장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

요약

절차는 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 결정하기 위하여 변태를 겪고 있는 마우스 상피에서 융모의 격리를 기술합니다.

초록

장 상피에서 유기체의 clonogenicity는 그 안에 줄기 세포의 존재에 기인한다. 마우스 작은 장 상피는 지하실과 사악으로 구획된다 : 줄기와 증식 세포는 지하실에 국한된 반면, 사악한 상피는 분화 된 세포만 포함합니다. 따라서, 정상적인 장 지하실, 하지만 villi, 3D 문화권에서 오르가노이드를 초래할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 줄기로 이끌어 내는 무관심을 겪고 있는 상피상에만 적용됩니다. 설명된 방법은 Smad4-loss-of-function:β-카테닌 게인-기능(Smad4KO:β-카테닌^GOF)조건부 돌연변이 마우스를 사용한다. 돌연변이는 사순에서 줄기 세포를 분화하고 생성하는 장 빌리를 일으키는 원인이 됩니다. 비차별화를 겪고 있는 장 내 의 빌리는 유리 슬라이드를 사용하여 장에서 긁어 내고, 70 μm 스트레이너에 배치하고 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 나 토굴을 걸러 내어 오르노이드 형성 잠재력을 결정합니다. 두 가지 주요 기준은 생성된 오르가노이드가 암호가 아닌 분산 된 빌루스 구획에서 개발되었는지 확인하는 데 사용되었습니다 : 1) 3D 매트릭스에서 도금 전후의 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 고립 된 비방을 현미경으로 평가하고, 2) 빌리에서 오르가노이드 개발 과정을 모니터링. 빌리에서 유기성 개시는 도금 후 2 ~ 5 일 만 발생하고 불규칙한 모양으로 나타납니다, 같은 장 상피에서 crypt 유래 오르가노이드는 도금의 16 시간 이내에 명백하고 구형 나타납니다. 그러나 이 방법의 한계는 형성된 오르가노이드의 수와 비리로부터의 오르가노이드 개시에 필요한 시간은 비차별화 정도에 따라 달라지므로 이다. 따라서, 돌연변이의 특이성 또는 비차별화를 일으키는 모욕에 따라, 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 분석하기 위하여 빌리를 수확할 수 있는 최적 단계는 경험적으로 결정되어야 합니다.

서문

장 내 지하실은 빌리가 아니라, Matrigel 또는 BME-R1 매트릭스에서 배양 할 때 오르가노이드를 형성합니다. 이러한 오르가노이드는 생체 내 장 상피에 존재하는 다양한 분화 계보, 선조 및 줄기 세포의 존재로 인해 종종 "미니 창자"라고도 하는 자가 조직 구조입니다. 토굴에서 오르가노이드를 형성 할 수있는 잠재력은 줄기 세포^1의존재에 기인한다. 반면에 장 내 빌리는 분화 된 세포로만 구성되므로 오르가노이드를 형성 할 수 없습니다. 그러나, 돌연변이² 또는 빌루스 상피의 비차별화를 허용하는 조건은 빌리^2,3에서줄기 세포로 이어질 수 있다. 이 운명의 변화는 3D 매트릭스에서 차별화된 빌루스 상피를 도금하여 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 골라서 알루루스 에피테륨의 탈노보 줄기의 지표로서 확인할 수 있다. 따라서 이 절차의 중요한 측면은 토굴 오염이 없는지 확인하는 것입니다.

Smad4^KO:β-카테닌^GOF 조건부 돌연변이는 빌리에서 증식 및 줄기 세포 마커의 발현에 의해 표시된 장 상피에서 차별성을 유발하며, 그리고 결국 자궁 외토로 지칭되는 빌리에서 토굴과 같은 구조물의 형성이 이러한 분리된 빌리의 존재는 자궁 내 의 줄기 세포 마커의 발현(byvivo)과가구형 을 형성하는 돌연변이 빌리의 능력에 의해 결정되었다. en 도금 된 마트리겔³. 앞서 언급한 절차는 Smad4 KO:β-카테닌^GOF 돌연변이 마우스에서 차별화된 장 상피의줄기를 확인하는 데 사용되는 방법론을 정교하게 설명합니다. 비방을 격리하기 위한 이 방법론의 주요 특징은 EDTA 킬레이션 방법^4와는 반대로 장 루멘의 긁어내는 사용이었습니다. EDTA 킬레이션 방법과 달리 긁어내면 비방 격리는 기본 메센치메의 대부분을 유지하고 테더링 된 토굴없이 비방을 생성하도록 긁는 압력을 조정할 수 있습니다. 스크래핑의 압력은 작업자에게 주관적이기 때문에 스테인드 없이 비방을 산출하는 최적의 압력은 작업자에 의해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이 절차의 중요한 측면은 BME-R1 매트릭스에서 도금 전후에 모두 villi의 현미경 검사에 의해 토굴 오염의 부재를 보장하는 것입니다.

장 내 빌리는 유리 슬라이드로 장 루멘을 긁어 내고 70 μm 필터에 배치하고 PBS로 세척하여 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 또는 토굴을 제거합니다. 방법은 지하실 오염을 방지하기 위해 다음과 같은 기준에 강조 : a) 빌리가 가장 긴 십이지장의 근위 절반을 수확 하도록, b) 사악한 항복 긁힌 자국의 수를 최소화하고, c) 6웰 접시에서 일련의 PBS를 통해 빌리를 함유하는 필터를 세척하고, d) BME-R1 매트릭스에서 도금 전후현미경 검사에 의한 토굴 오염의 부재를 확인한다. EDTA 킬레이션이 아닌 긁어내어 빌리 격리는, 빌루스 상피로부터 의유기 개시를 위해, 필요한 경우 틈새 신호^5,6,7,8을제공할 수 있는 근본적인 메센치움의 완전한 손실을 방지한다.

프로토콜

자궁 경부 탈구에 의한 타목시펜과 안락사의 사용을 포함하여 수행 된 모든 마우스 실험은 스티븐스 에첸학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 마우스

참고 : Smad4^{f / f의}세대; 캐스롭^{록스 (ex3)}/⁺; 빌린-Cre^ERT2 마우스는 이전에^3로기술되었다. 성인 여성 마우스 사이 8 받는 다열 한 주 사용 했다.

1. Smad4^KO유도 :β 카테닌^GOF 돌연변이를 Smad4^f/f에서유도; 캐스롭^{록스 (ex3)}/⁺; 빌린-Cre^ERT2 와 천막 주입 옥수수 기름에 4 일 연속.
2. 첫 번째 타목시펜 주입 후 10 일 동안 마우스비 자궁 경부 탈구를 희생하십시오.
3. 마우스 털이 복막 구멍으로 들어가는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하십시오.
4. 해부 가위로 복강을 열어 내장을 노출시다. 가위와 집게의 도움으로 내장을 분리한다.
   참고 : 장 상피에서 β 카테닌 (Smad4^KO;β-카테닌^GOF)의 기능 돌연변이의 이득과 함께 Smad4의 수반적 손실은^{Smad4f / f를}주입하여 달성되었다; 캐스롭^{록스 (ex3)}/⁺; 빌린-Cre^ERT2 마우스는 옥수수 기름에 있는 0.05 g 타목시펜/kg 체중으로 4일 연속 매일 마우스. 이 마우스는 제1 타목시펜 주입 후 10일 후에 수확되어 비차별화 된 빌리에서 줄기 세포 관련 마커를 표현하는 세포의 존재를 보장합니다.

2. 십이지덴 고립과 준비

1. 십이지장의 근위 절반을 해부한다.
2. 10mL 주사기로 5mL의 얼음-차가운 PBS로 십이지장들을 플러시하여 발광 함량을 제거합니다.
3. 각진 가위로 십이지장 위를 세로로 열고 15cm 페트리 플레이트에 듀오덴을 평평하게 놓고, 듀오덴의 루멘이 연산자(duodenum)의 루멘을 향합니다.

3. 긁어내어 빌리 격리

1. 스크레이핑을 시작하기 전에 70 μm 메쉬 스트레이너를 6웰 조직 배양 플레이트의 우물 중 하나에 놓습니다. 모든 우물을 1x PBS4mL로 채우고 6웰 조직 배양판을 얼음 위에 놓습니다(그림1).
2. 두 개의 현미경 유리 슬라이드를 사용하여 다음과 같이 담악을 긁어 : 하나는 십이지장 아래로 개최하고 다른 긁어(그림 1B1).
   1. 점액을 제거하기 위해 피상적으로 두 번 십이지장의 발광 면을 긁어 두 번. 이 단계는 점액 층을 제거하지만 villi가 아닌 압력을 가하십시오.
   2. 십이지장 두 번 긁어 내고, 3.1에서와 동일한 압력을 두 번 적용하여 슬라이드에서 수집하는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B2). 이것은 스테더없이 비방을 산출하기 위해 (작업자에 의해 경험적으로 결정되어야)최적 압력입니다.
3. PBS가 포함된 1mL 이송 파이프를 사용하여 6웰 접시에 배치된 70μm 메쉬 스트레이너로 비방(3.2.2.2.단계에서 슬라이드에서 수집)을 전송합니다. 모든 긁힘(그림1B2)이지나면, 따라서 빌리가 수집된다.
4. 70 μm 여조기(3.3단계에서)에서 수집된 빌리를 차가운 PBS(~4mL/웰)가 함유된 6웰 접시에 일련의 우물을 통해 스트레이너(빌리 포함)를 이송하여 세척합니다. 이것은 느슨한 토굴을 제거하는 것입니다.
5. p1000 pipet를 사용하여 PBS(~3mL)의 빌리 서스펜션을 70 μm 스트레이너에서 얼음 위에 새로운 15mL 튜브로 옮기습니다.
6. 0.1% BSA 코팅 된 무딘 끝 p200 파이프 팁을 사용하여 유리 슬라이드에 빌리 서스펜션의 50 μL 볼륨을 흡인하십시오. PBS 서스펜션에서 빌리의 농도를 결정하기 위해 4배 배율 아래 50 μL 액적에서 빌리수를 계산합니다. 예를 들어, 검사된 50 μL 서스펜션에 10개의 빌리가 있는 경우, 빌리 농도는 0.2 빌리/μL입니다. 또한 테더드 토굴의 부재를 확인할 시간입니다.
7. BME-R1 매트릭스의 0.5 빌리/μL 농도로 플레이트에 필요한 빌리 서스펜션의 부피를 계산합니다. 100 μL을 추가하여 배관 오류와 villi의 순도를 보장하는 데 필요한 미세한 검사에 필요한 부피를 고려합니다.
   주의: 점액을 제거하지만 빌리가 아닌 처음 두 긁힌 자국에 사용되는 압력은 후속 긁힘에서 사용되어야 하며, 그 동안 빌리가 방출됩니다. 빌리 릴리스가 처음 관찰된 후 두 개로 긁는 횟수를 제한합니다. 이 측정값은 테더드된 토굴로 비방이 방출되는 것을 방지합니다. 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 악의적 인 것을 현미경으로 평가하는 것이 필수적입니다.

4. BME-R1 매트릭스에 빌리도금

1. 0.1% BSA 코팅 p200 무딘 말단 파이펫 팁을 사용하여, BME-R1 매트릭스의 12.5 μL에서 잘 - 6 빌리의 밀도로 플레이트에 필요한 빌리의 부피 (단계 3.6에서) 마이크로 센심 심분리기 튜브로 전송. 이 시점에서 BSA 코팅 무딘 끝의 사용은 뾰족한 팁에 너무 큰 빌리가 팁의 측면에 붙어있는 것을 막거나 잃지 않고 흡인되도록합니다.
2. 냉장 원심분리기(4°C)에서 200 x g에서 2분 동안 빌리를 회전시키고 상퍼를 제거합니다.
3. 단계 4.2를 반복하여 잔류 PBS를 제거하고 라미나르 유동 후드 아래다음 단계로 진행합니다.
4. 얼음 위에 해동된 차가운 BME-R1의 필요에 따라 빌리 펠릿을 부드럽게 재차 놓습니다.
5. p20 파이펫을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 빌리 12.5 μL/웰을 3D로 예온된 96웰 U-바닥 플레이트에 사용한다.
6. BME-R1 매트릭스의 응고를 허용하기 위해 37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 15분 동안 배양한다.
7. 사전 따뜻하게 된 ENR (표피 성장 인자 / Noggin / R-spondin1) 미디어의 125 μL / 웰추가: 고급 DMEM F-12 미디어, 1x 페니실린으로 보충: 스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL 노긴, 5% HEK293-T 세포에서 컨디셔닝 된 미디어 R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acete 05.
8. 조직 배양인 인큐베이터에서 도금 된 빌리를 5% CO_2로37°C로 유지하여 격일로 배지를 변경한다.
9. 빌리 유래 오르가노이드가 예상되는 초기 시점이 2일 후에 예상되기 때문에 오르가노이드가 도금 2일 전에 나타나는 우물을 버리십시오.
   참고: 빌리 길이의 절반 이상인 모든 빌리는 하나의 빌루로 계산됩니다. 토굴 유래 오르가노이드와 달리, 빌리 유래 오르가노이드는 도금 후 24시간 이내에 예상되지 않습니다. 오르가노이드를 개시하는 빌리는 오르가노이드 형성 전에 어두워지고 축소되는 것처럼 보입니다. 따라서, 도금의 하루 이내에 개발 오르가노이드와 모든 우물은 그럴듯한 지하실 오염에서 파생 된 데의 타당성을 피하기 위해 폐기되어야한다. 조건부 미디어를 생성하는 데 사용되는 방법론은 요청 시 사용할 수 있습니다.

결과

절차의 성공을 위한 결정적인 요소는 토굴 오염을 방지하는 것입니다. 비리에서 유기성 개발 (그리고 어떤 오염 토굴에서) 네 가지 주요 기준을 확인하 여 보장: 1) BME-R1에서 빌리를 도금 전후 현미경 검사에 의해 수확 된 담블리의 순도 보장, 2) 모든 도금 된 villi개별적으로, 3) 모든 도금 된 빌리의 시각화를 허용 하기 위해 잘 당 한정된 수의 빌리를 도금; 시간 과정의 이미지는 빌리

토론

이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 비차별화 된 악성 상피의 자체 갱신 능력을 확인할 수 있습니다. 일반적인 장 상피는 토굴^1에서줄기 세포의 존재때문에 3D로 배양 할 때 지하실에서 오르가노이드를 발생시키지만 빌리 컴파트먼트는 발생할 수 있습니다. 따라서, 3D 배양에서 배양된 탈분화된 빌리 상피로부터의 오르간구형 형성은 세포 운명 반전으로부터...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770