3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

Zusammenfassung

Das Verfahren beschreibt die Isolierung der Zotten aus dem Darmepithel der Maus, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Klonogenität von Organoiden aus dem Darmepithel wird auf das Vorhandensein von Stammzellen darin zurückgeführt. Das Dünndarmepithel der Maus ist in Krypten und Zotten unterteilt: Die Stamm- und Proliferationszellen sind auf die Krypten beschränkt, während das Zottenepithel nur differenzierte Zellen enthält. Daher können die normalen Darmkrypten, aber nicht die Zotten, in 3D-Kulturen organoide entstehen. Das hier beschriebene Verfahren ist nur auf Zottenepithel anwendbar, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird, die zu Stielbildung führt. Die beschriebene Methode verwendet die Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-catenin^GOF)bedingte mutierte Maus. Die Mutation bewirkt, dass die Darmzotten dedifferenzieren und Stammzellen in den Zotten erzeugen. Darmzotten, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, werden mit Glasobjektträgern vom Darm abgekratzt, in ein 70 μm-Sieb gelegt und mehrmals gewaschen, um lose Zellen oder Krypten herauszufiltern, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen. Zwei Hauptkriterien wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die resultierenden Organoide aus dem entdifferenzierenden Zottenkompartiment und nicht aus den Krypten entwickelt wurden: 1) mikroskopische Bewertung der isolierten Zotten, um sicherzustellen, dass keine angebundenen Krypten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der 3D-Matrix vorhanden sind, und 2) Überwachung des zeitliche Verlaufs der Organoidentwicklung aus den Zotten. Die organoide Initiation aus den Zotten erfolgt nur zwei bis fünf Tage nach dem Plattieren und erscheint unregelmäßig geformt, während die aus der Krypta abgeleiteten Organoide aus demselben Darmepithel innerhalb von sechzehn Stunden nach der Beschichtung sichtbar sind und kugelförmig erscheinen. Die Einschränkung der Methode besteht jedoch darin, dass die Anzahl der gebildeten Organoide und die Zeit, die für die Organoidinitiierung aus den Zotten benötigt wird, je nach Grad der Dedifferenzierung variieren. Abhängig von der Spezifität der Mutation oder der Beleidigung, die die Dedifferenzierung verursacht, muss daher das optimale Stadium, in dem Zotten entnommen werden können, um ihr organoidales Bildungspotenzial zu bestimmen, empirisch bestimmt werden.

Einleitung

Die Darmkrypten, aber keine Zotten, bilden Organoide, wenn sie in Matrigel oder BME-R1-Matrix kultiviert werden. Diese Organoide sind selbstorganisierende Strukturen, die oft als "Mini-Darm" bezeichnet werden, da die verschiedenen differenzierten Linien, Vorläufer- und Stammzellen im Darmepithel in vivovorhanden sind. Das Potenzial, Organoide aus Krypten zu bilden, wird auf das Vorhandensein von Stammzellen^{zurückgeführt 1}. Die Darmzotten hingegen bestehen nur aus differenzierten Zellen und können daher keine Organoide bilden. Mutationen 2 oder^Zustände, die eine Dedifferenzierung des Zottenepithels ermöglichen, können jedoch zu Stammzellen in den Zotten^2,3führen. Diese Schicksalsänderung, die zu einer Stängelbildung im Zottenepithel führt, kann durch Beschichtung des dedifferenzierenden Zottenepithels in 3D-Matrix bestätigt werden, um ihr organoidbildendes Potenzial als Indikator für die De-novo-Stemness im Zottenepithel zu bestimmen. Daher besteht der kritische Aspekt dieses Verfahrens darin, sicherzustellen, dass keine Kryptenkontamination vorliegt.

Die Smad4^KO:β-Catenin^GOF-bedingte Mutation verursacht eine Dedifferenzierung im Darmepithel, die durch die Expression von Proliferations- und Stammzellmarkern in den Zotten und schließlich die Bildung kryptenartiger Strukturen in den als ektopische Krypten bezeichneten Zotten gekennzeichnet ist Das Vorhandensein von Stammzellen, diese dedifferenzierten Zotten wurde durch die Expression von Stammzellmarkern in den ektopischen Krypten (in vivo) und die Fähigkeit der mutierten Zotten, Organoide zu bilden, bestimmt. en plattiert Matrigel³. Das unten erwähnte Verfahren erläutert die Methodik, die verwendet wird, um die Stammhaftigkeit des dedifferenzierenden Darmepithels in den Smad4^KO:β-Catenin^{GOF-mutierten} Mäusen zu bestätigen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methodik zur Isolierung von Zotten war die Verwendung des Abkratzens des Darmlumens im Gegensatz zur EDTA-Chelatbildungsmethode⁴. Anders als bei der EDTA-Chelat-Methode behält die Zottenisolierung durch Abkratzen den Großteil des darunter liegenden Mesenchyms bei und ermöglicht es, den Abkratzdruck so einzustellen, dass Zotten ohne angebundene Krypten ergeben. Der Abkratzdruck ist für den Bediener subjektiv, daher muss der optimale Druck, Zotten ohne angebundene Krypten zu liefern, vom Bediener empirisch bestimmt werden. Der kritische Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Abwesenheit von Kryptenkontamination durch mikroskopische Untersuchung der Zotten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der BME-R1-Matrix sicherzustellen.

Darmzotten werden mit Glasobjektträgern vom Darmlumen abgekratzt und in einen 70 μm-Filter gegeben und mit PBS gewaschen, um lose Zellen oder Krypten, falls vorhanden, loszuwerden, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden. Die Methode betont die folgenden Kriterien, um eine Kryptenkontamination zu vermeiden: a) Eingrenzen der Zottenernte auf die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms, wo die Zotten am längsten sind, b) Minimierung der Anzahl der Zotten-liefernden Kratzer, c) Waschen des Filters, der die Zotten enthält, durch eine Reihe von PBS in einer Sechs-Brunnen-Schüssel und d) Bestätigung des Fehlens einer Kryptakontamination durch mikroskopische Untersuchung vor und nach dem Plattieren in BME-R1-Matrix. Die Zottenisolierung durch Abkratzen und nicht durch EDTA-Chelatbildung verhindert den vollständigen Verlust des darunter liegenden Mesenchyms, das bei Bedarf die Nischensignale^5,6,7,⁸für die Organoidinitiierung aus dem Zottenepithel liefern kann.

Protokoll

Alle durchgeführten Mausexperimente, einschließlich der Verwendung von Tamoxifen und der Euthanasie durch Zervixluxation, hatten die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee am Stevens Institute of Echnology.

1. Mäuse

HINWEIS: Die Generation von Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 Mäuse wurden zuvor beschrieben³. Erwachsene weibliche Mäuse im Alter von acht bis zwölf Wochen wurden verwendet.

1. Induzieren Sie die Smad4^KO:β-Catenin-GOF-Mutation in der Smad4 f /^f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 mit intraperitonealer Injektion von Tamoxifen in Maisöl an vier aufeinanderfolgenden Tagen.
2. Opfern Sie die Mäuse zehn Tage nach der ersten Tamoxifen-Injektion durch zervikale Dislokation.
3. Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Mausfell in die Peritonealhöhle gelangt.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Sezierschere, um den Darm freizulegen. Isolieren Sie den Darm mit Hilfe von Schere und Zette.
   HINWEIS: Der gleichzeitige Verlust von Smad4 zusammen mit dem Gewinn einer Funktionsmutation von β-Catenin (Smad4^KO;β-Catenin^GOF) im Darmepithel wurde durch Injektion von^{Smad4f / f}erreicht; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 Mäuse täglich an vier aufeinanderfolgenden Tagen mit 0,05 g Tamoxifen/kg Körpergewicht in Maisöl. Diese Mäuse werden zehn Tage nach der ersten Tamoxifen-Injektion geerntet, um sicherzustellen, dass Zellen vorliegen, die Stammzell-assoziierte Marker in den dedifferenzierenden Zotten exprimieren.

2. Zwölffingerdarmisolierung und -vorbereitung

1. Sezieren Sie die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms.
2. Spülen Sie den Zwölffingerdarm mit 5 ml eiskaltem PBS in einer 10-ml-Spritze, um den Luminalgehalt zu klären.
3. Öffnen Sie den Zwölffingerdarm längs mit einer abgewinkelten Schere und legen Sie den Zwölffingerdarm flach auf eine 15 cm lange Petriplatte auf Eis mit dem Lumen des Zwölffingerdarms dem Bediener zugewandt.

3. Zottenisolierung durch Abkratzen

1. Bevor Sie mit dem Schaben beginnen, legen Sie ein 70 μm Mesh-Sieb in einen der Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Füllen Sie alle Vertiefungen mit 4 ml 1x PBS und legen Sie die 6-Well-Gewebekulturplatte auf Eis (Abbildung 1).
2. Kratzen Sie die Zotten wie folgt mit zwei mikroskopisch kleinen Glasobjektträgern: eine, um den Zwölffingerdarm festzuhalten und die andere zum Kratzen (Abbildung 1B1).
   1. Kratzen Sie die luminale Seite des Zwölffingerdarms oberflächlich zweimal hin und her, um den Schleim zu entfernen. Drücken Sie so, dass dieser Schritt die Schleimschicht entfernt, aber nicht die Zotten.
   2. Kratzen Sie den Zwölffingerdarm erneut ab, indem Sie zweimal den gleichen Druck wie in 3..1 anwenden, wobei sich Zotten auf den Objektträgern sammeln(Abbildung 1B2). Dies ist der optimale Druck (der vom Betreiber empirisch bestimmt werden muss), um die Zotten ohne angebundene Krypten zu erhalten.
3. Verwenden Sie ein 1-ml-Transferpipet, das PBS enthält, um die Zotten (die ab Schritt 3.2.2 auf dem Objektträger gesammelt werden) auf ein 70 μm-Maschensieb zu übertragen, das in einer 6-Well-Schüssel platziert ist. Die Zotten werden so nach jedem Kratzen gesammelt (Abbildung 1B2).
4. Waschen Sie die im 70 μm-Sieb gesammelten Zotten (ab Schritt 3.3), indem Sie das Sieb (mit den Zotten) durch eine Reihe von Vertiefungen in einer 6-Well-Schüssel mit kaltem PBS (~ 4 ml / Well) übertragen. Dies dient dazu, lose Krypten zu entfernen, falls vorhanden.
5. Übertragen Sie mit einer p1000-Pipett die Zottensuspension in PBS (~ 3 mL) vom 70 μm-Sieb auf ein neues 15-ml-Rohr auf Eis.
6. Verwenden Sie eine 0,1% BSA-beschichtete stumpfe p200-Pipettspitze, um 50 μL Volumen der Zottensuspension auf einen Glasträger anzusaugen. Zählen Sie die Anzahl der Zotten im 50 μL-Tröpfchen unter 4-facher Vergrößerung, um die Konzentration von Zotten in der PBS-Suspension zu bestimmen. Wenn sich beispielsweise 10 Zotten in der untersuchten 50 μL-Suspension befinden, beträgt die Zottenkonzentration 0,2 Zotten / μL. Dies ist auch die Zeit, um das Fehlen von angebundenen Krypten zu bestätigen.
7. Berechnen Sie das Volumen der Zottensuspension, das für die Platte in einer Konzentration von 0,5 Zotten / μL der BME-R1-Matrix erforderlich ist. Fügen Sie zusätzliche 100 μL hinzu, um den Pipettierfehler und das für die mikroskopische Untersuchung erforderliche Volumen zu berücksichtigen, um die Reinheit der Zotten sicherzustellen.
   VORSICHT: Der Druck, der in den ersten beiden Kratzern verwendet wird, der den Schleim, aber nicht die Zotten entfernt, sollte in den nachfolgenden Kratzern verwendet werden, bei denen Zotten freigesetzt werden. Begrenzen Sie die Anzahl der Hin- und Her-Kratzer auf zwei, nachdem die Zottenfreisetzung zum ersten Mal beobachtet wurde. Diese Maßnahme vermeidet die Freisetzung von Zotten mit den angebundenen Krypten. Es ist wichtig, die Zotten mikroskopisch zu bewerten, um sicherzustellen, dass die angebundenen Krypten fehlen.

4. Beschichtung von Zotten auf BME-R1-Matrix

1. Übertragen Sie unter Verwendung einer 0,1% BSA-beschichteten p200-Pipetenspitze mit stumpfem Ende das Volumen der Zotten (ab Schritt 3.6) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das erforderlich ist, um bei einer Dichte von ~ 6 Zotten pro Vertiefung in 12,5 μL BME-R1-Matrix zu platten. Die Verwendung der BSA-beschichteten stumpfen Spitze an dieser Stelle stellt sicher, dass die Zotten, die für eine spitze Spitze zu groß sind, angesaugt werden, ohne blockiert zu werden oder an den Seiten der Spitze zu kleben.
2. Drehen Sie die Zotten für 2 min bei 200 x g in einer Kühlzentrifuge (4 °C) herunter und entfernen Sie den Überstand.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2, um alle PBS-Reste zu entfernen, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt unter einer laminaren Strömungshaube fort.
4. Das Zottenpellet vorsichtig in der erforderlichen Menge an kaltem BME-R1 auf Eis auftauen.
5. Mit einer p20-Pipettplatte 12,5 μL/Vertiefung der Zotten in BME-R1-Matrix in 3D in einer vorgewärmten 96-Well-U-Bodenplatte.
6. Inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekulturinkubator bei 37 °C für 15 Minuten, um die Erstarrung der BME-R1-Matrix zu ermöglichen.
7. Fügen Sie 125 μL/Well vorgewärmter ENR-Medien (Epidermal Growth Factor/Noggin/R-spondin1) hinzu: fortgeschrittene DMEM F-12-Medien, ergänzt mit 1x Penicillin: Streptomycin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/ml EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% konditionierte Medien aus HEK293-T-Zellen, die R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-Acetylcystein und 0,05 mg/ml Primocin exprimieren.
8. Inkubieren Sie die plattierten Zotten in einem bei 37 °C gehaltenen Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO₂und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag.
9. Verwerfen Sie alle Vertiefungen, in denen Organoide vor zwei Tagen der Beschichtung erscheinen, da der früheste Zeitpunkt, an dem aus Zotten gewonnene Organoide erwartet werden, nach zwei Tagen ist.
   HINWEIS: Alle Zotten, die die Hälfte oder mehr als die Hälfte der Zottenlänge haben, werden als ein Zotten gezählt. Im Gegensatz zu kryptabasierten Organoiden werden von Zotten abgeleitete Organoide nicht innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung erwartet. Die organoidinitiierenden Zotten scheinen sich vor der Bildung von Organoiden zu verdunkeln und zu schrumpfen. Daher sollten alle Vertiefungen mit Organoiden, die sich innerhalb eines Tages nach der Beschichtung entwickeln, verworfen werden, um die Plausibilität einer plausiblen Kryptenkontamination zu vermeiden. Die zur Herstellung der konditionierten Medien verwendete Methodik ist auf Anfrage erhältlich.

Ergebnisse

Ausschlaggebend für den Erfolg des Verfahrens ist die Vermeidung von Kryptenkontaminationen. Die Organoidentwicklung aus den Zotten (und nicht aus kontaminierenden Krypten) wird durch die Bestätigung von vier Hauptkriterien sichergestellt: 1) Sicherstellung der Reinheit der geernteten Zotten durch mikroskopische Untersuchung vor und nach dem Plattieren der Zotten in BME-R1, 2) Beschichtung einer begrenzten Anzahl von Zotten pro Vertiefung, um die Visualisierung aller plattierten Zotten einzeln zu ermöglichen, 3) tägl...

Diskussion

Diese Methode kann die Selbsterneuerungsfähigkeit von dedifferenzierendem Zottenepithel bestätigen, das Stammzellmarker in vivo erwirbt. Das normale Darmepithel kann Organoide aus der Krypta, aber nicht aus dem Zottenkompartiment hervorbringen, wenn es in 3D kultiviert wird, da Stammzellen in den Krypten¹vorliegen. So bestätigt die Organoidbildung aus dem in 3D-Kulturen kultivierten dedifferenzierten Zottenepithel die Stammzellbildung aus der Zellschicksalsumkehr. Berichte über die Um...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770