Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente

Resumo

O procedimento descreve o isolamento do villi do epitélio intestinal do camundongo submetido à desdiferente para determinar seu potencial de formação organoide.

Resumo

A clonogenicidade dos organoides do epitélio intestinal é atribuída à presença de células-tronco. O pequeno epitélio intestinal do camundongo é compartimentalizado em criptas e villi: o caule e as células proliferadoras estão confinados às criptas, enquanto o epitélio villi contém apenas células diferenciadas. Assim, as criptas intestinais normais, mas não as villi, podem dar origem a organoides em culturas 3D. O procedimento aqui descrito é aplicável apenas ao epitélio villus submetido à desdiferenteidade que leva à haste. O método descrito usa o smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4^KO:β-catenin^GOF) rato mutante condicional. A mutação faz com que o villi intestinal desdifera e gere células-tronco no villi. Villi intestinal submetido à desdiferenteização são raspados do intestino usando lâminas de vidro, colocados em um coador de 70 μm e lavados várias vezes para filtrar quaisquer células soltas ou criptas antes do revestimento na matriz BME-R1 para determinar seu potencial de formação organoide. Dois critérios principais foram utilizados para garantir que os organoides resultantes fossem desenvolvidos a partir do compartimento villus dediferente e não das criptas: 1) avaliando microscopicamente o villi isolado para garantir a ausência de quaisquer criptas amarradas, antes e depois do revestimento na matriz 3D, e 2) monitorando o curso temporal do desenvolvimento organoide do villi. A iniciação organoide do villi ocorre apenas dois a cinco dias após o revestimento e parece irregularmente moldada, enquanto os organoides derivados da cripta do mesmo epitélio intestinal são aparentes dentro de dezesseis horas de revestimento e parecem esféricos. A limitação do método, no entanto, é que o número de organoides se formou, e o tempo necessário para a iniciação organoide a partir do villi variam dependendo do grau de desdiferenciação. Portanto, dependendo da especificidade da mutação ou do insulto que causa a desdiferente, o estágio ideal em que villi pode ser colhido para avaliar seu potencial organoide formando, deve ser determinado empiricamente.

Introdução

As criptas intestinais, mas não villi, formam organoides quando cultivadas na matriz Matrigel ou BME-R1. Esses organoides são estruturas auto-organizadas, muitas vezes referidas como o "mini-intestino" devido à presença das várias linhagens diferenciadas, progenitora e células-tronco presentes no epitélio intestinal in vivo. O potencial de formar organoides a partir de criptas é atribuído à presença de células-tronco¹. Os villi intestinais, por outro lado, consistem apenas em células diferenciadas e, portanto, não podem formar organoides. No entanto, mutações² ou condições que permitam a desdiferenteação do epitélio villus podem levar a células-tronco no villi^2,3. Esta mudança de destino que resulta em caule no epitélio de villi pode ser confirmada pelo chapeamento do epitélio villus dediferente na matriz 3D para determinar seu potencial de formação organoide como um indicador de de-novo caule no epitélio villus. Portanto, o aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta.

A mutação condicional Smad4^KO:β-catenin^GOF causa dediferente no epitélio intestinal marcado pela expressão de proliferação e marcadores de células-tronco no villi, e eventualmente a formação de estruturas anptóricas nos villi referidas como criptas ectópicas A presença de células-tronco essas villidiferentes foi determinada pela expressão de marcadores de células-tronco nas criptas ectópicas(in vivo)e pela capacidade da villi mutante de formar organoides wh en matrigel^{banhado 3}. O procedimento abaixo mencionado elabora a metodologia utilizada para confirmar a haste do epitélio intestinal dediferente no Smad4^KO:β-catenin^GOF mutantes. Uma característica fundamental dessa metodologia para isolar villi foi o uso de raspagem do lúmen intestinal, em oposição ao método de quelação EDTA⁴. Ao contrário do método de quelação EDTA, o isolamento de Villi, raspando, retém a maioria do mesenquima subjacente e permite ajustar a pressão de raspagem para produzir villi sem criptas amarradas. A pressão da raspagem é subjetiva ao operador, portanto, a pressão ideal para produzir villi sem criptas amarradas deve ser determinada empiricamente pelo operador. O aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta por exame microscópico do villi antes e depois do revestimento na matriz BME-R1.

Villi intestinal são raspados do lúmen intestinal com lâminas de vidro e colocados em um filtro de 70 μm e lavados com PBS para se livrar de células soltas ou criptas, se houver, antes de chapeamento na matriz BME-R1. O método enfatiza os seguintes critérios para evitar a contaminação da cripta: a) confinar a colheita de villi a metade proximal do duodeno onde os villi são os mais longos, b) minimizando o número de arranhões que produzem villi, c) lavar o filtro contendo o villi através de uma série de PBS em um prato de seis poços, e d) confirmando a ausência de contaminação cripta por exame microscópico antes e depois do revestimento na matriz BME-R1. O isolamento de Villi raspando, e não pela quelação edta, evita a perda completa do mesenquima subjacente que pode fornecer os sinais de nicho^5,6,7,8, se necessário, para iniciação organoide a partir do epitélio villus.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos realizados, incluindo o uso de tamoxifen e eutanásia por deslocamento cervical, tiveram a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Instituto Stevens de ecnologia.

1. Ratos

NOTA: A geração de Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Os camundongos Villin-Cre^ERT2 foram descritos anteriormente³. Camundongos adultos entre oito e doze semanas de idade foram usados.

1. Induzir a mutação Smad4^KO:β-catenin^GOF no Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 com injeção intraperitoneal de Tamoxifen em óleo de milho por quatro dias consecutivos.
2. Sacrifique a luxação cervical 10 dias após a primeira injeção de tamoxifen.
3. Pulverize o abdômen com 70% de etanol para evitar que o pelo do rato entre na cavidade peritoneal.
4. Abra a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecção para expor o intestino. Isole o intestino com o auxílio da tesoura e fórceps.
   NOTA: A perda concomitante de Smad4 juntamente com o ganho de mutação de função de β-catenin (Smad4^KO;β-catenin^GOF) no epitélio intestinal foi atingida pela injeção de^Smad4f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 camundongos todos os dias por quatro dias consecutivos com 0,05 g de peso corporal tamoxifen/kg em óleo de milho. Estes camundongos são colhidos dez dias após a primeira injeção de tamoxifen para garantir a presença de células expressando marcadores associados a células-tronco no villi dediferente.

2. Isolamento e preparação do duodeno

1. Disseca a metade proximal do duodeno.
2. Lave o duodeno com 5 mL de PBS gelado em uma seringa de 10 mL para limpar o conteúdo luminal.
3. Abra o duodeno longitudinalmente com uma tesoura angular e coloque o duodeno plano em uma placa de Petri de 15 cm no gelo com o lúmen do duodeno de frente para o operador.

3. Isolamento de Villi raspando

1. Antes de começar a raspagem, coloque um coador de malha de 70 μm em um dos poços de uma placa de cultura tecidual de 6 poços. Encha todos os poços com 4 mL de PBS 1x e coloque a placa de cultura tecidual de 6 poços no gelo(Figura 1).
2. Raspe o villi da seguinte forma usando dois slides de vidro microscópicos: um para segurar o duodeno para baixo e o outro para raspar(Figura 1B1).
   1. Raspe o lado luminal do duodeno superficialmente para lá e para cá duas vezes para remover o muco. Aplique pressão de tal forma que este passo remova a camada de muco, mas não o villi.
   2. Raspe o duodeno novamente, para lá e para cá duas vezes aplicando a mesma pressão que em 3..1, durante o qual villi pode ser visto coletando nos slides(Figura 1B2). Esta é a pressão ideal (que deve ser determinada empiricamente pelo operador) para produzir o villi sem as criptas amarradas.
3. Use um tubo de transferência de 1 mL contendo PBS para transferir o villi (que são coletados no slide da etapa 3.2.2.) para um coador de malha de 70 μm colocado em um prato de 6 poços. Os villi são recolhidos assim, após cada arranhão(Figura 1B2).
4. Lave o villi coletado no coador de 70 μm (a partir da etapa 3.3) transferindo o coador (com o villi) através de uma série de poços em um prato de 6 poços contendo PBS frio (~ 4 mL/well). Isto é para remover criptas soltas, se houver.
5. Usando um tubo p1000, transfira a suspensão villi em PBS (~ 3 mL) do coador de 70 μm para um novo tubo de 15 mL no gelo.
6. Use uma ponta de tubulação p200 revestida com 0,1% BSA para aspirar 50 μL de volume da suspensão villi em um slide de vidro. Conte o número de villi na gotícula de 50 μL sob ampliação de 4x para determinar a concentração de villi na suspensão pbs. Por exemplo, se houver 10 villi na suspensão de 50 μL examinada, então a concentração de villi é de 0,2 villi/μL. Este também é o momento para confirmar a ausência de criptas amarradas.
7. Calcule o volume de suspensão de villi necessário para a placa em uma concentração de 0,5 villi/μL da matriz BME-R1. Adicione 100 μL extras para explicar o erro de pipetação e o volume necessário para o exame microscópico necessário para garantir a pureza do villi.
   ATENÇÃO: A pressão utilizada nos dois primeiros arranhões, que remove o muco, mas não o villi, deve ser usada nos arranhões subsequentes durante os quais villi será liberado. Limitar o número de raspagens para lá e para cá para dois após a liberação de villi é observado pela primeira vez. Esta medida evita a liberação de villi com as criptas amarradas. É essencial avaliar microscopicamente o villi para garantir a ausência das criptas amarradas.

4. Chapeamento de villi na matriz BME-R1

1. Utilizando uma ponta de tubulação revestida de 0,1% BSA p200, transfira para um tubo de microcentrifusagem o volume de villi (a partir da etapa 3.6) necessário para a placa a uma densidade de ~ 6 villi por poço em 12,5 μL de matriz BME-R1. O uso de ponta sem corte revestida com BSA neste ponto garante que os villi, que são muito grandes para uma ponta pontiaguda, sejam aspirados sem serem bloqueados ou perdidos por ficarem presos às laterais da ponta.
2. Gire o villi por 2 min a 200 x g em uma centrífuga refrigerada (4 °C) e remova o supernatante.
3. Repita o passo 4.2 para remover qualquer PBS residual e proceda para o próximo passo sob um capô de fluxo laminar.
4. Resuspenque a pelota de villi suavemente na quantidade necessária de BME-R1 frio descongelado no gelo.
5. Utilizando um tubo p20, placa 12,5 μL/bem do villi na matriz BME-R1 em 3D em uma placa de fundo U pré-armada de 96 poços.
6. Incubar a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C por 15 minutos para permitir a solidificação da matriz BME-R1.
7. Adicionar 125 μL/bem de ENR pré-aquecido (fator de crescimento epidérmico/Noggin/R-spondin1) mídia: mídia DMEM F-12 avançada, suplementada com 1x Penicilina: Estreptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% de mídia condicionada de células HEK293-T expressando R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine e 0,05 mg/mL Primocin.
8. Incubar o villi banhado em uma incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 °C com 5% de CO₂, e mudar a mídia a cada dois dias.
9. Descarte qualquer poço em que organoides apareçam antes de dois dias de chapeamento, já que o ponto de tempo mais antigo em que os organoides derivados de Villi são esperados é depois de dois dias.
   NOTA: Qualquer villi que tenha metade ou mais da metade do comprimento de villi são contados como um villus. Ao contrário dos organoides derivados da cripta, os organoides derivados de villi não são esperados dentro de 24 horas após o revestimento. As villis que iniciam organoides parecem estar escurecendo e encolhendo antes da formação de organoides. Assim, quaisquer poços com organoides em desenvolvimento dentro de um dia de revestimento devem ser descartados para evitar a plausibilidade de ter derivado da contaminação plausmática cripta. A metodologia utilizada para produzir os meios condicionados está disponível mediante solicitação.

Resultados

O fator determinante para o sucesso do procedimento é prevenir a contaminação por cripta. O desenvolvimento organoide a partir do villi (e não de qualquer criptas contaminantes) é assegurado confirmando quatro critérios principais: 1) assegurando a pureza do villi colhido por exame microscópico antes e depois de emplacar o villi em BME-R1, 2) emplacando o número limitado de villi por poço para permitir a visualização de todos os villi banhados individualmente, 3) onitoring o desenvolvimento de organoide diaria...

Discussão

Este método pode confirmar a capacidade de auto-renovação de dediferente villi epitélio que adquire marcadores de células-tronco in vivo. O epitélio intestinal normal pode dar origem a organoides da cripta, mas não do compartimento villi, quando cultivado em 3D por causa da presença de células-tronco nas criptas¹. Assim, a formação organoide a partir do epitélio villi dediferenciado cultivado em culturas 3D confirma a formação de células-tronco a partir da reversão do dest...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770