Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

Résumé

La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.

Résumé

La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4^KO:β-caténine^GOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.

Introduction

Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches¹. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mutations² ou les conditions qui permettent la dédifférenciation de l’épithélium des villosités peuvent conduire à des cellules souches dans les^{villosités 2,3}. Ce changement de destin entraînant une tige dans l’épithélium des villosités peut être confirmé en plaquant l’épithélium villositédifférenciant dans une matrice 3D afin de déterminer leur potentiel de formation d’organoïdes comme indicateur de la tige de novo dans l’épithélium villus. Par conséquent, l’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte.

La mutation conditionnelle Smad4^KO:β-caténine^GOF provoque une dédifférenciation dans l’épithélium intestinal marquée par l’expression de marqueurs de prolifération et de cellules souches dans les villosités, et finalement la formation de structures de type crypte dans les villosités appelées cryptes ectopiques La présence de cellules souches ces villosités dédifférenciées a été déterminée par l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cryptes ectopiques(in vivo)et la capacité des villosités mutantes à former des organoïdes wh en plaqué Matrigel³. La procédure mentionnée ci-dessous élabore la méthodologie utilisée pour confirmer la tige de l’épithélium intestinal dédifférenciant chez les souris mutantes Smad4^KO:β-caténine^GOF. Une caractéristique clé de cette méthodologie pour isoler les villosités était l’utilisation du grattage de la lumière intestinale, par opposition à la méthode de chélation EDTA⁴. Contrairement à la méthode de chélation EDTA, l’isolement des villosités par grattage conserve la majorité du mésenchyme sous-jacent et permet d’ajuster la pression de grattage pour produire des villosités sans cryptes attachées. La pression de raclage est subjective pour l’opérateur, par conséquent, la pression optimale pour produire des villosités sans cryptes attachées doit être déterminée empiriquement par l’opérateur. L’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte par un examen microscopique des villosités avant et après le placage dans la matrice BME-R1.

Les villosités intestinales sont grattées de la lumière intestinale avec des lames de verre et placées dans un filtre de 70 μm et lavées avec du PBS pour se débarrasser des cellules lâches ou des cryptes, le cas échéant, avant le placage dans la matrice BME-R1. La méthode met l’accent sur les critères suivants pour éviter la contamination des tésiers : a) confiner la récolte des villosités dans la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimiser le nombre d’éraflures produisant des villosités, c) laver le filtre contenant les villosités à travers une série de PBS dans une boîte à six puits, et d) confirmer l’absence de contamination des cryptes par un examen microscopique avant et après le placage dans la matrice BME-R1. L’isolement de Villosité par grattage, plutôt que par chélation EDTA, empêche la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche^5,6,7,8, si nécessaire, pour l’initiation organoïde de l’épithélium villus.

Protocole

Toutes les expériences menées sur des souris, y compris l’utilisation du tamoxifène et l’euthanasie par luxation cervicale, ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut d’echnologie Stevens.

1. Souris

NOTE : La génération de Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Des souris Villin-Cre^ERT2 ont déjà été décrites³. Des souris femelles adultes âgées de huit à douze semaines ont été utilisées.

1. Induire la mutation Smad4^KO:β-caténine^GOF dans le Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 avec injection intrapéritonéale de tamoxifène dans l’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs.
2. Sacrifier la luxation cervicale de la souris dix jours après la première injection de tamoxifène.
3. Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.
4. Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin. Isolez l’intestin à l’aide des ciseaux et des pinces.
   NOTE: La perte concomitante de Smad4 et le gain de mutation fonctionnelle de la β-caténine (Smad4^KO;β-caténine^GOF) dans l’épithélium intestinal ont été obtenus par injection^{de Smad4f/f}; Catnb^lox(ex3)/⁺; Souris Villin-Cre^ERT2 tous les jours pendant quatre jours consécutifs avec 0,05 g de tamoxifène / kg de poids corporel dans l’huile de maïs. Ces souris sont récoltées dix jours après la première injection de tamoxifène pour assurer la présence de cellules exprimant des marqueurs associés aux cellules souches dans les villosités dédifférenciées.

2. Isolement et préparation du duodénum

1. Disséquer la moitié proximale du duodénum.
2. Rincez le duodénum avec 5 mL de PBS glacé dans une seringue de 10 mL pour dégager le contenu luminal.
3. Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une plaque de Petri de 15 cm sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.

3. Isolation des villosités par raclage

1. Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 μm dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits. Remplissez tous les puits avec 4 mL de 1x PBS et placez la plaque de culture tissulaire de 6 puits sur de la glace (Figure 1).
2. Grattez les villosités comme suit à l’aide de deux lames de verre microscopiques : l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter (Figure 1B1).
   1. Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour éliminer le mucus. Appliquez une pression telle que cette étape élimine la couche de mucus, mais pas les villosités.
   2. Gratter à nouveau le duodénum, en appliquant deux fois la même pression que dans 3..1, au cours de laquelle on peut voir des villosités s’accumuler sur les diapositives (Figure 1B2). C’est la pression optimale (qui doit être déterminée empiriquement par l’opérateur) pour donner les villosités sans les cryptes attachées.
3. Utilisez une pipette de transfert de 1 mL contenant du PBS pour transférer les villosités (qui sont recueillies sur la glissière de l’étape 3.2.2.) vers une passoire à mailles de 70 μm placée dans une boîte à 6 puits. Les villosités sont ainsi collectées après chaque éraflure (Figure 1B2).
4. Laver les villosités recueillies dans la passoire de 70 μm (à partir de l’étape 3.3) en transférant la passoire (avec les villosités) à travers une série de puits dans un plat de 6 puits contenant du PBS froid (~ 4 mL/puits). Il s’agit d’enlever les cryptes lâches, le cas échéant.
5. À l’aide d’une pipette p1000, transférer la suspension de villosités en PBS (~ 3 mL) de la passoire de 70 μm vers un nouveau tube de 15 mL sur glace.
6. Utilisez une pointe de pipette p200 à 0,1 % enduite de BSA pour aspirer un volume de 50 μL de la suspension à villosités sur une glissière en verre. Compter le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 μL sous grossissement 4x pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS. Par exemple, s’il y a 10 villosités dans la suspension de 50 μL examinée, la concentration en villosités est de 0,2 villosités/μL. C’est aussi le moment de confirmer l’absence de cryptes attachées.
7. Calculer le volume de suspension de villosités requis pour plaquer à une concentration de 0,5 villosités/μL de matrice BME-R1. Ajouter 100 μL supplémentaires pour tenir compte de l’erreur de pipetage et du volume requis pour l’examen microscopique requis pour assurer la pureté des villosités.
   ATTENTION: La pression utilisée dans les deux premières éraflures, qui élimine le mucus mais pas les villosités, doit être utilisée dans les éraflures suivantes au cours desquelles les villosités seront libérées. Limitez le nombre de grattements aller-retour à deux après la première observation de la libération des villosités. Cette mesure évite la libération de villosités avec les cryptes attachées. Il est essentiel d’évaluer microscopiquement les villosités pour s’assurer de l’absence des cryptes attachées.

4. Placage des villosités sur la matrice BME-R1

1. À l’aide d’une pointe de pipette p200 émoussée revêtue de BSA à 0,1 %, transférez dans un tube de microcentrifugation le volume de villosités (à partir de l’étape 3.6) nécessaire à la plaque à une densité de ~ 6 villosités par puits dans 12,5 μL de matrice BME-R1. L’utilisation d’une pointe émoussée revêtue de BSA à ce stade garantit que les villosités, qui sont trop grandes pour une pointe pointue, sont aspirées sans être bloquées ou perdues d’être collées sur les côtés de la pointe.
2. Faire tourner les villosités pendant 2 min à 200 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) et retirer le surnageant.
3. Répétez l’étape 4.2 pour retirer tout PBS résiduel et passez à l’étape suivante sous une hotte à flux laminaire.
4. Remettez ensemencez doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace.
5. À l’aide d’une pipette p20, plaque 12,5 μL/puits des villosités dans la matrice BME-R1 en 3D dans une plaque pré-préwargée en U de 96 puits.
6. Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1.
7. Ajouter 125 μL/puits de milieux ENR (facteur de croissance épidermique/Noggin/R-spondin1) préchauffés : milieu DMEM F-12 avancé, complété par 1x pénicilline : streptomycine, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5 % de milieu conditionné de cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acétyl cystéine et 0,05 mg/mL de primocine.
8. Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 °C avec 5% de CO₂et changer le milieu tous les deux jours.
9. Jetez tout puits dans lequel des organoïdes apparaissent avant deux jours de placage, car le premier moment où les organoïdes dérivés des villosités sont attendus est après deux jours.
   REMARQUE: Tous les villosités qui ont la moitié ou plus de la moitié de la longueur des villosités sont comptées comme une villosité. Contrairement aux organoïdes dérivés de la crypte, les organoïdes dérivés des villosités ne sont pas attendus dans les 24 heures suivant le placage. Les villosités initiatrices des organoïdes semblent s’assombrir et rétrécir avant la formation d’organoïdes. Par conséquent, tous les puits avec des organoïdes se développant dans la journée de placage doivent être jetés pour éviter la plausibilité d’avoir dérivé d’une contamination plausible de la crypte. La méthodologie utilisée pour produire les supports conditionnés est disponible sur demande.

Résultats

Le facteur déterminant pour le succès de la procédure est la prévention de la contamination des cryptes. Le développement organoïde à partir des villosités (et non à partir de cryptes contaminantes) est assuré par la confirmation de quatre critères majeurs: 1) assurer la pureté des villosités prélevées par un examen microscopique avant et après le placage des villosités dans BME-R1, 2) placage d’un nombre limité de villosités par puits pour permettre la visualisation de tous les villosités plaquées...

Discussion

Cette méthode peut confirmer la capacité d’auto-renouvellement de l’épithélium des villosités dédifférenciantes qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. L’épithélium intestinal normal peut donner naissance à des organoïdes de la crypte mais pas du compartiment des villosités, lorsqu’il est cultivé en 3D en raison de la présence de cellules souches dans les cryptes¹. Ainsi, la formation d’organoïdes à partir de l’épithélium des villosités d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770