Mesure de l’activité antifongique volatile et non volatile des produits de lutte biologique

Résumé

Nous décrivons une méthode modifiée à base d’agar conçue pour quantifier les effets antifongiques des produits dérivés des plantes. Les contributions volatiles et non volatiles à l’activité antifongique peuvent être évaluées par ce protocole. En outre, l’efficacité contre les champignons peut être mesurée à des stades clés de développement dans une seule configuration expérimentale.

Résumé

Le protocole décrit est basé sur une technique de plug-transfer qui permet une détermination précise des quantités de micro-organismes et de leurs stades de développement. Un certain nombre de spores sont réparties sur une plaque d’agar. Cette plaque d’agar est incubée pendant une période définie pour permettre aux champignons d’atteindre le stade de développement prévu, à l’exception des spores où l’incubation n’est pas nécessaire. Les bouchons d’agar couverts de spores, d’hyphes ou de mycélium sont ensuite retirés et transférés sur des supports d’agar contenant le composé antifongique à tester soit à une distance des champignons, soit en contact. Cette méthode est applicable pour tester à la fois les extraits liquides et les échantillons solides (poudres). Il est particulièrement bien adapté pour quantifier les contributions relatives des agents volatils et non volatils dans les mélanges bioactifs et pour déterminer leurs effets, spécifiquement sur les spores, les hyphes précoces et le mycélium.

La méthode est très pertinente pour la caractérisation de l’activité antifongique des produits de lutte biologique, notamment les produits dérivés des plantes. En effet, pour le traitement des plantes, les résultats peuvent être utilisés pour guider le choix du mode d’application et pour établir les seuils de déclenchement.

Introduction

Les pertes mondiales de fruits et légumes peuvent atteindre jusqu’à 50 % de la production^{1 et} résulter principalement de la décomposition des aliments causée par la détérioration des champignons sur le terrain ou pendant le stockage post-récolte^2,3, malgré l’emploi important de fongicides synthétiques depuis le milieu du XXe siècle⁴. L’utilisation de ces substances est réexaminée puisqu’elle représente de graves risques pour l’environnement et la santé. Comme les conséquences néfastes de leur utilisation se manifestent dans tous les écosystèmes et que des preuves d’impacts potentiels sur la santé^{se sont accumulées 5,6}, de nouvelles alternatives aux anciennes stratégies prophylactiques sont en cours d’élaboration pour les traitements pré et post-récolte^7,8,9. Par conséquent, le défi auquel nous sommes confrontés est double. Les nouvelles stratégies fongicides doivent, premièrement, maintenir les niveaux d’efficacité de la protection alimentaire contre les phytopathogènes et, en même temps, contribuer, deuxièmement, à réduire considérablement l’empreinte environnementale des pratiques agricoles. Pour atteindre cet objectif ambitieux, des stratégies inspirées par les défenses naturelles évoluées dans les plantes sont proposées car plus de 1000 espèces végétales ont été mises en évidence pour leurs propriétés antimicrobiennes⁸. Par exemple, les plantes qui ont développé des fongicides naturels pour lutter contre les phytopathogènes sont une ressource nouvelle dans l’exploration du développement de nouveaux produits de lutte biologique². Les huiles essentielles sont des molécules phares de ce type. Par exemple, l’huile essentielle d’Origanum protège les plants de tomates contre la moisissure grise ^{dans les serres 10} et solidago canadensis L. et cassia huiles essentielles ont été montrés pour préserver les fraises post-récolte de dommages moule^{gris 11,12}. Ces exemples illustrent que le biocontrôle et notamment les produits dérivés des plantes représentent une solution qui combine efficacité biologique et durabilité environnementale.

Ainsi, les plantes sont une ressource importante de molécules d’intérêt potentiel pour l’industrie de la protection des cultures. Toutefois, seule une poignée de produits végétaux ont été proposés pour être utilisés comme produits de lutte biologique, même s’ils sont généralement reconnus comme sûrs, non phytotoxiques et respectueux de^{l’environnement 2}. Certaines difficultés dans la transposition du laboratoire au champ ont été observées, comme la diminution de l’efficacité une fois appliquée in vivo^2,9. Ainsi, il devient important d’améliorer la capacité des tests de laboratoire à mieux prédire l’efficacité sur le terrain. Dans ce contexte, des méthodes d’essai antifongiques pour les produits dérivés des plantes sont nécessaires à la fois pour évaluer leur efficacité antifongique et pour définir leurs conditions optimales d’utilisation. Plus précisément, les produits de lutte biologique sont généralement moins efficaces que les fongicides chimiques, de sorte qu’une meilleure compréhension de leur mode d’action est importante pour proposer des formulations appropriées, pour identifier le mode d’application dans les champs et pour définir quel stade de développement de l’agent pathogène est vulnérable au bioproduit candidat.

Les approches actuelles portant sur les activités antibactériennes et antifongiques comprennent des méthodes de diffusion telles que la diffusion du disque d’agar, la dilution, la bioautographie et la cytométrie des flux.¹³. La plupart de ces techniques, et plus particulièrement, les tests de susceptibilité antifongique standard - analyse de diffusion et de dilution du disque d’agar - sont bien adaptés pour évaluer l’activité antimicrobienne des composés solubles sur les spores bactériennes et fongiques dans les suspensions liquides.¹⁴. Toutefois, ces méthodes ne conviennent généralement pas aux essais de composés solides tels que la poudre de plantes séchées ou à quantifier l’activité antifongique pendant la croissance du mycélium, car elles nécessitent une dilution des spores ou une propagation des spores sur les plaques d’agar et/ou une dilution des composés antifongiques.¹³. Dans la méthode empoisonnée par la nourriture, les plaques d’agar contenant l’agent antifongique sont inoculées avec un disque de 5-7 mm de diamètre échantillonné à partir d’une culture de champignons de 7 jours sans tenir compte de la quantité précise de mycélium de départ. Après incubation, l’activité antifongique est déterminée comme un pourcentage d’inhibition de la croissance radiale^17,18,19. Avec cette approche, nous pouvons évaluer l’activité antifongique sur la croissance mycéliale. En revanche, la méthode de dilution de l’agar est effectuée pour déterminer l’activité antifongique sur les spores directement inoculées à la surface de la plaque d’agar contenant les composés antifongiques^13,20,21. Ces deux approches donnent des résultats complémentaires sur l’activité antifongique. Toutefois, il s’agit de deux techniques indépendantes utilisées en parallèle qui ne permettent pas de comparer côte à côte avec précision l’efficacité relative des composés antifongiques sur les spores et le mycélium.^17,20,22 comme la quantité de matériel fongique de départ diffère dans les deux approches. En outre, l’activité antifongique d’un produit dérivé des plantes résulte souvent de la combinaison de molécules antifongiques synthétisées par les plantes pour faire face à des agents pathogènes. Ces molécules englobent les protéines, les peptides^23,24, et les métabolites ayant une grande diversité chimique et appartenant à différentes classes de molécules telles que les polyphénols, terpènes, alcaloïdes²⁵, glucosinolates⁸, et les composés organosulfurés²⁶. Certaines de ces molécules sont volatiles ou deviennent volatiles lors d’une attaque d’agents pathogènes²⁷. Ces agents sont le plus souvent des composés solubles dans l’eau et à haute pression de vapeur qui doivent être récupérés par distillation de l’eau sous forme d’huiles essentielles, dont certaines activités antimicrobiennes ont été bien établies.²⁸. Des essais de susceptibilité 2métras par phase de vapeur ont été mis au point pour mesurer l’activité antimicrobienne des composés volatils après l’évaporation et la migration par la phase de vapeur²⁹. Ces méthodes sont basées sur l’introduction de composés antifongiques à distance de la culture microbienne^{29,30,31,32,33}. Dans l’analyse couramment utilisée de l’agar en phase de vapeur, les huiles essentielles sont déposées sur un disque de papier et placées au centre de la couverture de la boîte de Pétri à distance de la suspension bactérienne ou fongique des spores, qui se propage sur le milieu de l’agar. Le diamètre de la zone d’inhibition de croissance est ensuite mesuré de la même manière que pour la méthode de diffusion du disque d’agar^20,24. D’autres approches ont été développées pour fournir une mesure quantitative de la susceptibilité antifongique de phase de vapeur des huiles essentielles, dérivée de la méthode de dilution du bouillon à partir de laquelle une activité antimicrobienne ment mentée en phase de vapeur inhibitrice a été calculée³², ou dérivé d’analyses de diffusion de disque d’agar³¹. Ces méthodes sont généralement spécifiques aux études d’activité en phase de vapeur et ne conviennent pas aux essais d’inhibition de contact. Cela empêche la détermination de la contribution relative d’agents volatils et non volatils à l’activité antifongique d’un mélange bioactif complexe.

La méthode quantitative que nous avons développée vise à mesurer l’effet antifongique de la poudre de plantes séchées sur des quantités contrôlées de spores et de mycélium cultivé déposé à la surface d’un milieu d’agar pour reproduire la croissance aérienne des phytopathogènes lors de l’infection^{des plantes 15} ainsi qu’un réseau mycélial interconnecté¹⁶. L’approche est une configuration expérimentale modifiée basée sur la dilution de l’agar et les méthodes empoisonnées par les aliments qui permet également, dans la même configuration expérimentale, la quantification côte à côte de la contribution des métabolites antifongiques volatils et non volatils. Dans cette étude, la méthode a été comparée à l’activité de trois préparations antifongiques bien caractérisées.

Protocole

1. Préparation d’Inocula

1. Avant l’expérience, 5 μL de Trichoderma spp. Spores de SBT10-2018 stockées à 4 °C sur le milieu de l’agar dextrose de pomme de terre (PDA) et incuber pendant 4 jours à 30 °C avec exposition régulière à la lumière pour favoriser la formation de conidies⁴² (figure 1, panneau A).
   NOTE: Trichoderma spp. Le SBT10-2018 a été isolé du bois et est utilisé comme modèle dans cette étude pour sa croissance rapide et sa facilité de récupération des spores. Cette souche est conservée par notre laboratoire.
2. Récupérer conidia (Figure 1, panneau A)
   1. 3 mL de 0,05% de Tween-20 sur le mycélium trichoderma.
   2. Utilisez un râteau pour libérer les conidies des conidiophores; éviter de presser sur le mycélium pour éviter que les hyphes ne soient arrachés.
   3. Récupérez rapidement la solution avec une micropipette pour éviter qu’elle ne soit absorbée par le milieu de l’agar et transfert dans un tube de 15 mL.
   4. Comptez le nombre total de spores à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une solution contenant 3 x^{10 6} spores/mL.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin pour éviter l’extraction des hyphes. La préparation des spores est ensuite vérifiée au microscope. Finalement, pour les souches présentant du mycélium hautement aérien et moelleux, une étape de filtration utilisant un filtre de passoire de 40 μM peut être ajoutée pour éliminer le fragment résiduel de mycélium.

2. Préparation des plaques fongiques( Figure 1, panneau B)

1. Déposer 100 μL de 3 x 10⁶ spores/mL avec une micropipette sur une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre contenant du milieu PDA pour obtenir 4 800 spores/cm² correspondant à une prise de 925 spores/5 mm de diamètre-agar.
2. Ajouter 10 g de perles de verre de 2 mm de diamètre à l’aide d’une spatule stérile et effectuer des mouvements vers l’avant et vers l’arrière parallèles et perpendiculaires au bras de l’opérateur pour répartir uniformément les spores à la surface de l’agar.
3. Faire pivoter la plaque de 90° et répéter les mouvements rotatifs (comme dans la section 2.2); répéter ces étapes jusqu’à ce que la plaque ait été complètement tournée.
4. Utilisez immédiatement la plaque pour mettre en place des expériences nécessitant des spores ou incuber les plaques à 30 °C pendant 17 h ou 24 h lorsque l’hyphae précoce ou le mycélium, respectivement, sont nécessaires.
   REMARQUE : Pour comparer l’activité antifongique mesurée après le transfert de bouchon de mycélium et le transfert de disque de mycélium, utilisez des pinces stériles et placez les disques stériles de cellulose de 5 mm au hasard sur la surface de la plaque d’agar après la propagation des spores.

3. Préparation des composés antifongiques

1. Préparation de produits dérivés des plantes : préparation à l’ail en poudre
   1. Peler les gousses d’ail frais et couper les clous de girofle en tranches de 2 à 3 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel.
   2. Sécher à l’air les tranches pendant 2 jours à 40 °C.
   3. Moudre les tranches pendant 3 x 15 secondes à l’aide d’un moulin à couteaux pour obtenir une poudre fine.
   4. Conserver la poudre d’ail à 4 °C dans des tubes de 50 mL avant utilisation.
      REMARQUE : Comme l’ail n’est pas autoclavé (pour empêcher la dégradation des composés antifongiques sensibles à la température), nettoyez le broyeur, le scalpel et le séchoir à air avec 70 % d’éthanol avant utilisation.
2. Préparation d’huile essentielle
   1. Préparez 0,5%, 1%, 2,5%, 5% et 20% thymus vulgaris solutions d’huile essentielle en 0,5% Tween-80.
   2. Bien mélanger pour former une émulsion avant de l’ajouter dans le milieu PDA (voir la section 4.2).
3. Préparation carbendazim
   1. Pesez le carbendazim pour préparer une solution d’éthanol de 200 mg/L (le carbendazim est mal soluble dans l’eau).
   2. Conservez la solution à température ambiante avant de l’ajouter au milieu PDA (voir la section 4.2).
      MISE EN GARDE : Carbendazim présente un danger pour la santé et l’environnement. Portez des gants et un masque lors de la manipulation de ce produit. Rangez-le dans un espace ventilé.

4. Test d’inhibition de contact

1. Préparation d’assiettes d’agar contenant de la poudre d’ail
   1. Préparer et autoclave PDA moyen.
   2. Peser la quantité désirée de poudre d’ail dans un tube de 50 mL à l’aide d’une spatule stérile, pour obtenir des concentrations généralement allant de 0,25 mg/mL à 16 mg/mL.
   3. Ajouter 10 mL de PDA après avoir vérifié la température du milieu à l’intérieur du poignet. La température doit être aussi basse que possible pour empêcher la dégradation des molécules sensibles. Idéalement, cette température devrait être de 45 °C.
   4. Homogénéisez soigneusement en retournant le tube à l’envers pour répartir uniformément la poudre dans le milieu PDA. Verser rapidement 10 mL dans une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre(figure 1,panneau C).
   5. Avec la boîte de Pétri placée à température ambiante, attendez que l’agar se solidifie.
2. Préparation de plaques d’agar contenant de l’huile essentielle ou du carbendazim
   1. Introduire 10 mL de PDA dans un tube de 50 mL. Vérifiez la température comme pour la section 4.1.3.
   2. Ajouter 100 μL des différentes solutions d’huile essentielle thymus vulgaris en PDA pour obtenir 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% et 0,2% de solutions (voir section 3.2.1).
   3. Ajoutez le volume requis de carbendazim de la solution 200 mg/L pour obtenir des solutions allant de 0,0625-2 mg/L (voir la section 3.3.1).
   4. Homogénéisez soigneusement en retournant le tube à l’envers, versez rapidement 10 mL dans une boîte de Pétri de 5 cm dediamètre (figure 1,panneau C).
   5. Avec la boîte de Pétri placée à température ambiante, attendez que l’agar se solidifie.
3. Test d’inhibition de contact (Figure 1)
   1. Avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre, tracez un cercle au centre des boîtes de Petri contenant soit PDA ou PDA, y compris les composés antifongiques. Disposer du cylindre d’agar à l’aide d’un cure-dent stérile (panneau C).
   2. Avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre, l’intrigue tourne au hasard dans les plaques fongiques de la section 2. Parcelle entre 15-20 cercles par plaque (panneau B).
   3. Retirez soigneusement les cylindres d’agar recouverts de spores, d’hyphes précoces ou de mycélium avec un cure-dent stérile et placez les bouchons dans l’espace vide des plats de Petri contenant soit pda ou PDA, y compris les composés antifongiques (panneau C).
   4. Incuber les plaques contenant des spores pendant 48 h à 30 °C, 31 h pour les plaques contenant des hyphes précoces et 24 h pour les plaques recouvertes de mycélium (panneau C).
   5. Mesurer le diamètre de la croissance radiale et calculer le pourcentage d’inhibition de la croissance fongique sur le contrôle à l’aide de la formule (panneau D)
      % d’inhibition de la croissance fongique = (C - A/C)* 100
      où C est le diamètre de la croissance radiale dans le milieu PDA et A le diamètre de la croissance radiale dans le milieu PDA contenant les composés antifongiques.
      REMARQUE : Pour comparer l’activité antifongique mesurée après le transfert de bouchon de mycélium et le transfert de disque de mycélium, à l’aide de pinces stériles, transférez un disque de 5 mm de diamètre précédemment déposé à la surface des plaques fongiques (note de section 2) au centre des boîtes de Pétri contenant des composés antifongiques et procédez exactement comme pour le transfert de bouchon d’agar

5. Essai d’inhibition de phase de vapeur

1. Préparation d’assiettes d’agar contenant de la poudre d’ail
   1. Procéder comme à l’article 3.1.
2. Préparation d’une plaque d’agar contenant de l’huile essentielle ou du carbendazim
   1. Procéder comme aux sections 3.2 et 3.3.
3. Préparation de plaques fongiques
   1. Procéder comme à la section 2.
4. Test d’inhibition antifongique de phase de vapeur (Figure 1)
   1. Verser 10 mL de milieu PDA dans le couvercle des boîtes De Petri de 5 cm de diamètre contenant 10 mL de PDA moyen ou 10 mL de milieu PDA contenant des composés antifongiques dans le fond de la vaisselle. Attendez la solidification complète de l’agar à température ambiante (panneau C).
   2. Utilisez un tube centrifuge de 50 mL comme outil d’étalonnage pour obtenir un cercle de PDA au centre du couvercle; retirer le PDA autour du cercle à l’aide d’une spatule stérile (panneau C).
   3. Tracez un cercle au centre du milieu PDA placé dans le couvercle avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre. Jeter le cylindre d’agar à l’aide d’un cure-dent stérile (panneau C).
   4. Formez des bouchons avec un tube stérile en acier inoxydable de 5 mm de diamètre au hasard dans les plaques fongiques comme dans la section 4.3.2 (panneau B).
   5. À l’aide d’un cure-dent stérile, transférez soigneusement les bouchons recouverts de spores, d’hyphes précoces ou de mycélium provenant de plaques fongiques dans les couvercles des plaques d’analyse (panneau C).
   6. Incuber à 30 °C comme à la section 4.3.4 (panneau C).
   7. Mesurer le diamètre de la croissance radiale et calculer le pourcentage d’inhibition de la croissance fongique à l’aide de la formule dans la section 4.3.5 (panneau D).

Résultats

Pour évaluer la capacité de la méthode quantitative à discriminer le mode d’action de différents types de composés antifongiques, nous avons comparé l’efficacité de trois agents antifongiques bien connus. Carbendazim est un fongicide synthétique non volatil qui a été largement utilisé pour contrôler un large éventail de maladies fongiques chez les plantes^39,40. Thymus vulgaris huile essentielle a été largement décrit pour son activit...

Discussion

L’approche présentée ici permet d’évaluer les propriétés antifongiques des produits dérivés de plantes peu transformés. Dans ce protocole, la distribution homogène des spores à la surface de l’agar est obtenue à l’aide de perles de verre de 2 mm. Cette étape nécessite des compétences de manipulation pour distribuer correctement les perles et d’obtenir des résultats reproductibles, permettant finalement la comparaison des effets antifongiques à différents stades de la croissance fongique. Nous a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 - 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 - 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 - 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/