Cultivo 3D de organoides del epitelio de las vellosidades intestinales sometidos a desdiferenciación

Resumen

El procedimiento describe el aislamiento de las vellosidades del epitelio intestinal del ratón sometido a desdiferenciación para determinar su potencial de formación de organoides.

Resumen

La clonogenicidad de los organoides del epitelio intestinal se atribuye a la presencia de células madre en el mismo. El epitelio del intestino delgado del ratón está compartimentado en criptas y vellosidades: las células madre y proliferantes están confinadas a las criptas, mientras que el epitelio de las vellosidades contiene solo células diferenciadas. Por lo tanto, las criptas intestinales normales, pero no las vellosidades, pueden dar lugar a organoides en cultivos 3D. El procedimiento descrito aquí es aplicable solo a las vellosidades epiteliales sometidas a desdiferenciación que conduce a la esteronía. El método descrito utiliza el ratón mutante condicional Smad4-pérdida-de-función:β-catenina ganancia-de-función (Smad4 KO:β-catenina^GOF). La mutación hace que las vellosidades intestinales se desdiferencian y generen células madre en las vellosidades. Las vellosidades intestinales sometidas a desdiferenciación se raspan del intestino utilizando portaobjetos de vidrio, se colocan en un colador de 70 μm y se lavan varias veces para filtrar cualquier célula suelta o criptas antes del recubrimiento en la matriz BME-R1 para determinar su potencial de formación de organoides. Se utilizaron dos criterios principales para garantizar que los organoides resultantes se desarrollaran a partir del compartimento de vellosidades desdiferenciantes y no de las criptas: 1) evaluar microscópicamente las vellosidades aisladas para garantizar la ausencia de criptas atadas, tanto antes como después del revestimiento en la matriz 3D, y 2) monitorear el curso temporal del desarrollo de organoides desde las vellosidades. La iniciación organoidea de las vellosidades ocurre solo de dos a cinco días después del recubrimiento y aparece con forma irregular, mientras que los organoides derivados de la cripta del mismo epitelio intestinal son evidentes dentro de las dieciséis horas posteriores al recubrimiento y parecen esféricos. La limitación del método, sin embargo, es que el número de organoides formados y el tiempo requerido para la iniciación organoide de las vellosidades varían según el grado de desdiferenciación. Por lo tanto, dependiendo de la especificidad de la mutación o el insulto que causa la desdiferenciación, la etapa óptima en la que se pueden cosechar vellosidades para evaluar su potencial de formación de organoides debe determinarse empíricamente.

Introducción

Las criptas intestinales, pero no las vellosidades, forman organoides cuando se cultivan en matriz Matrigel o BME-R1. Estos organoides son estructuras autoorganizadas, a menudo denominadas "mini-intestino" debido a la presencia de los diversos linajes diferenciados, progenitores y células madre presentes en el epitelio intestinal in vivo. El potencial para formar organoides a partir de criptas se atribuye a la presencia de células madre¹. Las vellosidades intestinales, por otro lado, consisten solo en células diferenciadas y, por lo tanto, no pueden formar organoides. Sin embargo, las mutaciones² o condiciones que permiten la desdiferenciación del epitelio de las vellosidades pueden conducir a células madre en las vellosidades^2,3. Este cambio de destino que resulta en el tallo en el epitelio de las vellosidades se puede confirmar mediante el recubrimiento del epitelio de vellosidad desdiferenciante en la matriz 3D para determinar su potencial de formación de organoides como un indicador de la virola de novo en el epitelio de las vellosidades. Por lo tanto, el aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por criptas.

La mutación condicional Smad4^KO:β-catenina^GOF causa desdiferenciación en el epitelio intestinal marcada por la expresión de la proliferación y los marcadores de células madre en las vellosidades, y eventualmente la formación de estructuras similares a criptas en las vellosidades conocidas como criptas ectópicas La presencia de células madre estas vellosidades desdiferenciadas fue determinada por la expresión de marcadores de células madre en las criptas ectópicas(in vivo)y la capacidad de las vellosidades mutantes para formar organoides wh en chapado Matrigel³. El procedimiento mencionado a continuación elabora la metodología utilizada para confirmar el tallo del epiteliointestinal indiferenciante en los ratones mutantes Smad4 KO:β-catenina^GOF. Una característica clave de esta metodología para aislar las vellosidades fue el uso del raspado de la luz intestinal, a diferencia del método de quelación con EDTA⁴. A diferencia del método de quelación EDTA, el aislamiento de vellosidades por raspado retiene la mayoría del mesénquima subyacente y permite ajustar la presión del raspado para producir vellosidades sin criptas atadas. La presión de raspado es subjetiva para el operador, por lo tanto, la presión óptima para producir vellosidades sin criptas atadas debe ser determinada empíricamente por el operador. El aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por cripta mediante el examen microscópico de las vellosidades tanto antes como después del recubrimiento en la matriz BME-R1.

Las vellosidades intestinales se raspan de la luz intestinal con portaobjetos de vidrio y se colocan en un filtro de 70 μm y se lavan con PBS para deshacerse de las células sueltas o criptas, si las hay, antes del recubrimiento en la matriz BME-R1. El método hace hincapié en los siguientes criterios para evitar la contaminación de la cripta: a) confinar las vellosidades de la mitad proximal del duodeno donde las vellosidades son las más largas, b) minimizar el número de rasguños que producen vellosidades, c) lavar el filtro que contiene las vellosidades a través de una serie de PBS en un plato de seis pozos, y d) confirmar la ausencia de contaminación de la cripta mediante un examen microscópico antes y después del recubrimiento en la matriz BME-R1. El aislamiento de vellosidades por raspado, en lugar de por quelación con EDTA, evita la pérdida completa del mesénquima subyacente que puede proporcionar las señales de nicho^5,6,7,8,si es necesario, para la iniciación organoidea desde el epitelio de vellosidades.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones realizados, incluido el uso de tamoxifeno y la eutanasia por luxación cervical, tuvieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto Stevens de equinología.

1. Ratones

NOTA: La generación de Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Los ratones Villin-Cre^ERT2 han sido descritos previamente³. Se utilizaron ratones hembra adultos entre ocho y doce semanas de edad.

1. Inducir la mutación Smad4 KO:β-catenina^GOF en el Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 con inyección intraperitoneal de tamoxifeno en aceite de maíz durante cuatro días consecutivos.
2. Sacrificar los ratones por dislocación cervical diez días después de la primera inyección de tamoxifeno.
3. Rocíe el abdomen con etanol al 70% para evitar que el pelaje del ratón entre en la cavidad peritoneal.
4. Abra la cavidad abdominal con tijeras de disección para exponer el intestino. Aísle el intestino con la ayuda de las tijeras y las pórceps.
   NOTA: La pérdida concomitante de Smad4 junto con la mutación de ganancia de función de β-catenina (Smad4^KO;β-catenina^GOF) en el epitelio intestinal se logró mediante la inyección^{de Smad4f / f}; Catnb^lox(ex3)/⁺; Ratones Villin-Cre^ERT2 todos los días durante cuatro días consecutivos con 0,05 g de tamoxifeno/kg de peso corporal en aceite de maíz. Estos ratones se cosechan diez días después de la primera inyección de tamoxifeno para garantizar la presencia de células que expresan marcadores asociados a células madre en las vellosidades desdiferenciantes.

2. Aislamiento y preparación del duodeno

1. Diseccionar la mitad proximal del duodeno.
2. Enjuague el duodeno con 5 ml de PBS helado en una jeringa de 10 ml para eliminar el contenido de luminal.
3. Abra el duodeno longitudinalmente con una tijera en ángulo y coloca el duodeno plano sobre una placa de Petri de 15 cm sobre hielo con la luz del duodeno mirando hacia el operador.

3. Aislamiento de vellosidades por raspado

1. Antes de comenzar el raspado, coloque un colador de malla de 70 μm en uno de los pozos de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos. Llene todos los pozos con 4 ml de 1x PBS y coloque la placa de cultivo de tejido de 6 pozos sobre hielo (Figura 1).
2. Raspe las vellosidades de la siguiente manera utilizando dos portaobjetos de vidrio microscópicos: uno para mantener el duodeno hacia abajo y el otro para raspar (Figura 1B1).
   1. Raspe el lado luminal del duodeno superficialmente de ida y vuelta dos veces para eliminar el moco. Aplique presión tal que este paso elimine la capa de moco, pero no las vellosidades.
   2. Raspar el duodeno de nuevo, de un lado a otro aplicando dos veces la misma presión que en 3..1, durante la cual se pueden ver vellosidades acumulándose en las diapositivas(Figura 1B2). Esta es la presión óptima (que debe ser determinada empíricamente por el operador) para producir las vellosidades sin las criptas atadas.
3. Use una pipeta de transferencia de 1 ml que contenga PBS para transferir las vellosidades (que se recogen en la diapositiva del paso 3.2.2.) a un colador de malla de 70 μm colocado en un plato de 6 pozos. Las vellosidades se recogen así, después de cada rasguño (Figura 1B2).
4. Lave las vellosidades recogidas en el colador de 70 μm (a partir del paso 3.3) transfiriendo el colador (con las vellosidades) a través de una serie de pozos en un plato de 6 pozos que contenga PBS frío (~ 4 ml / pozo). Esto es para eliminar criptas sueltas, si las hay.
5. Usando una pipeta p1000, transfiera la suspensión de vellosidades en PBS (~ 3 mL) del colador de 70 μm a un nuevo tubo de 15 mL sobre hielo.
6. Use una punta de pipeta p200 de extremo romo recubierta de BSA al 0.1% para aspirar un volumen de 50 μL de la suspensión de vellosidades en un portaobjetos de vidrio. Cuente el número de vellosidades en la gota de 50 μL bajo un aumento de 4x para determinar la concentración de vellosidades en la suspensión de PBS. Por ejemplo, si hay 10 vellosidades en la suspensión de 50 μL examinada, entonces la concentración de vellosidades es de 0,2 vellosidades/μL. Este es también el momento de confirmar la ausencia de criptas atadas.
7. Calcular el volumen de suspensión de vellosidades requerido para placar a una concentración de 0,5 vellosidades/μL de matriz BME-R1. Agregue 100 μL adicionales para tener en cuenta el error de pipeteo y el volumen requerido para el examen microscópico requerido para garantizar la pureza de las vellosidades.
   PRECAUCIÓN: La presión utilizada en los dos primeros rasguños, que elimina el moco pero no las vellosidades, debe usarse en los rasguños posteriores durante los cuales se liberarán las vellosidades. Limite el número de raspados de ida y vuelta a dos después de que se observe por primera vez la liberación de vellosidades. Esta medida evita la liberación de vellosidades con las criptas atadas. Es esencial evaluar microscópicamente las vellosidades para garantizar la ausencia de las criptas atadas.

4. Chapado de vellosidades en matriz BME-R1

1. Usando una punta de pipeta de extremo romo p200 recubierta de BSA al 0.1%, transfiera a un tubo de microcentrífuga el volumen de vellosidades (desde el paso 3.6) requerido para placa a una densidad de ~ 6 vellosidades por pozo en 12.5 μL de matriz BME-R1. El uso de la punta roma recubierta de BSA en este punto asegura que las vellosidades, que son demasiado grandes para una punta puntiaguda, se aspiren sin bloquearse o perderse por estar pegadas a los lados de la punta.
2. Gire las vellosidades durante 2 min a 200 x g en una centrífuga refrigerada (4 °C) y retire el sobrenadante.
3. Repita el paso 4.2 para eliminar cualquier PBS residual y continúe con el siguiente paso debajo de una campana de flujo laminar.
4. Vuelva a colocar el pellet de vellosidades suavemente en la cantidad requerida de BME-R1 frío descongelado en hielo.
5. Usando una pipeta p20, placa 12.5 μL/pozo de las vellosidades en matriz BME-R1 en 3D en una placa de fondo en U de 96 podos precalenada.
6. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 15 minutos para permitir la solidificación de la matriz BME-R1.
7. Añadir 125 μL/pozo de ENR (epidermal growth factor/Noggin/R-spondin1) precalentados: medios avanzados DMEM F-12, suplementados con 1x Penicilina: Estreptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% de medios acondicionados de células HEK293-T que expresan R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetil cisteína y 0,05 mg/mL de primocina.
8. Incubar las vellosidades chapadas en una incubadora de cultivo de tejidos mantenida a 37 °C con un 5% de CO_2,y cambiar los medios cada dos días.
9. Deseche cualquier pozo en el que aparezcan organoides antes de dos días de emplatado, ya que el punto de tiempo más temprano en el que se esperan organoides derivados de vellosidades es después de dos días.
   NOTA: Cualquier vellosidad que tenga la mitad o más de la mitad de la longitud de las vellosidades se cuenta como una vellosidad. A diferencia de los organoides derivados de criptas, los organoides derivados de vellosidades no se esperan dentro de las 24 horas posteriores al recubrimiento. Las vellosidades iniciadora de organoides parecen oscurecerse y encogerse antes de la formación de organoides. Por lo tanto, cualquier pozo con organoides que se desarrollen dentro de un día de emplatado debe descartarse para evitar la plausibilidad de haber derivado de una contaminación plausible de cripta. La metodología utilizada para producir los medios acondicionados está disponible bajo petición.

Resultados

El factor determinante para el éxito del procedimiento es prevenir la contaminación de la cripta. El desarrollo de organoides a partir de las vellosidades (y no de ninguna cripta contaminante) se garantiza confirmando cuatro criterios principales: 1) garantizar la pureza de las vellosidades cosechadas mediante un examen microscópico antes y después de enchapar las vellosidades en BME-R1, 2) enchapar un número limitado de vellosidades por pozo para permitir la visualización de todas las vellosidades chapadas individ...

Discusión

Este método puede confirmar la capacidad de autorrenovación de las vellosidades desdiferenciadoras del epitelio que adquieren marcadores de células madre in vivo. El epitelio intestinal normal puede dar lugar a organoides de la cripta pero no del compartimento de vellosidades, cuando se cultiva en 3D debido a la presencia de células madre en las criptas¹. Por lo tanto, la formación de organoides a partir del epitelio de vellosidades desdiferenciadas cultivadas en cultivos 3D confirma...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770