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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo modificato a base di agar progettato per quantificare gli effetti antifungini dei prodotti di origine vegetale. Sia i contributi volatili che i contributi non volatili all'attività antimicotica possono essere valutati attraverso questo protocollo. Inoltre, l'efficacia contro i funghi può essere misurata in fasi chiave di sviluppo in un'unica configurazione sperimentale.

Abstract

Il protocollo descritto si basa su una tecnica di trasferimento della spina che consente una determinazione accurata delle quantità di microrganismi e delle loro fasi di sviluppo. Un numero specificato di spore viene distribuito su una piastra di agar. Questa piastra di agar viene incubata per un periodo definito per consentire ai funghi di raggiungere lo stadio di sviluppo previsto, ad eccezione delle spore in cui non è richiesta l'incubazione. Le spine di agar coperte da spore, ife o micelio vengono successivamente ritirate e trasferite su supporti di agar contenenti il composto antimicotico da testare sia posizionate a distanza dai funghi che a contatto. Questo metodo è applicabile per testare sia estratti liquidi che campioni solidi (polveri). È particolarmente adatto per quantificare i contributi relativi degli agenti volatili e non volatili nelle miscele bioattive e per determinarne gli effetti, in particolare sulle spore, sull'iphae precoce e sul micelio.

Il metodo è molto rilevante per la caratterizzazione dell'attività antimicotica dei prodotti di biocontrollo, in particolare dei prodotti di origine vegetale. Infatti, per il trattamento dell'impianto, i risultati possono essere utilizzati per guidare la scelta delle modalità di applicazione e stabilire le soglie di innesco.

Introduzione

Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% dellaproduzione 1 e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta2,3,nonostante l'ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo4. L'uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l'ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute sisono accumulate 5,6, si stanno sviluppando nuove alternative alle vecchie strategie profilattiche per i trattamenti pre e post-raccolta7,8,9. Quindi la sfida che dobbiamo affrontare è duplice. Le nuove strategie fungicide devono, in primo luogo, mantenere i livelli di efficacia della protezione alimentare contro i fitopatogeni e, in secondo luogo, contribuire in secondo luogo a ridurre drasticamente l'impronta ambientale delle pratiche agricole. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, vengono proposte strategie ispirate alle difese naturali evolute nelle piante poiché sono state evidenziate più di 1000 specie di piante per le loro proprietà antimicrobiche8. Ad esempio, le piante che hanno sviluppato fungicidi naturali per combattere i fitopatogeni sono una nuova risorsa per esplorare lo sviluppo di nuovi prodotti di biocontrollo2. Gli oli essenziali sono molecole di punta di questo tipo. Ad esempio, l'olio essenziale di Origanum protegge le piante di pomodoro dalla muffa grigia nelle serre 10 e gli oli essenziali Solidago canadensis L. e cassia hanno dimostrato di preservare le fragole post-raccolte dai danni della muffagrigia 11,12. Questi esempi dimostrano che il biocontrollo e in particolare i prodotti di origine vegetale rappresentano una soluzione che combina efficacia biologica e sostenibilità ambientale.

Pertanto, le piante sono un'importante risorsa di molecole di potenziale interesse per l'industria della protezione delle colture. Tuttavia, solo una manciata di prodotti vegetali è stata proposta per essere utilizzata come prodotti di biocontrollo, anche se sono generalmente riconosciuti come sicuri, non fitotossici edeco-compatibili 2. Sono state osservate alcune difficoltà nella trasposizione dal laboratorio al campo, come l'efficacia che diminuisce una volta applicata in vivo2,9. Pertanto, diventa importante migliorare la capacità dei test di laboratorio di prevedere meglio l'efficacia sul campo. In questo contesto, i metodi di prova antimicotici per i prodotti di origine vegetale sono necessari sia per valutarne l'efficacia antimicotico sia per definire le loro condizioni ottimali per l'uso. In particolare, i prodotti di biocontrollo sono generalmente meno efficienti dei fungicidi chimici, quindi una migliore comprensione del loro modo di agire è importante per proporre formulazioni adeguate, identificare le modalità di applicazione nei campi e definire quale stadio di sviluppo dell'agente patogeno è vulnerabile al bioproduttore candidato.

Gli attuali approcci che affrontano le attività antibatteriche e antifungine includono metodi di diffusione come la diffusione del disco di agar, la diluizione, la bioautografia e la citometria del flusso13. La maggior parte di queste tecniche, e più specificamente, i test standard di suscettibilità antifungina - test di diffusione e diluizione agar-disk - sono ben adattati per valutare l'attività antimicrobica dei composti solubili sulle spore batteriche e fungine nelle sospensioni liquide14. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente adatti per testare composti solidi come la polvere vegetale essiccata o per quantificare l'attività antifungina durante la crescita del micelio in quanto richiedono la diluizione delle spore o la diffusione di spore su piastre di agar e / o diluizione di composti antifungini13. Nel metodo avvelenato dal cibo, le piastre di agar contenenti l'agente antimicotico vengono inoculate con un disco di 5-7 mm di diametro campionato da una coltura di funghi vecchia di 7 giorni senza considerare la quantità precisa di micelio iniziale. Dopo l'incubazione, l'attività antimicotica è determinata come percentuale di inibizione della crescita radiale17,18,19. Con questo approccio possiamo valutare l'attività antimicotica sulla crescita miceliale. Al contrario, il metodo di diluizione dell'agar viene eseguito per determinare l'attività antimicotica sulle spore direttamente inoculate sulla superficie della piastra di agar contenente i composti antifungini13,20,21. Questi due approcci danno risultati complementari sull'attività antimicotica. Tuttavia queste sono due tecniche indipendenti utilizzate in parallelo che non forniscono un confronto accurato fianco a fianco dell'efficacia relativa dei composti antifungini su spore e micelio17,20,22 poiché la quantità di materiale fungino iniziale differisce nei due approcci. Inoltre, l'attività antimicotica di un prodotto di origine vegetale è spesso il risultato della combinazione di molecole antifungine sintetizzati dalle piante per affrontare agenti patogeni. Queste molecole comprendono proteine, peptidi23,24, e metaboliti con un'ampia diversità chimica e appartenenti a diverse classi di molecole come polifenoli, terpeni, alcaloidi25, glucosinolati8, e composti organosolfuri26. Alcune di queste molecole sono volatili o diventano volatili durante l'attacco patogeno27. Questi agenti sono spesso scarsamente solubili in acqua e composti ad alta pressione di vapore che devono essere recuperati attraverso la distillazione dell'acqua come oli essenziali, alcune delle cui attività antimicrobiche sono state ben consolidate28. Sono stati sviluppati saggi di suscettibilità mediati in fase di vapore per misurare l'attività antimicrobica dei composti volatili dopo l'evaporazione e la migrazione attraverso la fase di vapore29. Questi metodi si basano sull'introduzione di composti antifungini a distanza dalla coltura microbica29,30,31,32,33. Nel saggio di agar in fase di vapore comunemente usato, gli oli essenziali vengono depositati su un disco di carta e posizionati al centro della copertura della piastra di Petri a distanza dalla sospensione batterica o fungina della spora, che viene diffusa su un mezzo agar. Il diametro della zona di inibizione della crescita viene quindi misurato allo stesso modo del metodo di diffusione agar-disco20,24. Altri approcci sono stati sviluppati per fornire una misurazione quantitativa della suscettibilità antifungina in fase di vapore degli oli essenziali, derivata dal metodo di diluizione del brodo da cui è stata calcolata un'attività antimicrobica mediata in fase di vapore inibitoria32, o derivati da saggi di diffusione agar-disk31. Questi metodi sono generalmente specifici per gli studi di attività in fase di vapore e non appropriati ai saggi di inibizione del contatto. Ciò impedisce la determinazione del contributo relativo degli agenti volatili e non volatili all'attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa.

Il metodo quantitativo che abbiamo sviluppato mira a misurare l'effetto antimicotico della polvere vegetale essiccata su quantità controllate di spore e micelio coltivato depositato sulla superficie di un mezzo agar per riprodurre la crescita aerea dei fitopatogeni durante l'infezionedelle piante 15 e una rete miceliale interconnessa16. L'approccio è una configurazione sperimentale modificata basata sui metodi di diluizione dell'agar e avvelenati dagli alimenti che consente anche, nella stessa configurazione sperimentale, la quantificazione affiancata del contributo di metaboliti antifungini volatili e non volatili. In questo studio, il metodo è stato confrontato con l'attività di tre preparati antifungini ben caratterizzati.

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Protocollo

1. Preparazione dell'inocula

  1. Prima dell'esperimento, posare 5 μL di Trichoderma spp. Le spore SBT10-2018 conservate a 4 °C su mezzo agar destrosio di patate (PDA) e incubano per 4 giorni a 30°C con esposizione regolare alla luce per favorire la formazione di conidia42 (Figura 1,pannello A).
    NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 è stato isolato dal legno ed è utilizzato come modello in questo studio per la sua rapida crescita e facilità di recupero delle spore. Questo ceppo è conservato dal nostro laboratorio.
  2. Recupera conidia(Figura 1, pannello A)
    1. Posare 3 mL dello 0,05% di Tween-20 sul micelio trichoderma.
    2. Utilizzare un rastrello per rilasciare conidia dai conidiofori; evitare di premere sul micelio per evitare che le ife vengano strappate via.
    3. Recuperare rapidamente la soluzione con una micropipetta per evitare che venga assorbita dal mezzo agar e trasferirla in un tubo da 15 ml.
    4. Contare il numero totale di spore utilizzando un emocitometro e preparare una soluzione contenente 3 x 106 spore/mL.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con attenzione per evitare l'estrazione delle ife. La preparazione delle spore viene quindi controllata al microscopio. Alla fine, per i ceppi che presentano micelio altamente aereo e soffice, è possibile aggiungere un passo di filtrazione utilizzando un filtro filtrante da 40 μM per eliminare il frammento di micelio residuo.

2. Preparazione delle piastre fungine(Figura 1,pannello B)

  1. Depositare 100 μL di 3 x 106 spore/mL con una micropipetta su una piastra di Petri di 9 cm di diametro contenente mezzo PDA per ottenere 4.800 spore/cm2 corrispondenti a 925 spore/spina di agar di diametro 5 mm.
  2. Aggiungere 10 g di perline di vetro di 2 mm di diametro con una spatola sterile ed eseguire movimenti avanti e indietro paralleli e perpendicolari al braccio dell'operatore per distribuire uniformemente le spore sulla superficie dell'agar.
  3. Ruotare la piastra di 90° e ripetere i movimenti rotanti (come nella sezione 2.2); ripetere questi passaggi fino a quando la piastra non è stata ruotata completamente.
  4. Utilizzare immediatamente la piastra per impostare esperimenti che richiedono spore o incubare le piastre a 30 °C per 17 ore o 24 ore quando sono necessarie rispettivamente le prime ife o micelio.
    NOTA: Per confrontare l'attività antimicotica misurata dopo il trasferimento della spina del micelio e il trasferimento del disco di micelio, utilizzare pinzette sterili e posizionare dischi sterili di cellulosa da 5 mm casualmente sulla superficie della piastra di agar dopo la diffusione della spora.

3. Preparazione di composti antifungini

  1. Preparazione del prodotto di origine vegetale: preparazione aglio-polvere
    1. Sbucciare gli spicchi d'aglio fresco e tagliare gli spicchi a fette larghe 2-3 mm usando una lama bisturi.
    2. Asciugare all'aria le fette per 2 giorni a 40 °C.
    3. Macinare le fette per 3 x 15 secondi utilizzando un mulino a coltello per ottenere una polvere fine.
    4. Conservare l'aglio in polvere a 4 °C in tubi da 50 ml prima dell'uso.
      NOTA: Poiché l'aglio non è autoclavato (per prevenire la degradazione di composti antifungini sensibili alla temperatura) pulire il macinino, il bisturi e l'essiccatore d'aria con etanolo al 70% prima dell'uso.
  2. Preparazione essenziale dell'olio
    1. Prepara soluzioni di olio essenziale 0,5%, 1%, 2,5%, 5% e 20% Thymus vulgaris in 0,5% Tween-80.
    2. Mescolare bene per formare un'emulsione prima di aggiungerla nel mezzo PDA (vedere la sezione 4.2).
  3. Preparazione carbendazim
    1. Pesare carbendazim per preparare una soluzione di etanolo da 200 mg/L (il carbendazim è scarsamente solubile in acqua).
    2. Conservare la soluzione a temperatura ambiente prima di aggiungerla nel mezzo PDA (vedere la sezione 4.2).
      ATTENZIONE: Carbendazim presenta un pericolo per la salute e l'ambiente. Indossare guanti e maschere durante la manipolazione di questo prodotto. Conservalo in uno spazio ventilato.

4. Saggio di inibizione del contatto

  1. Preparazione di piatti di agar contenenti aglio in polvere
    1. Preparare e autoclave PDA medium.
    2. Pesare la quantità di aglio in polvere desiderata in un tubo da 50 ml utilizzando una spatola sterile, per ottenere concentrazioni generalmente che vanno da 0,25 mg/ml a 16 mg/ml.
    3. Aggiungere 10 mL di PDA dopo aver controllato la temperatura del mezzo all'interno del polso. La temperatura deve essere il più bassa possibile per prevenire la degradazione di molecole sensibili. Idealmente, questa temperatura dovrebbe essere di 45 °C.
    4. Omogeneizzare con attenzione capovolgendo il tubo per distribuire uniformemente la polvere nel mezzo PDA. Versare rapidamente 10 mL in una piastra di Petri di 5 cm di diametro(Figura 1,pannello C).
    5. Con la piastra di Petri posta a temperatura ambiente, attendere che l'agar si solidifichi.
  2. Preparazione di piastre di agar contenenti olio essenziale o carbendazim
    1. Introdurre 10 ml di PDA in un tubo da 50 ml. Controllare la temperatura come per il punto 4.1.3.
    2. Aggiungere 100 μL delle diverse soluzioni di Thymus vulgaris olio essenziale in PDA per ottenere soluzioni 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% e 0,2% (vedi sezione 3.2.1).
    3. Aggiungere il volume richiesto di carbendazim dalla soluzione da 200 mg/L per ottenere soluzioni che vanno da 0,0625-2 mg/L (vedere la sezione 3.3.1).
    4. Omogeneizzare con cura capovolgendo il tubo, versare rapidamente 10 ml in una piastra di Petri di 5 cm di diametro(Figura 1,pannello C).
    5. Con la piastra di Petri posta a temperatura ambiente, attendere che l'agar si solidifichi.
  3. Saggio di inibizione del contatto (Figura 1)
    1. Con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro, tracciare un cerchio al centro delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA, compresi i composti antifungini. Smaltire il cilindro dell'agar utilizzando uno stuzzicadenti sterile (pannello C).
    2. Con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro, tracciare i cerchi casualmente nelle piastre fungine della sezione 2. Tracciare tra 15-20 cerchi per piastra (pannello B).
    3. Ritirare con cura i cilindri di agar coperti da spore, iphae precoci o micelio con uno stuzzicadenti sterile e posizionare le spine nello spazio vuoto delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA compresi i composti antifungini (pannello C).
    4. Incubare le piastre contenenti spore per 48 ore a 30 °C, 31 ore per le piastre contenenti iphae precoce e, 24 ore per le piastre ricoperte di micelio (pannello C).
    5. Misurare il diametro della crescita radiale e calcolare la percentuale di inibizione della crescita fungina rispetto al controllo utilizzando la formula (pannello D)
      % inibizione della crescita fungina = (C - A/C)* 100
      dove C è il diametro della crescita radiale nel mezzo PDA e A il diametro della crescita radiale nel mezzo PDA contenente i composti antifungini.
      NOTA: Per confrontare l'attività antimicotica misurata dopo il trasferimento della spina del micelio e il trasferimento del disco di micelio, utilizzando pinzette sterili, trasferire un disco di 5 mm di diametro precedentemente depositato sulla superficie delle piastre fungine (sezione 2 nota) al centro delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA contenenti composti antifungini e procedere esattamente come per il trasferimento dell'agar-plug

5. Saggio di inibizione della fase di vapore

  1. Preparazione di piatti di agar contenenti aglio in polvere
    1. Procedere come nella sezione 3.1.
  2. Preparazione di una piastra di agar contenente olio essenziale o carbendazim
    1. Procedere come nelle sezioni 3.2 e 3.3.
  3. Preparazione di piatti fungini
    1. Procedere come nella sezione 2.
  4. Saggio di inibizione antifungina in fase di vapore(Figura 1)
    1. Versare 10 mL di mezzo PDA nel coperchio delle piastre di Petri di 5 cm di diametro contenenti 10 mL di mezzo PDA o 10 mL di mezzo PDA contenente composti antifungini nella parte inferiore dei piatti. Attendere fino alla completa solidificazione dell'agar a temperatura ambiente (pannello C).
    2. Utilizzare un tubo centrifugo da 50 mL come strumento di calibrazione per ottenere un cerchio di PDA al centro del coperchio; rimuovere il PDA intorno al cerchio con una spatola sterile (pannello C).
    3. Tracciare un cerchio al centro del mezzo PDA posto nel coperchio con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro. Scartare il cilindro di agar con uno stuzzicadenti sterile (pannello C).
    4. Formare tappi con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro casualmente nelle piastre fungine come nella sezione 4.3.2 (pannello B).
    5. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, trasferire accuratamente le spine coperte da spore, iphae precoci o micelio da piastre fungine nei coperchi delle piastre di dosaggio (pannello C).
    6. Incubare a 30 °C come nella sezione 4.3.4 (pannello C).
    7. Misurare il diametro della crescita radiale e calcolare la percentuale di inibizione della crescita fungina utilizzando la formula nella sezione 4.3.5 (pannello D).

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Risultati

Per valutare la capacità del metodo quantitativo di discriminare le modalità di azione di diversi tipi di composti antifungini, abbiamo confrontato l'efficacia di tre noti agenti antifungini. Carbendazim è un fungicida sintetico non volatile che è stato ampiamente utilizzato per controllare una vasta gamma di malattie fungine nellepiante 39,40. L'olio essenziale di thymus vulgaris è stato in gran parte descritto per la sua attività antibatterica e ...

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Discussione

L'approccio qui presentato consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. In questo protocollo, la distribuzione omogenea delle spore sulla superficie dell'agar si ottiene utilizzando perline di vetro da 2 mm. Questo passaggio richiede capacità di movimentazione per distribuire correttamente le perline e ottenere risultati riproducibili, consentendo in ultima analisi il confronto di effetti antifungini in diverse fasi della crescita fungina. Abbiamo scoperto c...

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Divulgazioni

nessuno

Riconoscimenti

Siamo molto grati a Frank Yates per il suo prezioso consiglio. Questo lavoro è stato sostenuto da Sup'Biotech.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave-vacuclav 24B+Melag
CarbendazimSigma 378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubesSarstedt72.7061.5 mL
Falcons tubesSarstedt54725450 mL
Five millimeters diameter stainless steel tuberetail store/
Food dehydratorSancustosix trays
Garlic powderOrganic shop
Glass beadsCLOUP65020figure-materials-690 2 mm
Hemocytometer counting cellJeulin713442/
IncubatorMemmert UM40030 °C
Knife millBoschTSM6A013B
Manual cell counterLabboxHCNT-001-001/
Measuring rulerretail store
Microbiological safety cabinetsFASTERFASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
MicropipetteMettler-Toledo17014407100 - 1000 µL
MicropipetteMettler-Toledo1701441120 - 200 µL
MicropipetteMettler-Toledo170144122 - 20 µL
Petri dishSarstedt82-1194500figure-materials-1622 55 mm
Petri dishSarstedt82-1473 figure-materials-1770 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60LabboxEASY-P60-001/
Potato Dextrose AgarSigma 70139-500G
Precision scale-RADWAGGrosseronB126698AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
RakeSarstedt86-1569001/
Reverse microscope AE31E trinocularGrosseronM097917/
Sterile graduated pipetteSarstedt125400110 mL
Thymus essential oilDrugstoreEssential oil 100%
Tips 1000 µL Sarstedt70.762010
Tips 20 µL Sarstedt70.760012
Tips 200 µLSarstedt70.760002
Tooth pickretail store
Trichoderma spp strainStrain of LRPIA laboratory
Tween-20 Sigma P1379-250ML
Tween-80Sigma P1754-1L
TweezersLabboxFORS-001-002/

Riferimenti

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