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O procedimento descreve o isolamento do villi do epitélio intestinal do camundongo submetido à desdiferente para determinar seu potencial de formação organoide.
A clonogenicidade dos organoides do epitélio intestinal é atribuída à presença de células-tronco. O pequeno epitélio intestinal do camundongo é compartimentalizado em criptas e villi: o caule e as células proliferadoras estão confinados às criptas, enquanto o epitélio villi contém apenas células diferenciadas. Assim, as criptas intestinais normais, mas não as villi, podem dar origem a organoides em culturas 3D. O procedimento aqui descrito é aplicável apenas ao epitélio villus submetido à desdiferenteidade que leva à haste. O método descrito usa o smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4KO:β-cateninGOF) rato mutante condicional. A mutação faz com que o villi intestinal desdifera e gere células-tronco no villi. Villi intestinal submetido à desdiferenteização são raspados do intestino usando lâminas de vidro, colocados em um coador de 70 μm e lavados várias vezes para filtrar quaisquer células soltas ou criptas antes do revestimento na matriz BME-R1 para determinar seu potencial de formação organoide. Dois critérios principais foram utilizados para garantir que os organoides resultantes fossem desenvolvidos a partir do compartimento villus dediferente e não das criptas: 1) avaliando microscopicamente o villi isolado para garantir a ausência de quaisquer criptas amarradas, antes e depois do revestimento na matriz 3D, e 2) monitorando o curso temporal do desenvolvimento organoide do villi. A iniciação organoide do villi ocorre apenas dois a cinco dias após o revestimento e parece irregularmente moldada, enquanto os organoides derivados da cripta do mesmo epitélio intestinal são aparentes dentro de dezesseis horas de revestimento e parecem esféricos. A limitação do método, no entanto, é que o número de organoides se formou, e o tempo necessário para a iniciação organoide a partir do villi variam dependendo do grau de desdiferenciação. Portanto, dependendo da especificidade da mutação ou do insulto que causa a desdiferente, o estágio ideal em que villi pode ser colhido para avaliar seu potencial organoide formando, deve ser determinado empiricamente.
As criptas intestinais, mas não villi, formam organoides quando cultivadas na matriz Matrigel ou BME-R1. Esses organoides são estruturas auto-organizadas, muitas vezes referidas como o "mini-intestino" devido à presença das várias linhagens diferenciadas, progenitora e células-tronco presentes no epitélio intestinal in vivo. O potencial de formar organoides a partir de criptas é atribuído à presença de células-tronco1. Os villi intestinais, por outro lado, consistem apenas em células diferenciadas e, portanto, não podem formar organoides. No entanto, mutações2 ou condições que permitam a desdiferenteação do epit....
Todos os experimentos com camundongos realizados, incluindo o uso de tamoxifen e eutanásia por deslocamento cervical, tiveram a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Instituto Stevens de ecnologia.
1. Ratos
NOTA: A geração de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Os camundongos Villin-CreERT2 foram descritos anteriormente3. Camundongos adultos entre oito e doze semanas de idade foram usados.
O fator determinante para o sucesso do procedimento é prevenir a contaminação por cripta. O desenvolvimento organoide a partir do villi (e não de qualquer criptas contaminantes) é assegurado confirmando quatro critérios principais: 1) assegurando a pureza do villi colhido por exame microscópico antes e depois de emplacar o villi em BME-R1, 2) emplacando o número limitado de villi por poço para permitir a visualização de todos os villi banhados individualmente, 3) onitoring o desenvolvimento de organoide diaria.......
Este método pode confirmar a capacidade de auto-renovação de dediferente villi epitélio que adquire marcadores de células-tronco in vivo. O epitélio intestinal normal pode dar origem a organoides da cripta, mas não do compartimento villi, quando cultivado em 3D por causa da presença de células-tronco nas criptas1. Assim, a formação organoide a partir do epitélio villi dediferenciado cultivado em culturas 3D confirma a formação de células-tronco a partir da reversão do dest.......
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Esta publicação foi apoiada pelo Prêmio Número K22 CA218462-03 do NiH National Cancer Institute. As células HEK293-T expressando R-Spondin1 foi um presente generoso do Dr. Michael P. Verzi.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
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