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요약

식물 유래 제품의 항진균 효과를 정량화하도록 설계된 수정된 한천 기반 방법을 설명합니다. 항진균 활성에 대한 휘발성 및 비휘발성 기여는 모두 이 프로토콜을 통해 평가될 수 있다. 또한, 곰팡이에 대한 효능은 단일 실험 설정에서 주요 발달 단계에서 측정될 수 있다.

초록

설명된 프로토콜은 미생물 수량 및 발달 단계를 정확하게 판단할 수 있는 플러그 전달 기술을 기반으로 합니다. 지정된 수의 포자가 한천 판에 퍼져 있습니다. 이 한천판은 배양이 필요하지 않은 포자를 제외한 곰팡이가 예상되는 발달 단계에 도달할 수 있도록 정의된 기간 동안 배양됩니다. 포자, 최면 또는 균사체로 덮인 한천 플러그는 다음 철회하고 항진균 화합물을 함유한 천매체로 이송되어 곰팡이로부터 멀리 또는 접촉하여 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 액체 추출물과 고체 샘플(분말)을 모두 테스트하는 데 적용됩니다. 특히 포자, 조기 최면 및 균사체에 대한 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여를 정량화하고 그 효과를 결정하는 데 특히 적합합니다.

이 방법은 바이오 제어 제품, 특히 식물 유래 제품의 항진균 활성의 특성화와 매우 관련이 있습니다. 실제로, 식물 처리를 위해, 결과는 응용 프로그램의 모드의 선택을 안내하고 트리거 임계 값을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

과일과 채소의 글로벌 손실은 생산1의 50 %까지 도달 할 수 있으며 주로 20세기중반 부터 합성 살균제의 광범위한 고용에도 불구하고, 필드 또는 수확 후 저장2,3동안 곰팡이 부패로 인한 식품 부패로 인해 발생할 수 있습니다. 이 물질의 사용은 심각한 환경 및 건강 위험을 나타내기 때문에 재검토되고있다. 이들의 유해한 결과가 생태계 전반에 걸쳐 나타나고 잠재적 건강 영향의증거가 축적됨에 따라5,6,수확 후 치료 전 및 후 예방 전략에 대한 새로운 대안이 개발되고 있다7,8,9. 따라서 우리가 직면하는 도전은 두 배입니다. 새로운 살균 전략은 첫째, 식물 병원균에 대한 식품 보호의 효능 수준을 유지하고 두 번째로 농업 관행의 환경 발자국을 획기적으로 줄이는 데 기여해야합니다. 이 야심찬 목표를 달성하기 위해 식물에서 진화한 자연 방어에서 영감을 얻은 전략은 1000종 이상의 식물종이 항균성질8을강조함에 따라 제안되고 있다. 예를 들어, 식물병원균과 싸우기 위해 천연 살균제를 개발한 식물은 새로운 생물통제 제품2의개발을 탐구하는 새로운 자원이다. 에센셜 오일은 이 유형의 주력 분자입니다. 예를 들어, 오리가눔 에센셜 오일은 온실 10의 회색 곰팡이로부터 토마토 식물을 보호하고, Solidago canadensis L. 및 cassia 에센셜 오일은 수확 후 딸기를 회색 곰팡이 손상11,12로부터보존하는 것으로 나타났다. 이러한 예는 생물 통제와 특히 식물 유래 제품이 생물학적 효능과 환경 지속 가능성을 결합한 솔루션을 나타낸다는 것을 보여줍니다.

따라서, 식물은 작물 보호 산업에 대 한 잠재적인 관심의 분자의 중요 한 자원. 그러나 소수의 식물 제품만이 일반적으로 안전, 비식물독성 및 친환경2로인식되더라도 생물 통제 제품으로 사용할 것을 제안되었습니다. 실험실에서 현장으로의 전치에 대한 몇 가지 어려움이 관찰되었으며, 예컨대 생체 내적용2,9에적용된 효능감소 등이 관찰되었다. 따라서, 더 나은 필드 효능을 예측하는 실험실 테스트의 능력을 개선하는 것이 중요해진다. 이러한 맥락에서 식물 유래 제품에 대한 항진균 검사 방법은 항진균 효능을 평가하고 사용하기 위한 최적의 조건을 정의하는 데 모두 필요합니다. 구체적으로, 바이오컨트롤 제품은 일반적으로 화학 살균제보다 효율이 낮기 때문에, 그들의 행동 모드를 더 잘 이해하는 것이 적합한 제형을 제안하고, 분야에서 적용 모드를 식별하고, 병원균의 발달 단계가 후보 바이오제품에 취약한지를 정의하는 것이 중요하다.

항균 및 항진균 활동을 해결하는 현재 접근법은 한천 디스크 확산, 희석, 생물학적 소학 및 유동 세포측정과 같은 확산 방법을 포함합니다.13. 이러한 기술의 대부분, 그리고 더 구체적으로, 표준 항진균 감수성 테스트 - agar 디스크 확산 및 희석 작용 - 액체 현탁액에서 세균성 및 곰팡이 포자에 용해 화합물의 항균 활성을 평가하기위한 잘 적응된다14. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 건조 된 식물 분말 과 같은 고체 화합물을 테스트하거나 천판에 포자 희석 또는 포자 확산 및 /또는 항진균 화합물의 희석을 필요로하기 때문에 균사 체 성장 중 항진균 활성을 정량화하는 데 적합하지 않습니다.13. 식품 독방법에서 항진균제를 함유한 한천판은 정확한 양의 시동을 고려하지 않고 7일 된 곰팡이 배양에서 샘플링된 5-7mm 직경 디스크로 접종된다. 인큐베이션 후 항진균 활성은 방사형 성장 억제의 백분율로 결정됩니다.17,18,19. 이 접근으로 우리는 근생 성장에 항진균 활동을 평가할 수 있습니다. 대조적으로, agar 희석 방법은 항진균 화합물을 함유하는 천판의 표면에 직접 접종된 포자에 대한 항진균 활성을 결정하기 위해 수행됩니다.13,20,21. 이 두 가지 방법은 항진균 활성에 대한 보완적인 결과를 제공합니다. 그러나 이들은 포자와 균사체에 항진균 화합물의 상대적 효능의 정확한 나란히 비교를 제공하지 않는 병렬로 사용되는 두 개의 독립적 인 기술입니다17,20,22 곰팡이 재료의 시작량이 두 가지 접근 방식에서 다릅니다. 더욱이, 식물 유래 제품의 항진균 활성은 종종 식물에 의해 합성된 항진균 분자의 조합으로부터 병원균을 마주하게 된다. 이 분자는 단백질, 펩티드를 포함합니다23,24, 및 대사 산물은 광범위한 화학적 다양성을 가지며 폴리페놀, 테르펜, 알칼로이드와 같은 다양한 분자 클래스에 속하는 대사산물25, 글루코시올레이트8및 유기황 화합물26. 이들 분자 중 일부는 불안정하거나 병원균 공격 중 휘발성이 됩니다.27. 이 에이전트는 가장 자주 가난한 수용성 및 에센셜 오일로 물 증류를 통해 복구 해야 하는 높은 증기 압력 화합물, 그 중 일부는 잘 설립 되었습니다.28. 증기상 매개 감수성 감수성 작용은 증기상을 통한 증발 및 이동에 따른 휘발성 화합물의 항균 활성을 측정하기 위해 개발되었습니다.29. 이러한 방법은 미생물 배양으로부터 멀리 떨어진 항진균 화합물의 도입에 기초한다.29,30,31,32,33. 일반적으로 사용되는 증기상 한고 분석에서 에센셜 오일은 종이 디스크에 증착되어 포이 배지에 퍼지는 세균또는 곰팡이 포자 현탁액과 멀리 떨어진 페트리 접시의 표지 중앙에 배치됩니다. 성장 억제 영역의 직경은 다음 한천 디스크 확산 방법에 대한 것과 같은 방식으로 측정됩니다.20,24. 다른 접근법은 억제 증기상 매개 항균 활성을 계산한 국물 희석 법에서 유래된 에센셜 오일의 증기상 항진균 감수성의 정량적 측정을 제공하기 위해 개발되었습니다.32또는 한천 디스크 확산 소집에서 파생31. 이러한 방법은 일반적으로 증기상 활성 연구에 특이적이며 접촉 억제 작용에 적합하지 않습니다. 이는 복잡한 생리활성 혼합물의 항진균 활성에 휘발성 및 비휘발성 제제의 상대적 기여의 결정을 배제한다.

우리가 개발한 정량적 방법은 식물15의 감염 시 식물병원균의 공중 성장을 재현하기 위해 천 배지의 표면에 증착된 포자와 재배 된 균사체의 제어량에 대한 건조 식물 분말의 항진균 효과를 측정하는 것을 목표로하고 있으며, 상호 연결된 균사네트워크(16). 접근방식은 동일한 실험 설정에서 휘발성 및 비 휘발성 항진균 대사 산물의 기여도를 나란히 정량화할 수 있는 agar 희석 및 식품 중독 방법에 기초한 변형된 실험 용 설정이다. 이 연구에서는, 이 방법은 잘 특징인 3개의 항진균 제제의 활동에 대하여 벤치마킹되었습니다.

프로토콜

1화 이노쿨라 준비

  1. 실험 에 앞서 트리코데르마 스프의 5 μL을 놓습니다. SBT10-2018 포자는 감자 덱스트로스 천 배지(PDA)에 4°C에 저장되고 코니아형성을 촉진하기 위해 정기적인 광 노출로 30°C에서 4일 동안 배양한다(도1,패널 A).
    참고 : 트리코데르마 sPP. SBT10-2018은 나무에서 분리되어 있으며, 빠르게 성장하고 포자 회복의 용이성을 위해 이 연구의 모델로 사용됩니다. 이 균주는 우리의 실험실에 의해 보존됩니다.
  2. 코니디아 복구(그림 1,패널 A)
    1. 트리코데르마 균셀륨에 0.05% Tween-20의 3mL를 놓습니다.
    2. 갈퀴를 사용하여 conidiophores에서 코니디아를 방출; 최해가 찢어지는 것을 방지하기 위해 균사체를 누르지 마십시오.
    3. 마이크로피펫으로 용액을 빠르게 회수하여 한천 배지에 흡수되는 것을 피하고 15mL 튜브로 이송합니다.
    4. 혈류계를 사용하여 총 포자 수를 계산하고 3 x 106 포자 /mL을 포함하는 솔루션을 준비하십시오.
      참고: 이 단계는 최해가 추출되는 것을 방지하기 위해 신중하게 수행해야합니다. 포자 제제는 현미경으로 검사됩니다. 결국, 높은 공중 및 푹신한 균사체를 제시하는 균주의 경우, 40 μM 스트레이너 필터를 사용하여 여과 단계를 추가하여 잔류 균사체 조각을 제거할 수 있습니다.

2. 곰팡이 플레이트 준비(그림 1,패널 B)

  1. PDA 배지를 함유한 9cm 직경 페트리 접시에 마이크로파이프로 3 x 106 포자/mL의 100 μL을 4,800 개의 포자 / 5mm 직경 - agar 플러그에 해당하는 4,800 포자 / cm2를 얻습니다.
  2. 멸균 주걱으로 직경 2mm 유리 구슬 10g을 추가하고 작업자의 팔에 평행하고 수직으로 앞뒤로 이동하여 천표면에 포자를 고르게 분배합니다.
  3. 플레이트를 90° 회전시키고 회전 움직임을 반복합니다(섹션 2.2에서와 같이); 플레이트가 완전히 회전할 때까지 이러한 단계를 반복합니다.
  4. 플레이트를 즉시 사용하여 포자를 필요로 하는 실험을 설정하거나 17시간 또는 24시간 동안 30°C에서 플레이트를 배양하여 조기 최해 또는 균사체가 각각 필요할 때.
    참고: 균사칼 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하려면 멸균 핀셋을 사용하고 멸균 5mm 셀룰로오스 디스크를 포자 확산 후 천자 판 표면에 무작위로 배치합니다.

3. 항진균 화합물 제제

  1. 식물 유래 제품 준비: 마늘 분말 제제
    1. 신선한 마늘의 정향을 껍질을 벗기고 메스 블레이드를 사용하여 2-3mm 너비의 슬라이스로 정향을 자른다.
    2. 40 °C에서 2 일 동안 슬라이스를 공기 건조시십시오.
    3. 미세 한 분말을 얻기 위해 칼 공장을 사용하여 3 x 15 초 동안 슬라이스를 갈아.
    4. 사용 전에 마늘 분말을 50mL 튜브에 4°C로 저장합니다.
      참고: 마늘이 오토클레이브되지 않기 때문에(온도에 민감한 항진균 화합물의 분해를 방지하기 위해) 사용 전에 70%의 에탄올로 분쇄기, 메스 및 공기 건조기를 청소합니다.
  2. 에센셜 오일 준비
    1. 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 20% 티무스 불가리스 에센셜 오일 솔루션 0.5% Tween-80을 준비하십시오.
    2. PDA 매체에 추가하기 전에 에멀젼을 형성하기 위해 잘 섞어 보세요(섹션 4.2 참조).
  3. 카르벤다짐 준비
    1. 200 mg / L 에탄올 용액을 준비하기 위해 carbendazim 의 무게 (carbendazim은 물에 제대로 용해되지 않습니다).
    2. PDFA 매체에 추가하기 전에 실온에서 솔루션을 저장합니다(섹션 4.2 참조).
      주의: 카르벤다짐은 건강과 환경적 위험을 제시합니다. 이 제품을 취급할 때 장갑과 마스크를 착용하십시오. 통풍이 잘 되는 공간에 보관하십시오.

4. 접촉 억제 분석

  1. 마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비
    1. PDA 매체를 준비하고 자동 복제합니다.
    2. 원하는 마늘 분말량을 멸균 주걱을 사용하여 50mL 튜브에 계량하여 일반적으로 0.25 mg/mL에서 16 mg/mL에 이르는 농도를 얻습니다.
    3. 손목 안쪽에 있는 매체의 온도를 확인한 후에 PDA의 10mL를 추가합니다. 온도는 민감한 분자의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 낮아야합니다. 이상적으로, 이 온도는 45 °C이어야한다.
    4. 튜브를 거꾸로 뒤집어 서 분말을 PDA 배지로 고르게 분배하여 조심스럽게 균질화합니다. 직경 5cm페트리접시(그림 1,패널 C)에 10mL를 빠르게 붓습니다.
    5. 페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.
  2. 에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천 판 준비
    1. 50mL 튜브에 PDA 10mL을 소개합니다. 섹션 4.1.3의 온도를 확인합니다.
    2. PDA에 Thymus vulgaris 에센셜 오일의 다른 용액의 100 μL을 추가하여 0.005%, 0.01%, 0.025%, 0.2% 용액을 얻습니다(섹션 3.2.1 참조).
    3. 0.0625-2 mg/L에 이르는 솔루션을 얻기 위해 200 mg/L 솔루션에서 카벤다짐의 필요한 볼륨을 추가합니다(섹션 3.3.1 참조).
    4. 튜브를 거꾸로 뒤집어 조심스럽게 균질화하고, 10mL를 직경 5cm의 페트리접시(그림 1,패널 C)로 빠르게 붓습니다.
    5. 페트리 접시를 실온에 놓고, 한천이 고화될 때까지 기다립니다.
  3. 접촉 억제 분석(도 1)
    1. 직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 항진균 화합물을 포함한 PDA 또는 PDA가 포함된 페트리 접시 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)를 사용하여 한천 실린더를 폐기하십시오.
    2. 직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하면 2부에서 곰팡이 판에 무작위로 동그라미를 넣습니다. 플레이트당 15-20 원(패널 B)을 플롯합니다.
    3. 포자, 조기 최해, 또는 멸균 이쑤시개를 함유한 진셀륨으로 덮인 천실린더를 조심스럽게 철회하고 항진균 화합물(panel C)을 포함한 PDA 또는 PDA를 포함하는 페트리 접시의 빈 공간에 플러그를 넣습니다.
    4. 30°C에서 48시간, 31h의 초기 최해를 포함하는 플레이트에 대해, 24h의 균사체(panel C)로 덮인 플레이트에 대해 포자를 함유한 플레이트를 배양한다.
    5. 방사형 성장의 직경을 측정하고 포뮬러 (패널 D)를 사용하여 제어를 통해 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다.
      % 곰팡이 성장 억제 = (C - A / C)* 100
      여기서 C는 PDA 배지및 항진균 화합물을 함유하는 PDA 배지에서 방사형 성장의 직경이다.
      참고: 균사형 플러그 이송 및 균사체 디스크 전달 후 측정된 항진균 활성을 비교하기 위해 멸균 핀셋을 사용하여 이전에 진균판 의 표면에 증착된 5mm 직경 디스크(섹션 2 노트)를 PDA 또는 PDA가 함유한 페트리 접시의 중앙에 옮기고 항진균 화합물을 함유한 PDA와 정확히 진행

5. 증기 상 억제 분석

  1. 마늘 가루를 함유한 한천 접시 준비
    1. 섹션 3.1에서와 같이 진행합니다.
  2. 에센셜 오일 또는 카르벤다짐을 함유한 한천판 준비
    1. 3.2 항 및 3.3 섹션에서와 같이 진행합니다.
  3. 곰팡이 접시의 준비
    1. 섹션 2에서와 같이 진행합니다.
  4. 증기상 항진균 억제 분석(도 1)
    1. PDA 배지 10mL을 5cm 직경의 페트리 접시뚜껑에 붓고 10mL PDA 배지 또는 10mL의 PDA 배지를 함유하여 항진균 화합물을 접시 의 바닥에 넣습니다. 실온(패널 C)에서 한천을 완전히 응고할 때까지 기다립니다.
    2. 50mL 원심관을 교정 도구로 사용하여 뚜껑 중앙에 PDA 원을 얻는 다; 멸균 주걱 (패널 C)으로 원 주위의 PDA를 제거합니다.
    3. 5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브로 뚜껑에 배치된 PDA 매체의 중앙에 원을 플롯합니다. 멸균 이쑤시개(패널 C)로 한천 실린더를 폐기하십시오.
    4. 섹션 4.3.2 (패널 B)와 같이 곰팡이 판에 무작위로 5mm 직경의 멸균 스테인레스 스틸 튜브가있는 플러그를 형성합니다.
    5. 멸균 이쑤시개를 사용하여 포자, 조기 최해 또는 진균 판에서 균사체로 덮인 플러그를 분석 판(패널 C)의 뚜껑으로 조심스럽게 옮춥니다.
    6. 섹션 4.3.4 (패널 C)에서와 같이 30 °C에서 배양하십시오.
    7. 방사형 성장의 직경을 측정하고 섹션 4.3.5 (패널 D)에서 수식을 사용하여 곰팡이 성장 억제의 백분율을 계산합니다.

결과

항진균 화합물의 다른 유형의 작용 모드를 구별하는 정량적 방법의 능력을 평가하기 위해, 우리는 잘 알려진 3개의 항진균제의 효능을 비교했습니다. Carbendazim은식물 39,40에서곰팡이 질병의 넓은 범위를 제어하기 위해 널리 사용되어 온 비 휘발성 합성 살균제입니다. Thymus vulgaris 에센셜 오일은 주로 항균 및 항진균 활성에 대해 설명되어 있으며 ?...

토론

여기에 제시 된 접근 방식은 최소 가공 식물 유래 제품의 항진균 특성의 평가를 허용합니다. 이 프로토콜에서는 2mm 유리 구슬을 사용하여 천 표면에 포자의 균일한 분포가 달성된다. 이 단계는 제대로 구슬을 배포하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 처리 기술을 필요로, 궁극적으로 곰팡이 성장의 다른 단계에서 항진균 효과의 비교를 허용. 우리는 확산 하는 동안 균질화 하는 동안 5 mm 유리 구슬 ?...

공개

없음

감사의 말

프랭크 예이츠의 소중한 조언에 감사드립니다. 이 작품은 Sup'Biotech에 의해 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave-vacuclav 24B+Melag
CarbendazimSigma 378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubesSarstedt72.7061.5 mL
Falcons tubesSarstedt54725450 mL
Five millimeters diameter stainless steel tuberetail store/
Food dehydratorSancustosix trays
Garlic powderOrganic shop
Glass beadsCLOUP65020figure-materials-690 2 mm
Hemocytometer counting cellJeulin713442/
IncubatorMemmert UM40030 °C
Knife millBoschTSM6A013B
Manual cell counterLabboxHCNT-001-001/
Measuring rulerretail store
Microbiological safety cabinetsFASTERFASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
MicropipetteMettler-Toledo17014407100 - 1000 µL
MicropipetteMettler-Toledo1701441120 - 200 µL
MicropipetteMettler-Toledo170144122 - 20 µL
Petri dishSarstedt82-1194500figure-materials-1622 55 mm
Petri dishSarstedt82-1473 figure-materials-1770 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60LabboxEASY-P60-001/
Potato Dextrose AgarSigma 70139-500G
Precision scale-RADWAGGrosseronB126698AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
RakeSarstedt86-1569001/
Reverse microscope AE31E trinocularGrosseronM097917/
Sterile graduated pipetteSarstedt125400110 mL
Thymus essential oilDrugstoreEssential oil 100%
Tips 1000 µL Sarstedt70.762010
Tips 20 µL Sarstedt70.760012
Tips 200 µLSarstedt70.760002
Tooth pickretail store
Trichoderma spp strainStrain of LRPIA laboratory
Tween-20 Sigma P1379-250ML
Tween-80Sigma P1754-1L
TweezersLabboxFORS-001-002/

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