肠道维利表皮的器官3D培养进行分化

摘要

该程序描述了从小鼠肠道上皮分离，进行分化以确定其器官形成潜力。

摘要

肠道上皮器官的克隆性归因于其中干细胞的存在。小鼠小肠上皮被分割成墓穴和卵石:茎和增殖细胞被限制在墓穴中，而上皮只包含分化细胞。因此，正常的肠道隐士，但不是病毒，可以产生器官在3D文化。此处描述的程序仅适用于导致茎的脱位的维卢斯上皮。所述方法使用 Smad4 功能丧失:β-卡特宁功能增益 （Smad4 KO:β-卡特宁^GOF） 有条件突变鼠标。突变导致肠道病毒分化，并在病毒中产生干细胞。接受脱位的肠道病毒使用玻璃滑梯刮掉肠道，放置在 70 μm 滤网中，并清洗多次，在 BME-R1 矩阵中电镀之前过滤掉任何松散的细胞或凹痕，以确定其器官形成潜力。两个主要标准用于确保产生的器官是从分化的紫罗兰隔间而不是从墓穴中发育出来的:1） 对孤立的 villi 进行微观评估，以确保在 3D 矩阵中电镀之前和之后没有任何系绳的切除器，2） 从 villi 监测器官形成的时间过程。从病毒启动的器官在电镀后仅发生两到五天，并且看起来形状不规则，而来自同一肠道上皮的隐性器官在电镀后的十六小时内就明显出现球形。然而，该方法的局限性是，形成的器官数量和从病毒中启动器官所需的时间因分化程度而异。因此，根据突变的特异性或导致分化的侮辱，必须从经验上确定可以收获病毒以检测其器官形成潜力的最佳阶段。

引言

肠道隐士，但不是维利，形成器官时，培养在马特里格尔或BME-R1矩阵。这些器官是自组织结构，通常被称为"迷你肠"，因为存在各种差异化的血统，祖细胞和干细胞存在于肠道上皮在体内。从墓穴中形成器官的可能性归因于干细胞¹的存在。另一方面，肠道病毒只由分化细胞组成，因此不能形成器官。然而，突变²或条件，允许去差异的维卢斯上皮可能导致干细胞在维利^2，3。这种命运的变化导致在维利上皮的茎可以通过电镀在3D基质中分化的维卢斯上皮来确定其器官形成潜力，作为在维卢斯上皮的去诺沃茎的指标来证实。因此，此过程的关键方面是确保没有墓穴污染。

Smad4^KO:β-卡特宁^GOF 有条件突变导致肠道上皮的分化，其特征是病毒中增殖和干细胞标记的表达， 最终在被称为异位性墓穴的细胞中形成类似墓穴的结构 这些分离的维利的干细胞的存在是由异位性墓穴（体内）中干细胞标记的表达和突变的维利形成器官的能力决定的镀马特里格尔^3。上述程序详细说明了用于确认 Smad4^KO:β-卡特宁^GOF 突变小鼠中脱位肠道上皮的茎的方法。这种隔离病毒的方法的一个关键特点是使用刮肠流明，而不是EDTA溷合方法^4。与 EDTA 溷合方法不同，通过刮擦来隔离维利保留了大部分底层，并允许调整刮擦压力，从而在没有系绳的墓穴的情况下产生 villi。刮擦的压力是主观的操作员，因此，最佳压力，以产生维利没有密码系绳必须由操作员经验决定。此过程的关键方面是通过对 BME-R1 矩阵中电镀前后的 villi 进行微观检查，确保没有墓穴污染。

肠道病毒被刮掉肠道流明与玻璃滑梯，并放置在70μm过滤器和洗涤与PBS摆脱松散的细胞或墓穴，如果有的话，在BME-R1矩阵电镀之前。该方法强调以下标准，以避免墓穴污染:a） 限制 villi 收获的十二指肠的近半部分，其中 villi 是最长的，b） 尽量减少葡萄球产的刮伤数量，c） 通过六井盘中的一系列 PBS 清洗含有 villi 的过滤器，d） 通过在 BME-R1 矩阵中电镀之前和之后的显微检查确认没有墓穴污染。Villi 隔离通过刮擦，而不是通过 EDTA 溷合，防止潜在的介质的完全丧失，可能提供利基信号^{5，6，7，8，}如果需要的话， 从虚列上皮启动器官.

研究方案

所有进行的小鼠实验，包括使用塔莫西芬和子宫颈错位安乐死，都得到了史蒂文斯生态学研究所的机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 老鼠

注: 斯马德4^f/f的生成:卡顿^{布洛克斯 （前 3）}/^*维林-克雷^ERT2 小鼠此前曾被描述过³只。成年雌性小鼠在8至12周之间使用。

1. 诱导斯马德4 KO:β-卡特宁^GOF突变在Smad4^f/f:卡顿^{布洛克斯 （前 3）}/^*维林-克雷^ERT2连续四天在玉米油中注射塔莫西芬。
2. 在第一次塔莫西芬注射十天后，牺牲小鼠的颈椎错位。
3. 用70%乙醇喷洒腹部，防止老鼠毛皮进入腹腔。
4. 用解剖剪刀打开腹腔，露出肠道。用剪刀和钳子将肠子隔离。
   注:随之损失Smad4以及β-卡特宁（Smad4^KO:β-卡特宁^GOF）的功能突变通过注射^Smad4f/f获得:卡顿^{布洛克斯 （前 3）}/^*维林-克雷^ERT2小鼠连续四天每天在玉米油中承受 0.05 克塔莫西芬/公斤的体重。这些小鼠在第一次塔莫西芬注射后十天收获，以确保在分化的维利中出现表达干细胞相关标记的细胞。

2. 二重奏隔离和准备

1. 解剖十二指肠的近半部分。
2. 在 10 mL 注射器中用 5 mL 的冰冷 PBS 冲洗十二指肠，以清除亮性含量。
3. 用斜剪刀纵向打开十二指肠，将十二指肠平放在冰上 15 厘米的 Petri 板上，十二指肠的流明朝操作员。

3. 通过刮擦来隔离维利

1. 在开始刮擦之前，在 6 井组织培养板的井中放置一个 70 μm 网状过滤器。用 4 mL 的 1x PBS 填充所有油井，并将 6 井组织培养板放在冰上（图 1）。
2. 使用两个微小的玻璃滑梯刮擦玻璃:一个将十二指肠压住，另一个刮擦（图1B1）。
   1. 刮刮十二指肠表面的发光侧表面来回两次，以消除粘液。施加压力，使这一步骤去除粘液层，而不是病毒。
   2. 再次刮十二指肠，来回两次施加与3.1相同的压力，在此期间可以看到villi收集在幻灯片上（图1B2）。这是最佳压力（必须由操作员根据经验确定），无需将密码系上即可产生 villi。
3. 使用含有 PBS 的 1 mL 传输管道将 villi（从第 3.2.2 步收集的）转移到放置在 6 井盘中的 70 μm 网状过滤器。因此，每次刮伤后都会收集病毒（图1B2）。
4. 通过将过滤器（与 villi 一起）通过包含冷 PBS（+ 4 mL/井）的 6 井盘中的一系列井中转移在 70 μm 过滤器中收集的 villi（从第 3.3 步开始）中清洗。这是删除松散的墓穴，如果有的话。
5. 使用 p1000 管道，将 PBS 中的 villi 悬架 （+ 3 mL） 从 70 μm 滤网转移到冰上新的 15 mL 管。
6. 使用 0.1% BSA 涂层钝端 p200 管道尖端将 50 μL 的 villi 悬架积吸气到玻璃滑梯上。将 50 μL 滴中的维利数计算在 4 倍放大倍数以下，以确定 PBS 悬架中维利的浓度。例如，如果在检查的 50 μL 悬架中有 10 维利，则 villi 浓度为 0.2 维利/μL。这也是确认没有系绳墓穴的时候。
7. 计算 BME-R1 矩阵浓度为 0.5 维利/μL 的板材所需的 villi 悬浮体体积。额外添加 100 μL，以解释管道错误和微观检查所需的体积，以确保 villi 的纯度。
   警告:前两个刮伤中使用的压力，去除粘液，但不去除病毒，应用于随后的刮伤，在此期间，villi 将被释放。首次观察到 villi 释放后，将来回刮擦的数量限制为 2 次。此措施避免释放与墓穴系在一起的 villi。有必要从微观上评估病毒，以确保没有系绳的墓穴。

4. BME-R1 矩阵上的维利电镀

1. 使用 0.1% BSA 涂层 p200 钝端管道尖端，将 BME-R1 矩阵 12.5 μL 中每口井所需的 villi 体积（从第 3.6 步）转移到微中心管中，以每口井 6 villi 的密度进行镀。此时使用 BSA 涂层的钝端尖端可确保对于尖尖太大的 villi 具有吸气性，而不会被阻塞或丢失，不会卡在尖端的两侧。
2. 在冷藏离心机 （4 °C） 中以 200 x g 的速度旋转 2 分钟，并取出超高纳特。
3. 重复步骤 4.2 以删除任何残留的 PBS，然后在层压流罩下继续下一步。
4. 在冰上解冻的所需的冷 BME-R1 中轻轻地重新使用维利颗粒。
5. 使用 p20 管道，在预制的 96 井 U 底板中使用 BME-R1 矩阵中的 12.5 μL/井。
6. 在 37 °C 的组织培养培养器中孵育板 15 分钟，以便凝固 BME-R1 矩阵。
7. 添加 125 μL/预热 ENR（表皮生长因子/诺金/R-海绵丁 1）介质:先进的 DMEM F-12 介质，辅以 1x 青霉素:链霉素， 10 mM HEPES， 谷氨酰胺， 50 ng/mL EGF， 100 ng/mL 诺金， 5% 条件介质从 HEK293-T 细胞表达 R-斯庞丁 1， 1x N2， 1x B27， 1 mM N 乙酰半胱氨酸， 和 0.05 毫克/mL Primocin.
8. 在维持在 37 °C 的组织培养培养器中孵育镀维利，并每隔一天更换一次介质。
9. 丢弃任何在电镀两天前出现器官的井，因为预计紫外风琴最早出现的时间点是在两天后。
   注:任何有一半或一半以上的维利长度的维利都算作一个维卢斯。与隐性器官不同，在电镀后的 24 小时内，预计不会产生紫外线衍生的器官。在器官形成之前，器官启动的病毒似乎正在变暗和收缩。因此，任何在电镀后一天内形成器官的井都应被丢弃，以避免从似是而而至的墓穴污染中产生。用于生产有条件介质的方法可应要求提供。

结果

该过程成功的决定因素是防止密码污染。通过确认四个主要标准来确保从 villi（而不是从任何污染的墓穴）中进行有机物发育:1） 通过在 BME-R1 中电镀 villi 前后进行微观检查，确保收获的葡萄球体的纯度:2） 每口井电镀有限数量的 villi，以便单独可视化所有镀膜的 villi:3） 每天对器官发育进行监控:时间过程的图像显示从维利（图3）和4）开始的器官的动力学和形态外观的发?...

讨论

这种方法可以确认在体内获得干细胞标记的去分化上皮的自我更新能力。正常的肠道上皮可以产生器官从墓穴，但不是维利隔间，当培养在3D，因为干细胞的存在在墓穴^1。因此，从3D培养的去差异化的维利上皮培养的器官形成确认干细胞形成从细胞命运逆转。关于肠道上皮因突变和/或损伤引起的细胞命运逆转的报告正在增加2，3，9，10，11，12。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770