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Resumo

Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

Resumo

O protocolo descrito baseia-se em uma técnica de transferência de plug-plug que permite a determinação precisa das quantidades de microrganismos e seus estágios de desenvolvimento. Um número especificado de esporos estão espalhados em uma placa de ágar. Esta placa de ágar é incubada por um período definido para permitir que os fungos atinjam o estágio de desenvolvimento esperado, exceto para esporos onde a incubação não é necessária. Os plugues ágar cobertos por esporos, hifas ou micélio são retirados e transferidos para a mídia ágar contendo o composto antifúngico a ser testado a uma distância dos fungos ou em contato. Este método é aplicável para testar tanto extratos líquidos quanto amostras sólidas (pós). É particularmente adequado para quantificar as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis em misturas bioativas e para determinar seus efeitos, especificamente sobre esporos, higiais precoces e micélio.

O método é altamente relevante para a caracterização da atividade antifúngica de produtos de biocontrole, notadamente produtos derivados de plantas. De fato, para o tratamento da estação, os resultados podem ser usados para orientar a escolha do modo de aplicação e estabelecer os limiares de gatilho.

Introdução

As perdas globais de frutas e hortaliças podem atingir até 50% da produção1 e resultar principalmente da decadência alimentar causada pela deterioração de fungos no campo ou durante o armazenamento pós-colheita2,3, apesar do amplo emprego de fungicidas sintéticas desde meados do séculoXX 4. O uso dessas substâncias está sendo reconsiderado, pois representa sérios riscos ambientais e à saúde. Como as consequências nocivas de seu uso estão aparecendo em todos os ecossistemas e evidências de potenciais impactos à saúde acumularam5,6, novas alternativas às velhas estratégias profiláticas estão sendo desenvolvidas para tratamentos pré e pós-colheita7,8,9. Por isso, o desafio que enfrentamos é duplo. Novas estratégias fungicidas devem, em primeiro lugar, manter os níveis de eficácia da proteção alimentar contra fitopatógenos e, em segundo lugar, contribuir para reduzir drasticamente a pegada ambiental das práticas agrícolas. Para cumprir esse objetivo ambicioso, estratégias inspiradas nas defesas naturais evoluídas nas plantas estão sendo propostas, pois mais de 1000 espécies de plantas foram destacadas por suas propriedades antimicrobianas8. Por exemplo, plantas que desenvolveram fungicidas naturais para combater fitopatógenos são um novo recurso na exploração do desenvolvimento de novos produtos de biocontrole2. Óleos essenciais são moléculas emblemáticas desse tipo. Por exemplo, o óleo essencial origanum protege as plantas de tomate contra o molde cinza nas estufas 10 e solidago canadensis L. e óleos essenciais cássia têm sido mostrados para preservar morangos pós-colhidos de danos de moldes cinzentos11,12. Esses exemplos ilustram que o biocontrole e, notadamente, os produtos derivados das plantas representam uma solução que combina eficácia biológica e sustentabilidade ambiental.

Assim, as plantas são um importante recurso de moléculas de potencial interesse para a indústria de proteção de culturas. No entanto, apenas um punhado de produtos vegetais foram propostos para serem usados como produtos de biocontrole, embora sejam geralmente reconhecidos como seguros, não fitóxicos e ecológicos2. Algumas dificuldades na transposição do laboratório para o campo têm sido observadas, como a eficácia diminuindo uma vez aplicada in vivo2,9. Assim, torna-se importante melhorar a capacidade dos testes de laboratório para melhor prever a eficácia do campo. Neste contexto, métodos de teste antifúngicos para produtos derivados de plantas são necessários tanto para avaliar sua eficácia antifúngica quanto para definir suas condições ideais de uso. Especificamente, os produtos de biocontrole são geralmente menos eficientes do que fungicidas químicos, por isso uma melhor compreensão de seu modo de ação é importante para propor formulações adequadas, identificar o modo de aplicação nos campos e definir qual estágio de desenvolvimento do patógeno é vulnerável ao bioproduto candidato.

As abordagens atuais que abordam atividades antibacterianas e antifúngicas incluem métodos de difusão, como difusão de disco de ágar, diluição, bioautografia e citometria de fluxo13. A maioria dessas técnicas, e mais especificamente, os testes padrão de suscetibilidade antifúngicos - ensaios de difusão e diluição de ágar-disco - são bem adaptados para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos solúveis em esporos bacterianos e fúngicos em suspensões líquidas14. No entanto, esses métodos geralmente não são adequados para testar compostos sólidos, como pó vegetal seco ou para quantificar a atividade antifúngica durante o crescimento do micélio, pois requerem diluição de esporos ou esporos espalhados em placas de ágar e/ou diluição de compostos antifúngicos13. No método envenenado por alimentos, as placas de ágar contendo o agente antifúngico são inoculadas com um disco de 5-7 mm de diâmetro amostrado de uma cultura de fungos de 7 dias de idade sem considerar a quantidade precisa de micélio inicial. Após a incubação, a atividade antifúngica é determinada como um por cento da inibição do crescimento radial17,18,19. Com essa abordagem podemos avaliar a atividade antifúngica no crescimento micelial. Em contraste, o método de diluição de ágar é realizado para determinar a atividade antifúngica em esporos diretamente inoculados na superfície da placa de ágar contendo os compostos antifúngicos13,20,21. Essas duas abordagens dão resultados complementares sobre a atividade antifúngica. No entanto, estas são duas técnicas independentes usadas em paralelo que não fornecem comparação lado a lado precisa da eficácia relativa dos compostos antifúngicos em esporos e micélio17,20,22 como a quantidade de material fúngico inicial difere nas duas abordagens. Além disso, a atividade antifúngica de um produto derivado de plantas muitas vezes resulta da combinação de moléculas antifúngicas sintetizadas pelas plantas para enfrentar patógenos. Essas moléculas abrangem proteínas, peptídeos23,24, e metabólitos com ampla diversidade química e pertencentes a diferentes classes de moléculas como polifenóis, terpenos, alcaloïds25, glucosinolas8, e compostos organosulfur26. Algumas dessas moléculas são voláteis ou se tornam voláteis durante o ataque de patógenos27. Esses agentes são, na maioria das vezes, compostos solúveis em água e alta pressão de vapor que devem ser recuperados através da destilação da água como óleos essenciais, alguns dos quais atividades antimicrobianas foram bem estabelecidas28. Ensaios de suscetibilidade mediados em fase de vapor foram desenvolvidos para medir a atividade antimicrobiana de compostos voláteis após a evaporação e migração através da fase de vapor29. Esses métodos baseiam-se na introdução de compostos antifúngicos à distância da cultura microbiana29,30,31,32,33. No ensaio ágar comumente usado em fase de vapor, óleos essenciais são depositados em um disco de papel e colocados no centro da tampa da placa de Petri à distância da suspensão de esporos bacterianos ou fúngicos, que é espalhada no meio ágar. O diâmetro da zona de inibição do crescimento é então medido da mesma forma que para o método de difusão do disco de ágar20,24. Outras abordagens foram desenvolvidas para fornecer a medição quantitativa da suscetibilidade antifúngica da fase vapor de óleos essenciais, derivadas do método de diluição do caldo do qual foi calculada uma atividade antimicrobiana mediada por vapor inibitório32, ou derivado de ensaios de difusão de ágar-disco31. Esses métodos são geralmente específicos para estudos de atividade em fase de vapor e não são apropriados para ensaios de inibição de contato. Isso exclui a determinação da contribuição relativa de agentes voláteis e não voláteis para a atividade antifúngica de uma complexa mistura bioativa.

O método quantitativo que desenvolvemos visa medir o efeito antifúngico do pó de plantas secas em quantidades controladas de esporos e micélio cultivado depositado na superfície de um meio de ágar para reproduzir o crescimento aéreo de fitopatógenos durante a infecção das plantas15, bem como uma rede mycelial interconectada16. A abordagem é uma configuração experimental modificada baseada nos métodos de diluição de ágar e alimentos envenenados que também permite, na mesma configuração experimental, quantificação lado a lado da contribuição de metabólitos antifúngicos voláteis e não voláteis. Neste estudo, o método foi avaliado em relação à atividade de três preparações antifúngicas bem caracterizadas.

Protocolo

1. Preparação de inócula

  1. Antes do experimento, estava 5 μL de Trichoderma spp. Os esporos SBT10-2018 armazenados a 4 °C no natural de ágar médio (PDA) e incubam por 4 dias a 30°C com exposição regular à luz para promover a formação conidia42 (Figura 1, painel A).
    NOTA: Trichoderma spp. O SBT10-2018 foi isolado da madeira e é usado como modelo neste estudo para seu rápido crescimento e facilidade de recuperação de esporos. Esta cepa é preservada pelo nosso laboratório.
  2. Recuperar conidia (Figura 1, painel A)
    1. Coloque 3 mL de 0,05% Tween-20 no mycelium Trichoderma.
    2. Use um ancinho para liberar conidia de conidioforos; evite pressionar o micélio para evitar que a hifa seja arrancada.
    3. Recupere a solução rapidamente com uma micropipette para evitar que ela seja absorvida pelo meio ágar e transfira para um tubo de 15 mL.
    4. Conte o número total de esporos usando um hemócito e prepare uma solução contendo 3 x 106 esporos/mL.
      NOTA: Esta etapa deve ser realizada cuidadosamente para evitar que a hifa seja extraída. A preparação do esporo é então verificada sob microscópio. Eventualmente, para cepas que apresentam micélio altamente aéreo e fofo, um passo de filtração usando filtro de coador de 40 μM pode ser adicionado para eliminar fragmento de micélio residual.

2. Preparação de placas fúngicas(Figura 1, painel B)

  1. Deposite 100 μL de 3 x 106 esporos/mL com uma micropipette em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro contendo meio PDA para obter 4.800 esporos/cm2 correspondentes a 925 esporos/5 mm de diâmetro-ágar plug.
  2. Adicione 10 g de contas de vidro de 2 mm de diâmetro com uma espátula estéril e realize movimentos para frente e para trás paralelos e perpendiculares ao braço do operador para distribuir uniformemente os esporos na superfície do ágar.
  3. Gire a placa em 90° e repita os movimentos rotativos (como na seção 2.2); repita estes passos até que a placa tenha sido girada completamente.
  4. Use a placa imediatamente para configurar experimentos que requerem esporos ou incubar as placas a 30 °C por 17 h ou 24 h quando forem necessários hyphae cedo ou micélio, respectivamente.
    NOTA: Para comparar a atividade antifúngica medida após a transferência de plug-de-púlio e a transferência de disco de micélio, use pinças estéreis e coloquem discos de celulose estéreis de 5 mm aleatoriamente na superfície da placa de ágar após a propagação do esporo.

3. Preparação de compostos antifúngicos

  1. Preparação do produto derivado da planta: preparação em pó de alho
    1. Descasque os cravos de alho fresco e corte os cravos em fatias de 2-3 mm de largura usando uma lâmina de bisturi.
    2. Seque as fatias por 2 dias a 40 °C.
    3. Triture as fatias por 3 x 15 segundos usando um moinho de faca para obter um pó fino.
    4. Armazene o pó de alho a 4 °C em tubos de 50 mL antes de usar.
      NOTA: Como o alho não é autoclaved (para evitar a degradação de compostos antifúngicos sensíveis à temperatura) limpe o moedor, o bisturi e o secador de ar com 70% de etanol antes de usar.
  2. Preparação de óleo essencial
    1. Prepare 0,5%, 1%, 2,5%, 5% e 20% Thymus vulgaris soluções de óleo essencial em 0,5% Tween-80.
    2. Misture bem para formar uma emulsão antes de adicioná-la ao meio PDA (ver seção 4.2).
  3. Preparação de carbendazim
    1. Pesar carbendazim para preparar uma solução de etanol de 200 mg/L (carbendazim é mal solúvel em água).
    2. Armazene a solução à temperatura ambiente antes de adicioná-la ao meio PDA (ver seção 4.2).
      ATENÇÃO: O carbendazim apresenta um risco à saúde e ao meio ambiente. Use luvas e máscara ao manusear este produto. Guarde-o em um espaço ventilado.

4. Ensaio de inibição de contato

  1. Preparação de pratos de ágar contendo pó de alho
    1. Prepare e autoclave meio PDA.
    2. Pesar a quantidade desejada de pó de alho em um tubo de 50 mL usando uma espátula estéril, para obter concentrações geralmente variando de 0,25 mg/mL a 16 mg/mL.
    3. Adicione 10 mL de PDA depois de ter verificado a temperatura do meio no interior do pulso. A temperatura deve ser o mais baixa possível para evitar a degradação de moléculas sensíveis. O ideal é que esta temperatura seja de 45 °C.
    4. Homogeneize cuidadosamente girando o tubo de cabeça para baixo para distribuir uniformemente o pó no meio PDA. Despeje rapidamente 10 mL em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro(Figura 1, painel C).
    5. Com a placa de Petri colocada em temperatura ambiente, espere até o ágar se solidificar.
  2. Preparação de placas de ágar contendo óleo essencial ou carbendazim
    1. Introduza 10 mL de PDA em um tubo de 50 mL. Verifique a temperatura quanto à seção 4.1.3.
    2. Adicionar 100 μL das diferentes soluções de Thymus vulgaris óleo essencial no PDA para obter 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% e 0,2% soluções (ver seção 3,2,1).
    3. Adicione o volume necessário de carbendazim da solução de 200 mg/L para obter soluções que variam de 0,0625-2 mg/L (ver seção 3.3.1).
    4. Homogeneize cuidadosamente girando o tubo de cabeça para baixo, despeje rapidamente 10 mL em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro(Figura 1, painel C).
    5. Com a placa de Petri colocada em temperatura ambiente, espere até o ágar se solidificar.
  3. Ensaio de inibição de contato(Figura 1)
    1. Com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro, trace um círculo no centro de placas de Petri contendo PDA ou PDA, incluindo compostos antifúngicos. Descarte o cilindro de ágar usando um palito estéril (painel C).
    2. Com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro, o enredo gira aleatoriamente nas placas fúngicas da seção 2. Plote entre 15-20 círculos por placa (painel B).
    3. Retire cuidadosamente os cilindros de ágar cobertos por esporos, hipófas precoces ou micélio com um palito estéril e coloque os plugues no espaço vazio das placas de Petri contendo PDA ou PDA, incluindo compostos antifúngicos (painel C).
    4. Incubar as placas contendo esporos por 48h a 30 °C, 31 h para as placas contendo higfia precoce e, 24h para as placas cobertas com micélio (painel C).
    5. Meça o diâmetro do crescimento radial e calcule a porcentagem da inibição de crescimento fúngico sobre o controle usando a fórmula (painel D)
      % inibição do crescimento fúngico = (C - A/C)* 100
      onde C é o diâmetro do crescimento radial em médio PDA e A o diâmetro do crescimento radial no meio PDA contendo os compostos antifúngicos.
      NOTA: Para comparar a atividade antifúngica medida após a transferência de plug-de-púlio e a transferência de disco de micélio, usando pinças estéreis, transfira um disco de 5 mm de diâmetro previamente depositado na superfície das placas fúngicas (nota da seção 2) no centro das placas de Petri contendo PDA ou PDA contendo compostos antifúngicos e proceda exatamente quanto à transferência de ágar-plug

5. Ensaio de inibição de fase de vapor

  1. Preparação de pratos de ágar contendo pó de alho
    1. Prossiga como na seção 3.1.
  2. Preparação de placa de ágar contendo óleo essencial ou carbendazim
    1. Prossiga como nos trechos 3.2 e 3.3.
  3. Preparação de placas fúngicas
    1. Prossiga como na seção 2.
  4. Ensaio de inibição antifúngica da fase vapor(Figura 1)
    1. Despeje 10 mL de meio PDA na tampa das placas petri de 5 cm de diâmetro contendo 10 mL de meio PDA ou 10 mL de meio PDA contendo compostos antifúngicos no fundo dos pratos. Aguarde até a solidificação completa do ágar à temperatura ambiente (painel C).
    2. Use um tubo centrífugo de 50 mL como ferramenta de calibração para obter um círculo de PDA no centro da tampa; remova o PDA ao redor do círculo com uma espátula estéril (painel C).
    3. Trace um círculo no centro do meio PDA colocado na tampa com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro. Descarte o ágar-cilindro com um palito estéril (painel C).
    4. Formar plugues com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro aleatoriamente nas placas fúngicas como na seção 4.3.2 (painel B).
    5. Usando um palito estéril, transfira cuidadosamente os plugues cobertos com esporos, higifize precoce ou micélio de placas fúngicas para as tampas das placas de ensaio (painel C).
    6. Incubar a 30 °C como na seção 4.3.4 (painel C).
    7. Meça o diâmetro do crescimento radial e calcule o percentual de inibição do crescimento fúngico usando a fórmula na seção 4.3.5 (painel D).

Resultados

Para avaliar a capacidade do método quantitativo de discriminar o modo de ação de diferentes tipos de compostos antifúngicos, comparamos a eficácia de três agentes antifúngicos conhecidos. Carbendazim é um fungicida sintético não volátil que tem sido amplamente utilizado para controlar uma ampla gama de doenças fúngicas nas plantas39,40. O óleo essencial de timo vulgar foi descrito em grande parte por sua atividade antibacteriana e antifún...

Discussão

A abordagem aqui apresentada permite a avaliação de propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Neste protocolo, a distribuição homogênea dos esporos na superfície do ágar é alcançada utilizando contas de vidro de 2 mm. Esta etapa requer habilidades de manuseio para distribuir corretamente as contas e obter resultados reprodutíveis, permitindo, em última análise, a comparação de efeitos antifúngicos em diferentes estágios de crescimento fúngico. Descobrimos que co...

Divulgações

nenhum

Agradecimentos

Somos muito gratos a Frank Yates por seu precioso conselho. Este trabalho foi apoiado pela Sup'Biotech.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave-vacuclav 24B+Melag
CarbendazimSigma 378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubesSarstedt72.7061.5 mL
Falcons tubesSarstedt54725450 mL
Five millimeters diameter stainless steel tuberetail store/
Food dehydratorSancustosix trays
Garlic powderOrganic shop
Glass beadsCLOUP65020figure-materials-690 2 mm
Hemocytometer counting cellJeulin713442/
IncubatorMemmert UM40030 °C
Knife millBoschTSM6A013B
Manual cell counterLabboxHCNT-001-001/
Measuring rulerretail store
Microbiological safety cabinetsFASTERFASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
MicropipetteMettler-Toledo17014407100 - 1000 µL
MicropipetteMettler-Toledo1701441120 - 200 µL
MicropipetteMettler-Toledo170144122 - 20 µL
Petri dishSarstedt82-1194500figure-materials-1622 55 mm
Petri dishSarstedt82-1473 figure-materials-1770 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60LabboxEASY-P60-001/
Potato Dextrose AgarSigma 70139-500G
Precision scale-RADWAGGrosseronB126698AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
RakeSarstedt86-1569001/
Reverse microscope AE31E trinocularGrosseronM097917/
Sterile graduated pipetteSarstedt125400110 mL
Thymus essential oilDrugstoreEssential oil 100%
Tips 1000 µL Sarstedt70.762010
Tips 20 µL Sarstedt70.760012
Tips 200 µLSarstedt70.760002
Tooth pickretail store
Trichoderma spp strainStrain of LRPIA laboratory
Tween-20 Sigma P1379-250ML
Tween-80Sigma P1754-1L
TweezersLabboxFORS-001-002/

Referências

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