我的老鼠怀孕了吗？高频超声波评估

摘要

高分辨率超声波可以通过确定怀孕状态、妊娠年龄和怀孕损失来帮助简化需要定时怀孕小鼠的实验。这里介绍的是一个协议，以说明评估小鼠怀孕的方法，以及可能模仿怀孕的潜在陷阱（图像文物）。

摘要

小鼠是许多人类疾病和生物过程的首选哺乳动物动物模型。发育生物学通常需要分阶段怀孕的小鼠来确定不同时间点的进化过程。此外，模型小鼠的最佳和高效繁殖需要对定时怀孕进行评估。最常见的情况是，小鼠在一夜之间交用，阴道塞的存在被确定:然而，这种技术的正预测值是次优的，人们需要等待知道老鼠是否真的怀孕了。高分辨率超声波生物显微镜是一种有效有效的成像工具:1） 小鼠是否怀孕:2） 鼠标达到的妊娠阶段:和 3） 是否有宫内损失。除了胚胎和胎儿外，研究者还必须识别腹腔中的常见神器，以免误以为这些是子宫。本文提供了成像协议以及说明性示例。

引言

小鼠是许多人类疾病和生物过程^{1，2，3，4}的首选哺乳动物模型。发育生物学研究往往要求分阶段怀孕的小鼠确定进化过程在不同的时间点^{5，6，7，8。}此外，模型小鼠的最佳和有效繁殖需要评估定时怀孕，尤其是当研究人员正在研究基因突变对发育的影响时。通常，研究人员在一夜之间与异质小鼠交配，第二天一早寻找阴道塞子，并希望怀孕后^9日。确定宫内损失通常从检查新生儿的粪便中是否与门代利人基因型的比例开始，然后通过在不同的妊娠阶段牺牲怀孕的小鼠和恢复胚胎来向后工作。研究者可以确定体重增加是阳性妊娠^10、11的指标:然而，特别是与基因工程小鼠，垃圾可能非常小，随后重新吸收时，有宫内损失，由于体重增加可能并不明显（特别是在怀孕早期，~E6.5-8.5）。例如，由于良性腹部肿瘤，小鼠可能出现虚假怀孕。从本质上讲，一个人的作品是"盲目的"。

高分辨率超声波生物显微镜允许直接可视化格拉维德子宫和开发小鼠胚胎12，13，14，15，16。虽然我们最初已经开发出评估胚胎小鼠心血管生理学的方法16，17，我们认识到这种成像方式的效用，以简化我们的小鼠繁殖。具体来说，我们不再需要等待"看"老鼠是否怀孕，基于明显的体重增加或运送垃圾:如果大坝没有怀孕，我们可以确定鼠鰿的状态，并迅速重新交配小鼠。此外，宫内损失也可以很容易地被映像，在不牺牲鼠标的情况下可以确定损失的时间表（见图1的示意图）。因此，可以节省时间、有价值的模型鼠标和资金。

研究方案

本议定书的所有步骤均遵循美国国家卫生研究院出版的《实验室动物护理和使用指南》，并已得到纽约大学格罗斯曼医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 老鼠为早产而交配

1. 将适当的雌性小鼠（通常是异质鼠）与适当的雄性小鼠（通常是异质鼠）配对，进行夜间交配。
2. 第二天早上把老鼠分开。或者，继续与雌性小鼠和雄性小鼠交配，从而增加怀孕的机会。
   注意:然而，不能用替代方案来保证准确定时怀孕，通过超声波分期小鼠胚胎尚不清楚，特别是当疾病过程导致宫内生长迟缓时。如果携带基因变异的胚胎被认为很小，请寻找较大的野生型垃圾来测量妊娠年龄。
   1. 可选:寻找阴道塞。如果没有阴道塞，雌性鼠标就没有交集。如果有阴道塞，雌性小鼠仍有可能不怀孕。
3. 隔夜交配后的第二天时间为 E0.5 。
4. 在 E6.5– E.8.5 进行成像以确定怀孕情况，如果小鼠未怀孕，则与小鼠重新交配（参见第 1.1 步）。
   注:现阶段，女坝没有明显怀孕的眼睛:因此，超声成像允许早期测定和重新交配。

2. 麻醉和准备鼠标

1. 将怀孕的鼠标放在麻醉感应室中。
2. 将异氟兰与室内空气或医用氧气混合，浓度为2%-3%，流速为1升/分钟，诱导诱导诱导室中怀孕小鼠的诱惑。
   注:Sedation 通常在 1-2 分钟内发生。老鼠将静静地躺着，她的呼吸会变慢。
3. 快速将鼠标传输到成像平台。成像平台通常也有加热元件，这有助于保持鼠标的温暖。
4. 将鼠标的鼻子放入麻醉鼻锥中。
5. 快速将异氟烃/氧气混合物重新路由到成像平台鼻锥。在 1 L/分钟流量下保持在 2%-3% 的异氟兰。
6. 通过爪捏、角膜反射、呼吸水平和任何运动确定静止水平。
   注意:角膜反射最初可以通过在眼睛上涂上保湿软膏来确定，以防止它们在小鼠麻醉时干燥（小鼠不会闭上眼睛）。
7. 鼠标躺在仰卧（背上），将爪子贴在成像平台的心电图（EKG）垫上。
   注意:但是，这种成像不需要 EKG。
8. 从怀孕的大坝腹部取出皮毛如下:
   1. 用 70% 乙醇彻底润湿腹部毛皮，包括到横向边缘。不要应用太多，以至于平台上有径流。
      注意:乙醇比水更能用作剃须润滑剂。
   2. 使用剃须刀刀片小心剃腹部。小心不要割。
   3. 用纱布或一些湿巾擦去腹部剃光的毛皮。
   4. 或者，使用毛皮剪子去除大部分毛皮后，使用脱毛霜。

3. （假定） 怀孕小鼠的跨区域成像

1. 腹部剃光后，将异氟兰降低到1%-1.5%，但仍保持1升/分钟的流动速度。通过呼吸水平和任何运动以及爪捏和/或角膜反射监测安定水平。
   注:麻醉小鼠的心率通常为400-500/分钟，具体取决于核心（直肠）温度。为了快速检查怀孕，不要将鼠标加热到生理核心温度:心率将接近400×450/分钟，但如果老鼠在长时间的成像中变冷，心律可能会进一步下降。
   1. 重要的是，确保呼吸在深度和规律性上是适度的，而不是不稳定或痛苦（喘气:深，慢，不稳定，深间缩和子缩还）。
      注:非通风麻醉小鼠的呼吸速率一般为60~100/分钟。请参阅 https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html 和 https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice。
2. 慷慨地将超声波（声学耦合）凝胶涂抹在腹部。
3. 将成像传感器放在腹部，使其定向在水平平面上:定向探头，在成像系统上获得左右方向:成像探头侧指示的"点"或脊应朝右。
   注意:将成像探头向右滑动到鼠标右侧时，应将超声波系统上的相应图像移到鼠标的右侧（想象一下，从鼠标的尾部向上看——鼠标的右侧将留在监视器上）。
   1. 通常，使用成像系统的传感器安装和导轨操纵系统。在这里，"自由手"成像已经使用，其中成像传感器是手持的（两只手比一只更稳定），这允许腹部周围的更快速的运动。如下文所述，这些运动包括旋转和转化运动。然而，这需要更多的实践。
4. 识别屏幕上的膀胱 （视频1）。
5. 从膀胱中扫描，识别阴道。然后，缓慢而平稳地向颅面方向扫描，确定阴道向左右子宫角的分叉（图2:视频 1）.
6. 开始子宫（左右子宫角^）13（图3:视频2）。
   注意:在妊娠中期（E10.5或E11.5）前，小鼠胚胎将沿着左右外围放置。随着它们的生长，子宫及其相应胚胎的分离部分会向外和后部转动。随着胚胎的进一步生长（E15.5和以后，一般来说），小鼠胎儿将几乎随机地放置在不同的方向，并且很难从近部"跟踪"子宫。
   1. 快速扫描，只需检查鼠标是否怀孕。这种快速的方法只需要识别一个肝子宫和小鼠胚胎。
   2. 或者，花额外的时间来列举每个子宫角中的胚胎（活的、死的、重新吸收的）。
      注:一般来说，活胚胎会表现出不同的器官，如心脏、四肢、带心室的头部和眼睛。死胚胎呈现出同质的"模糊"外观，除非只是死了。重新吸收的胚胎在看起来有一个精准的回声点（图4，图5，图6，图7，图8）中间。
   3. 要确定胚胎是否真的活着，请查找心跳和/或血流。
      注:彩色多普勒流图可以帮助确定胚胎和脐带中存在血流。一般来说，这可能适用于E8.5以上的胚胎。
   4. 识别可能模仿子宫的潜在文物（图9，图10）。此外，由于肠气体和其他超声波"阴影"神器可能遮挡子宫角的片段，因此从多个有利位置进行成像，以确保子宫的充分可视化。
7. 测量完成后，用纱布或湿巾擦拭腹部的凝胶。尽量去除凝胶，因为凝胶往往冷却鼠标。
8. 解开爪子，将鼠标从麻醉鼻锥中取出。
9. 轻轻地把老鼠移回她的笼子里。她应该醒过来，在一分钟左右左右开始四处走动。
   注意:转基因小鼠可能需要更长的时间才能从麻醉中恢复过来，需要更密切地观察。

结果

该协议将允许调查员自信地确定小鼠是否怀孕，包括在早期阶段，并确定是否有明显的产前胚胎或胎儿损失，而无需牺牲怀孕的水坝。这种协议在培育转基因小鼠时特别有用:通常，异质x异质交叉产生同源后代会导致正常发育失败，从而导致产前杀伤力。图1描绘了胚胎在妊娠中期逐渐死亡，然后被重新吸收的代表性情况。图2显示了如何通过通过阴道的...

讨论

成像中最重要的第一步是识别阴道，然后确定左右两侧子宫角的分叉。通过跟随每个子宫喇叭，成像仪不太可能错误地识别肠道的循环作为子宫。此外，了解肠道外观的变化（有/无粪便物质）对于区分这些和子宫非常重要:偶尔，排便环中的粪便"球"可能模仿大肠（怀孕）子宫。虽然其他作者描述了诊断怀孕和分期小鼠胚胎发育17，18，19包括检测重新吸收的胚胎

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel