バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

要約

植物由来製品の抗真菌効果を定量化するために設計された修飾寒天ベースの方法について述べています。このプロトコルを通じて、抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性の寄与の両方を評価することができる。さらに、真菌に対する有効性は、単一の実験セットアップの主要な発達段階で測定することができる。

要約

記載されたプロトコルは、微生物の量とその発生段階を正確に決定できるプラグ転送技術に基づいています。指定された数の胞子が寒天プレートに広がる。この寒天プレートは、培養が必要ない胞子を除いて、真菌が期待される発達段階に到達できるように、定義された期間インキュベートされる。胞子、ヒファ、または菌糸体で覆われた寒天プラグは、次に取り出され、試験対象の抗真菌化合物を含む寒天培地に移管され、真菌から離れた場所または接触した状態で配置されます。この方法は、液体抽出物と固体サンプル(粉末)の両方を試験するのに適用可能です。特に、生理活性混合物中の揮発性物質と不揮発性物質の相対的な寄与を定量化し、特に胞子、初期のヒファ、および菌糸体に対するその効果を決定するために適しています。

この方法は、バイオコントロール製品、特に植物由来製品の抗真菌活性の特性評価に非常に関連しています。実際に、植物の処理のために、結果は、アプリケーションのモードの選択を導き、トリガーのしきい値を確立するために使用することができます。

概要

果物や野菜の世界的な損失は、生産¹の最大50%に達することができ、20世紀半ばから合成殺菌剤の広範な雇用にもかかわらず、主に畑や収穫後の貯蔵^中に生じた食の腐敗から生じる^2、3。これらの物質の使用は、深刻な環境および健康上の危険を表すため、再考されています。その使用の有害な結果が生態系全体に現れ、潜在的な健康への影響の証拠が^5、6を蓄積したので、収穫前および収穫後の治療^7、8、9のための古い予防戦略に代わる新しい選択肢が開発されている。したがって、私たちが直面する課題は2倍です。新しい殺菌戦略は、まず、植物病原体に対する食物保護の有効性のレベルを維持し、それに付随して、農業慣行の環境フットプリントを劇的に削減することに貢献しなければならない。この野心的な目標を達成するために、植物で進化した自然防御に触発された戦略は、その抗菌特性⁸のために1000種以上の植物種が強調されているように提案されています。例えば、植物病原体と戦うために天然の殺菌剤を開発した植物は、新しいバイオコントロール製品の開発を探求する新しい資源^である2.エッセンシャルオイルはこのタイプの旗艦分子です。例えば、オリガナム精油は、トマト植物を温室¹⁰およびSolidagoカナデンシスL.およびカシアエッセンシャルオイルの灰色のカビ損傷^11,12から収穫後のイチゴを保存することが示されている。これらの例は、バイオコントロールおよび特に植物由来の製品が生物学的有効性と環境持続可能性を組み合わせた溶液を表していることを示している。

したがって、植物は作物保護産業にとって潜在的な関心の分子の重要な資源である。しかし、一般的に安全で非植物性で環境に優しいと認識されているにもかかわらず、バイオコントロール製品として使用される植物製品はほんの一握りです^。ラボから現場への移調の難点が見られ、一度インビボ^2,9に適用されると効力が低下するなどがある。したがって、現場の有効性をより良く予測するために、ラボテストの能力を向上させることが重要になります。この文脈では、植物由来の製品の抗真菌試験方法は、その抗真菌効果を評価し、使用するための最適な条件を定義するために必要です。具体的には、バイオコントロール製品は一般的に化学殺菌剤よりも効率が悪いので、適切な製剤を提案し、フィールドでの適用様式を特定し、病原体のどの発達段階がバイオ製品候補に対して脆弱かを定義するために、それらの作用様式をよりよく理解することが重要です。

抗菌活動や抗真菌活動に取り組む現在のアプローチには、寒天ディスク拡散、希釈、バイオサイン、フローサイトメトリーなどの拡散法が含まれる¹³.これらの技術のほとんど、より具体的には、標準的な抗真菌感受性試験(寒天ディスク拡散および希釈アッセイ)は、液体懸濁液中の細菌および真菌胞子に対する可溶性化合物の抗菌活性を評価するために十分に適応されている¹⁴.しかし、これらの方法は、一般的に乾燥植物粉末などの固体化合物を試験したり、寒天プレートに広がる胞子希釈または胞子を必要とするため、菌糸体の成長中に抗真菌活性を定量化するには適していません。¹³.食品中毒法では、抗真菌剤を含む寒天プレートを、7日間の古い真菌培養物から採取した直径5~7mmのディスクを、正確な菌糸体の量を考慮せずに接種する。インキュベーション後、抗真菌活性は放射状増殖阻害の割合として決定される^17,18,19.このアプローチにより、菌体成長に対する抗真菌活性を評価することができます。対照的に、寒天希釈法は、抗真菌化合物を含む寒天プレートの表面に直接接種された胞子に対する抗真菌活性を決定するために行われる^13,20,21.これら2つのアプローチは、抗真菌活性に対する相補的な結果を与える。しかし、これらは、胞子と菌糸体上の抗真菌化合物の相対的な有効性の正確な並べて比較を提供しない並列で使用される2つの独立した技術です^17,20,22 開始真菌材料の量は、2つのアプローチで異なります。さらに、植物由来の産物の抗真菌活性は、しばしば、植物によって合成された抗真菌分子の組み合わせから生じる病原体に直面する。これらの分子は、タンパク質、ペプチドを包含する^23,24、および広範な化学的多様性を有し、ポリフェノール、テルペン、アルカロイドなどの分子の異なるクラスに属する代謝産物²⁵、グルコシノレート⁸、および有機硫黄化合物²⁶.これらの分子の一部は、病原体の攻撃中に揮発性または揮発性になる²⁷.これらの薬剤は、ほとんどの場合、精油として水蒸留を通じて回収しなければならない水溶性および高気圧化合物であり、その抗菌活性が十分に確立されている²⁸.気相媒介感受性アッセイは、蒸発後の揮発性化合物の抗菌活性を測定し、蒸気相を介して移動する²⁹.これらの方法は、微生物培養物から離れた抗真菌化合物の導入に基づく^{29,30,31,32,33}.一般的に使用される気相寒天アッセイでは、エッセンシャルオイルを紙ディスクに堆積させ、寒天培地に広がる細菌または真菌胞体懸濁液から遠く離れたペトリ皿のカバーの中央に置かれます。成長阻害のゾーンの直径は、寒天ディスク拡散法と同じ方法で測定されます。^20,24.その他のアプローチは、阻害された気相媒介性抗菌活性を計算したブロス希釈法に由来する精油の気相抗真菌感受性の定量的測定を提供するために開発された³²、または寒天ディスク拡散アッセイに由来する³¹.これらの方法は、一般に気相活性研究に特異的であり、接触阻害アッセイには適さない。これは、複雑な生理活性混合物の抗真菌活性に対する揮発性および不揮発性物質の相対的な寄与の決定を妨げる。

我々が開発した定量法は、乾燥植物粉末が乾燥した植物粉末の制御量の胞子及び成長した菌糸体を寒天培地の表面に付着させ、植物¹⁵ の感染時の植物病原体の空中成長ならびに相互接続された菌網¹⁶に及ぼす抗真菌効果を測定することを目的とする。このアプローチは、寒天希釈法と食品毒法に基づく改変実験セットアップであり、同じ実験セットアップにおいて、揮発性および不揮発性抗真菌性代謝産物の寄与を並べて定量化することもできる。本研究では、この方法は、3つの十分に特徴付けられる抗真菌製剤の活性に対してベンチマークされている。

プロトコル

1. インノクラ製剤

1. 実験の前に、 トリコデルマspp の5μLを置く。SBT10-2018胞子は、4°Cで保存されたジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)で、コニディア形成⁴² を促進するために定期的な光暴露で30°Cで4日間インキュベートする(図1、パネルA)。
   注: トリコデルマspp.SBT10-2018は木材から隔離されており、急速な成長と胞子回収の容易さのためにこの研究のモデルとして使用されています。この株は、我々の研究室によって保存されています。
2. コニディアの回復 (図 1、パネル A)
   1. トリコデルマ菌糸体に0.05%トゥイーン-20の3 mLを置きます。
   2. 熊手を使用してコニジオフォアからコニディアを放出する。ヒファエが引き裂かれるのを防ぐために、菌糸体を押し下げないようにしてください。
   3. 溶液をマイクロピペットで迅速に回収し、寒天培地に吸収され、15 mLチューブに移さないようにします。
   4. ヘモサイトメーターを使用して胞子の総数を数え、3 x 10⁶ の胞子/mLを含む溶液を準備する。
      注: このステップは、ヒファエが抽出されるのを防ぐために慎重に行う必要があります。その後、胞毛の準備を顕微鏡でチェックします。最終的には、高度に空中およびふわふわした菌糸体を提示する株のために、40 μMのストレーナーフィルターを使用してろ過のステップが残った菌糸体の断片を除去するために加えることができる。

2. 真菌プレート調製 (図1、パネルB)

1. PDA培地を含む直径9cmのペトリ皿にマイクロピペットを用いた3 x 10⁶ の胞子/mLの100 μLを堆積し、925の胞子/5mm直径アガープラグに対応する4,800個の胞子/cm² を得る。
2. 無菌ヘラで直径2mmのガラスビーズを10g加え、前方および後方の動きをオペレータの腕に平行かつ垂直に行い、寒天の表面に胞子を均等に分配します。
3. プレートを 90° 回転させて回転させる動きを繰り返します(セクション 2.2 のように)。プレートが完全に回転するまで、これらの手順を繰り返します。
4. 初期のヒファエまたは菌糸体が必要な場合は、すぐにこのプレートを使用して、胞子を必要とする実験を行うか、30°Cで17時間または24時間インキュベートする実験を行ってください。
   注:菌糸体のプラグ移動と菌糸体のディスク移動後に測定された抗真菌活性を比較するには、滅菌ピンセットを使用し、胞子の拡散後に無菌5mmセルロースディスクを寒天プレートの表面にランダムに配置します。

3. 抗真菌化合物製剤

1. 植物由来製品製剤:ニンニク粉末製剤
   1. 新鮮なニンニクのクローブを皮をむき、メスの刃を使用して2〜3mm幅のスライスにクローブをカットします。
   2. 40°Cで2日間スライスを空気乾燥させます。
   3. ナイフミルを使用してスライスを3 x 15秒間粉砕し、細かい粉末を得ます。
   4. 使用前に50mLチューブで4°Cでニンニクパウダーを保管してください。
      注:ニンニクはオートクレーブ(温度感受性抗真菌化合物の劣化を防ぐために)は、使用前に70%エタノールでグラインダー、メス、および空気乾燥機をきれいにします。
2. エッセンシャルオイルの準備
   1. 0.5%、1%、2.5%、5%、20% の胸腺下品 精油溶液を0.5%Tween-80で調製します。
   2. PDA培地に追加する前に、よく混ぜてエマルジョンを形成します(セクション4.2を参照)。
3. カルベンダジン製剤
   1. カルベンダジンを秤量して200mg/Lエタノール溶液を調製する(カルベンダジンは水に難溶性である)。
   2. PDA培地に添加する前に、溶液を室温で保管してください(セクション4.2を参照)。
      注意:カルベンダジンムは健康と環境の危険を提示します。この製品を取り扱う際は、手袋とマスクを着用してください。換気されたスペースに保管してください。

4. 接触抑制アッセイ

1. ガーリックパウダーを含む寒天プレートの調製
   1. PDA培地を準備し、オートクレーブします。
   2. 望ましいニンニクパウダーの量を無菌ヘラを使用して50 mLチューブに計量し、一般的に0.25mg/mLから16mg/mLまでの濃度を得る。
   3. 手首の内側の媒体の温度を確認した後、PDAの10 mLを追加します。感度の高い分子の分解を防ぐために、温度はできるだけ低くする必要があります。理想的には、この温度は45°Cでなければなりません。
   4. 粉末をPDA培地に均等に分配するためにチューブを逆さまにして慎重に均質化します。直径5cmのペトリ皿(図1、パネルC)に10mLを素早く注ぎます。
   5. ペトリ皿を室温に置いて、寒天が固まるまで待ちます。
2. エッセンシャルオイルまたはカルベンダジンムを含む寒天プレートの調製
   1. PDAの10mLを50mLチューブに導入します。セクション4.1.3の温度を確認してください。
   2. PDAにチムス下地性エッセンシャルオイルの異なる溶液の100 μLを加えて、0.005%、0.01%、0.025%、0.05%、0.2%の溶液を得る(セクション3.2.1参照)。
   3. 200 mg/L溶液からカルベンダジンムの必要量を加え、0.0625-2 mg/L の範囲の溶液を得る(セクション3.3.1を参照)。
   4. 管を逆さまにして慎重に均質化し、直径5cmのペトリ皿(図1、パネルC)に10mLを素早く注ぎます。
   5. ペトリ皿を室温に置いて、寒天が固まるまで待ちます。
3. 接触阻害アッセイ (図1)
   1. 直径5mmの無菌のステンレス鋼管を使用して、PDAまたはPDAのいずれかを含むペトリ皿の中央に、抗真菌化合物を含む円をプロットします。無菌爪楊枝(パネルC)を使用して寒天シリンダーを処分する。
   2. 直径5mmの無菌ステンレス鋼管を使用して、セクション2から真菌プレートにランダムに円をプロットします。プレートあたり15~20個の円(パネルB)の間をプロットします。
   3. 胞子、初期のヒファエ、または菌糸体で覆われた寒天シリンダーを滅菌爪楊枝で慎重に引き出し、PDAまたはPDA(パネルC)を含むペトリ皿の空きスペースにプラグを置きます。
   4. 胞子を含むプレートを30°Cで48時間、初期のヒファエを含むプレートに31時間、菌糸体で覆われたプレート(パネルC)に対しては24時間インキュベートします。
   5. 放射状成長の直径を測定し、式を用いて制御に対する真菌増殖阻害の割合を計算する(パネルD)
      % 真菌増殖阻害 = (C - A/C)* 100
      ここでCは、PDA培地における径成長の直径及びAは、抗真菌化合物を含むPDA培地における放射状成長の直径である。
      注:無菌ピンセットを使用して、菌糸体のプラグ転送と菌糸体ディスク移動後に測定された抗真菌活性を比較するには、以前に堆積した5mm直径のディスクを、PDAまたはPDAに抗真菌化合物を含むペトリ皿の中央にある真菌プレートの表面に移し、寒天性プラグの場合とまったく同じように進みます。

5. 気相阻害アッセイ

1. ガーリックパウダーを含む寒天プレートの調製
   1. セクション 3.1 に従って進めます。
2. エッセンシャルオイルまたはカルベンダジンムを含む寒天プレートの調製
   1. セクション3.2と3.3に進みます。
3. 真菌プレートの調製
   1. セクション 2 に進みます。
4. 気相抗真菌阻害アッセイ(図1)
   1. PDA培地の10 mLを、10mL PDA培地または10mLのPDA培地を含むPDA培地を含む直径5cmのペトリ皿の蓋に、食器の底に注ぎます。室温(パネルC)で寒天が完全に固まるまで待ちます。
   2. 蓋の中央にPDAの円を得るために口径測定ツールとして50 mL遠心管を使用してください;無菌ヘラ(パネルC)で円の周りのPDAを取り除きます。
   3. 直径5mmのステンレス鋼管で蓋に入れたPDA媒体の中央に円をプロットします。無菌爪楊枝(パネルC)で寒天シリンダーを捨てます。
   4. セクション4.3.2(パネルB)のように、5 mmの直径の無菌のステンレス鋼管をランダムに真菌プレートに差し込みます。
   5. 滅菌爪楊枝を使用して、真菌プレートから胞子、初期のヒファエ、または菌糸体で覆われたプラグを慎重にアッセイプレート(パネルC)の蓋に移します。
   6. セクション4.3.4(パネルC)のように30°Cでインキュベートする。
   7. ラジアル成長の直径を測定し、セクション4.3.5(パネルD)の式を使用して真菌増殖阻害の割合を計算します。

結果

異なるタイプの抗真菌化合物の作用様式を判別する定量的方法の能力を評価するために、3つの有名な抗真菌剤の有効性を比較した。カルベンダジンは、植物^39、40の真菌疾患の広い範囲を制御するために広く使用されている不揮発性の合成殺菌剤である。胸腺下品精油は、主にその抗菌および抗真菌活性について記載されており、天然食品保...

ディスカッション

ここで提示されるアプローチは、最小限に処理された植物由来の製品の抗真菌特性の評価を可能にする。このプロトコルでは、寒天表面上の胞子の均質な分布は、2mmガラスビーズを使用して達成される。このステップでは、ビーズを適切に配布し、再現性のある結果を得るためのハンドリングスキルが必要であり、最終的には真菌の成長の異なる段階で抗真菌効果の比較を可能にします。5mm?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 - 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 - 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 - 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/