL Sarstedt70.760012
Tips 200 µLSarstedt70.760002
Tooth pickretail store
Trichoderma spp strainStrain of LRPIA laboratory
Tween-20 Sigma P1379-250ML
Tween-80Sigma P1754-1L
TweezersLabboxFORS-001-002/

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