פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Summary

ההליך מתאר בידוד של villi מן אפיתל מעי העכבר עובר דיפרנטיציה כדי לקבוע את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

Abstract

קלוגוגניות של organoids מן האפיתל המעי מיוחסת לנוכחות של תאי גזע בו. האפיתל המעי הקטן של העכבר ממודר לתוך קריפטות ו villi: הגבעול ותאי המתרבים מוגבלים הקריפטות, ואילו אפיתל villi מכיל רק תאים מובחנים. לפיכך, קריפטות מעיים נורמליות, אבל לא villi, יכול להוליד organoids בתרבויות 3D. ההליך המתואר כאן חל רק על אפיתל villus העובר דיפרנציה המובילה לגבעול. השיטה המתוארת משתמשת Smad4-אובדן-פונקציה:β-catenin רווח של פונקציה (Smad4^KO:β-catenin^GOF) עכבר מוטציה מותנה. המוטציה גורמת לוילי המעיים להשפריץ וליצור תאי גזע בוילי. villi מעיים עוברים דיפרנציה הם גירד את המעי באמצעות שקופיות זכוכית, להציב מסננת 70 מיקרומטר ונשטף מספר פעמים כדי לסנן את כל תאים רופפים או קריפטות לפני ציפוי במטריצה BME-R1 כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם ליצירת organoid. שני קריטריונים עיקריים שימשו כדי להבטיח כי organoids וכתוצאה מכך פותחו מתא villus dedifferentiating ולא מן הקריפטות: 1) הערכה מיקרוסקופית villi מבודד כדי להבטיח היעדר כל קריפטות קשורות, הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה 3D, ו 2) ניטור מסלול הזמן של התפתחות organoid מן villi. חניכת אורגנויד מן villi מתרחשת רק יומיים עד חמישה ימים לאחר ציפוי ונראה בצורה לא סדירה, ואילו organoids נגזר קריפטה מאותו אפיתל מעיים נראים בתוך שש עשרה שעות של ציפוי ונראה כדורי. המגבלה של השיטה, עם זאת, היא כי מספר organoids נוצר, ואת הזמן הנדרש עבור חניכה organoid מן villi להשתנות בהתאם למידת הדיפרנציה. לפיכך, בהתאם לייחודיות המוטציה או העלבון הגורם להשתמטות, יש לקבוע אמפירית את השלב האופטימלי שבו ניתן לקצור את villi כדי לבחון את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

Introduction

קריפטות מעיים אבל לא villi, ליצור organoids כאשר תרבית מטריצת מטריגת מטריגת מטריגת BME-R1. אורגנוידים אלה הם מבנים המארגנים את עצמם, המכונים לעתים קרובות "מיני מעיים" בשל נוכחותם של שושלות שונות, אבות ותאי גזע הנמצאים אפיתל המעי ב vivo. הפוטנציאל ליצור organoids מ קריפטות מיוחס לנוכחות של תאי גזע¹. villi המעיים לעומת זאת מורכב רק תאים מובחנים, ולכן לא יכול ליצור organoids. עם זאת, מוטציות 2 או^תנאים המאפשרים דיפרנטיציה של אפיתל villus עלול להוביל לתאי גזע villi^2,3. שינוי גורל זה וכתוצאה מכך גזענות אפיתל villi יכול להיות מאושר על ידי ציפוי אפיתל villus dedederentiating במטריצה 3D כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם יצירת organoid כאינדיקטור של גזעיות דה נובו אפיתל villus. לפיכך, ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח היעדר זיהום קריפטה.

Smad4^KO: מוטציה מותנית β-קטנין^GOF גורמת להפיכת האפיתל במעיים המסומנים על ידי ביטוי של סמני התפשטות ותאי גזע בוילי, ובסופו של דבר היווצרות מבנים דמויי קריפטה בוילי המכונה קריפטות חוץ רחמיות נוכחותם של תאי גזע אלה וילי מפוזרים נקבעה על ידי ביטוי של סמני תאי גזע בקריפטות ה חוץ רחמיות (בוויוו) והיכולת של הווילי המוטנטי ליצור אורנואידים wh en plated Matrigel³. הנוהל המוזכר להלן מפרט את המתודולוגיה המשמשת לאישור הגבעול של אפיתל המעיים המשתמט ב- Smad4^KO: β עכברי מוטציה מסוג Smad4-catenin^GOF. מאפיין מרכזי של מתודולוגיה זו לבידוד villi היה השימוש של גירוד של לומן המעי, בניגוד לשיטת כלציה EDTA⁴. שלא כמו בשיטת EDTA chelation, בידוד villi על ידי גירוד שומר על רוב mesenchyme הבסיסי ומאפשר להתאים את הלחץ של גירוד כדי להניב villi ללא קריפטות קשורות. הלחץ של גירוד הוא סובייקטיבי למפעיל, ומכאן, הלחץ האופטימלי להניב villi ללא קריפטות קשורות חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל. ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח את היעדר זיהום הקריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של villi הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה BME-R1.

villi מעיים הם גירד את לומן המעי עם שקופיות זכוכית להציב מסנן 70 מיקרומטר ונשטף עם PBS כדי להיפטר תאים רופפים או קריפטות, אם בכלל, לפני ציפוי במטריצה BME-R1. השיטה מדגישה את הקריטריונים הבאים כדי למנוע זיהום קריפטה: א) ממזג את הקציר villi החצי הפרוקסימלי של התריסריון שבו villi הם הארוכים ביותר, ב) מזעור מספר שריטות מניב villi, ג) שטיפת המסנן המכיל את villi באמצעות סדרה של PBS בצלחת שש באר, ו- d) המאשר את היעדר זיהום קריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי מטריצת BME-R1. בידוד Villi על ידי גירוד, ולא על ידי EDTA chelation, מונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה^5,6,7,8, במידת הצורך, עבור חניכה organoid מן אפיתל villus.

Protocol

כל ניסויי העכבר שנערכו, כולל שימוש בטמוקסיפן ובהמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם, קיבלו את אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון סטיבנס לאכינולוגיה.

1. עכברים

הערה: הדור של Smad4^{f /f}; קאטנב^{לקס (אקס3)}/⁺; עכברי ויללין-קר^ERT2 תוארו בעבר³. עכברות בוגרות בין שמונה ל-12 שבועות של גיל היו בשימוש.

1. לגרום למוטציה של Smad4^KO:מוטציית^GOF β קטנין ב- Smad4^f/f; קאטנב^{לקס (אקס3)}/⁺; Villin-Cre^ERT2 עם הזרקה תוך-חניתית של טמוקסיפן בשמן תירס במשך ארבעה ימים רצופים.
2. להקריב את נקע צוואר הרחם עכברים עשרה ימים לאחר הזרקת הטמוקסיפן הראשונה.
3. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי למנוע פרוות עכבר להיכנס לחלל הצפק.
4. פתח את חלל הבטן עם מספריים דיסקציה כדי לחשוף את המעי. לבודד את המעי בעזרת המספריים והמלקחיים.
   הערה: אובדן במקביל של Smad4 יחד עם רווח של מוטציה פונקציה של β-קטנין (Smad4^KO; β-catenin^GOF) באפיתל מעיים הושג על ידי הזרקת^{Smad4f / f}; קאטנב^{לקס (אקס3)}/⁺; עכברי Villin-Cre^ERT2 כל יום במשך ארבעה ימים רצופים עם 0.05 גרם טמוקסיפן/ק"ג משקל גוף בשמן תירס. עכברים אלה נקצרים עשרה ימים לאחר הזרקת הטמוקסיפן הראשונה כדי להבטיח את נוכחותם של תאים המבטאים סמנים הקשורים לתאי גזע בווילי המשתנה.

2. בידוד ותריסריון והכנה

1. לנתח את החצי הפרוקסימלי של התריסריון.
2. שטפו את התריסריון עם 5 מ"ל של PBS קר כקרח במזרק של 10 מ"ל כדי לנקות את התוכן הזוהר.
3. פתחו את התריסריון לאורך עם מספריים זוויתיים והניחו את התריסריון שטוח על צלחת פטרי באורך 15 ס"מ על קרח עם הלומן של התריסריון מול המפעיל.

3. בידוד Villi על ידי גירוד

1. לפני תחילת השריטה, מניחים מסננת רשת 70 מיקרומטר באחת בארות של צלחת תרבית רקמות 6-well. מלאו את כל הבארות ב-4 מ"ל של 1x PBS והניחו את צלחת תרבית הרקמות 6-well על קרח(איור 1).
2. לגרד את villi כדלקמן באמצעות שתי שקופיות זכוכית מיקרוסקופית: אחד להחזיק את התריסריון למטה והשני לגרד(איור 1B1).
   1. מגרדים את הצד הזוהר של התריסריון באופן שטחי פעמיים כדי להסיר את הריר. החל לחץ כך שלב זה מסיר את שכבת הריר, אבל לא את villi.
   2. לגרד את התריסריון שוב, הלוך ושוב מפעיל פעמיים את אותו הלחץ כמו ב 3..1, שבמהלכו ניתן לראות villi איסוף על השקופיות(איור 1B2). זהו הלחץ האופטימלי (אשר חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל) כדי להניב את villi ללא הקריפטות קשורות.
3. השתמש צינור העברה 1 מ"ל המכיל PBS להעביר את villi (כי הם נאספים על השקופית מן השלב 3.2.2.) כדי מסננת רשת 70 מיקרומטר להציב בצלחת 6 טוב. הווילי נאספים כך, אחרי כל שריטה(איור 1B2).
4. לשטוף את villi שנאסף במסננת 70 מיקרומטר (מ שלב 3.3) על ידי העברת מסננת (עם villi) דרך סדרה של בארות בצלחת 6 טוב המכיל PBS קר (~ 4 מ"ל / טוב). זה כדי להסיר קריפטות רופפות, אם בכלל.
5. באמצעות צינור p1000, להעביר את השעיית villi ב PBS (~ 3 מ"ל) מן מסננת 70 מיקרומטר לצינור חדש 15 מ"ל על קרח.
6. השתמש 0.1% BSA מצופה קצה צינור p200 קהה כדי לשאוף נפח 50 μL של התלי villi על שקופית זכוכית. לספור את מספר villi בטיפת 50 μL תחת הגדלה 4x כדי לקבוע את הריכוז של villi בהשעיית PBS. לדוגמה, אם יש 10 villi ב השעיה 50 μL נבדק, אז ריכוז villi הוא 0.2 villi/ μL. זה גם הזמן לאשר את היעדר קריפטות קשורות.
7. חשב את הנפח של השעיית villi הנדרש צלחת בריכוז של 0.5 villi / μL של מטריצת BME-R1. הוסף 100 μL נוסף כדי להסביר את השגיאה pipetting ואת הנפח הנדרש לבדיקה מיקרוסקופית הנדרש כדי להבטיח את טוהר villi.
   זהירות: הלחץ המשמש בשתי השריטות הראשונות, שמסיר את הריר אך לא את הווילי, יש להשתמש בשאריות הבאות שבמהלכם וילילי ישוחרר. הגבל את מספר השריטות הלוך ושוב לשניים לאחר שחרור villi הוא ציין לראשונה. אמצעי זה מונע שחרור של villi עם קריפטות קשורות. זה חיוני כדי להעריך מיקרוסקופית את villi כדי להבטיח את היעדר קריפטות קשורות.

4. ציפוי של villi על מטריצת BME-R1

1. באמצעות קצה צינור מצופה P200 מצופה BSA 0.1% p200 קהה, להעביר לצינור microcentrifuge את נפח villi (משלב 3.6) נדרש צלחת בצפיפות של ~ 6 villi לבאר ב 12.5 μL של מטריצת BME-R1. השימוש בקצה קהה מצופה BSA בשלב זה מבטיח כי villi, שהם גדולים מדי עבור קצה מחודד שואפים מבלי להיות חסום או איבד מלהיות תקוע לצדי הקצה.
2. מסובבים את הווילי במשך 2 דקות ב-200 x גרם בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) ומסירים את הסופר-נט.
3. חזור על שלב 4.2 כדי להסיר את כל שאריות PBS ולהמשיך לשלב הבא תחת מכסה המנוע זרימה למינאר.
4. יש להפשיר בעדינות את כדורי הווילי בכמות הנדרשת של BME-R1 קר המופשר על קרח.
5. באמצעות צינור p20, צלחת 12.5 μL / טוב של villi במטריצה BME-R1 בתלת-ממד בלוח U-תחתון 96-טוב מוזהר מראש.
6. לדגור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (5 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר התגבשות של מטריצת BME-R1.
7. הוסף 125 μL / באר של ENR התחמם מראש (גורם גדילה אפידרמלי / Noggin / R-ספונדין1) מדיה: מתקדמת DMEM F-12 מדיה, בתוספת פניצילין 1x: סטרפטומיצין, 10 mM HEPES, גלוטמקס, 50 ננוגרם /מ"ל EGF, 100 ננוגין נופין/ מ"ל, 5% מדיה מותנית מתאי HEK293-T המבטאים R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-אצטיל ציסטאין, ו 0.05 מ"ג / מ"ל פרימוצין.
8. לדגור את villi מצופה אינקובטור תרבית רקמות נשמר ב 37 °C (5% CO_2,ולשנות את התקשורת כל יומיים.
9. להשליך כל באר שבה organoids מופיעים לפני יומיים של ציפוי, שכן נקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה אורגנוידים נגזר villi צפויים לאחר יומיים.
   הערה: כל וילילי שיש לו חצי או יותר ממחצית אורך של villi נספרים כמו villus אחד. שלא כמו אורגנוידים שמקורם בקריפטה, אורגנוידים שמקורם בווילי אינם צפויים בתוך 24 שעות לאחר הציפוי. נראה כי הווילי יוזם האורגנויד מחשיך ומתכווץ לפני היווצרות האורגנוידים. לפיכך, כל בארות עם organoids המתפתח בתוך יום של ציפוי צריך להיות מושלך כדי למנוע את הסבירות של נגזר זיהום קריפטה מתקבל על הדעת. המתודולוגיה המשמשת להפקת המדיה המותנית זמינה על פי בקשה.

תוצאות

הגורם הקובע להצלחת ההליך הוא מניעת זיהום קריפטה. התפתחות האורגנויד מן villi (ולא מכל קריפטות מזהמות) מובטחת על ידי אישור ארבעה קריטריונים עיקריים: 1) הבטחת טוהר villi שנקטף על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי villi ב BME-R1, 2) ציפוי מספר מוגבל של villi לבאר כדי לאפשר הדמיה של כל villi מצופה בנפרד, 3) על ...

Discussion

שיטה זו יכולה לאשר את יכולת ההתחדשות העצמית של אפיתל villi dedifferentiating שרוכשים סמני תאי גזע ב vivo. אפיתל המעיים הרגיל יכול להוליד אורגנוידים מהקריפטה אך לא את תא villi, כאשר תרבית בתלת ממד בגלל נוכחותם של תאי גזע בקריפטות¹. לכן, היווצרות organoid מן אפיתל villi מפוזר בתרבית תרביתות 3D מאשר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F-12 media	Gibco	12634010
3,3-diaminobenzidine	Vector Labs	SK-4105
96 well U-bottom plate	Fisher Scientific	FB012932
ABC kit	Vector Labs	PK4001
Angled scissor	Fisher Scientific	11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
CD44 antibody	BioLegend	1030001
Cdx2 antibody	Cell Signaling	12306
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer	Life Sciences	431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1	R&D	3433-005-R1
Dissection scissors	Fisher Scientific	22-079-747
Forceps	Fisher Scientific	17-456-209
Glutamax (100X)	Gibco	35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1	Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Histogel	Thermoscientific	HG-4000-012
Mesh filter	Fisher Scientific	07-201-431
Micrscope glass slide	VWR	89218-844
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
p200 Blunt tips	VWR	46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Primocin (50mg/mL)	Invivogen	ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X)	Fisher Scientific	50-146-770
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Signal diluent	Cell Signaling	8112L
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	50-146-770