Ma souris est-elle enceinte? Évaluation par ultrasons à haute fréquence

Résumé

Les ultrasons à haute résolution peuvent aider à rationaliser les expériences nécessitant des souris enceintes chronométré en déterminant l’état de la grossesse, l’âge gestationnel et les pertes de grossesse. Présenté ici est un protocole pour illustrer des méthodes pour évaluer des grossesses de souris aussi bien que des pièges potentiels (artefacts d’image) qui peuvent imiter la grossesse.

Résumé

La souris est le modèle animal mammifère de choix pour de nombreuses maladies humaines et processus biologiques. La biologie du développement exige souvent que les souris enceintes étagés déterminent les processus en évolution à divers moments. De plus, l’élevage optimal et efficace de souris modèles nécessite une évaluation des grossesses chronométré. Le plus souvent, les souris sont accouplées pendant la nuit et la présence d’un bouchon vaginal est déterminée; cependant, la valeur prédictive positive de cette technique est sous-optimale, et il faut attendre de savoir si la souris est vraiment enceinte. La biomicroscopie ultrasonore à haute résolution est un outil efficace et efficient pour l’imagerie: 1) Si une souris est enceinte; 2) Quel stade gestationnel la souris a atteint; et 3) S’il y a des pertes intra-utérines. En plus des embryons et des fœtus, l’investigateur doit également identifier des artefacts communs dans la cavité abdominale afin de ne pas les confondre avec un utérus gravide. Cet article fournit un protocole pour l’imagerie avec des exemples illustratifs.

Introduction

La souris est le modèle de mammifère préféré pour de nombreuses maladies humaines et processus biologiques^1,2,3,4. La recherche en biologie du développement nécessite souvent des souris enceintes en phase pour déterminer les processus évolutifs à divers points de temps^5,6,7,8. De plus, la reproduction optimale et efficace de souris modèles nécessite une évaluation des grossesses chronométré, en particulier lorsque les chercheurs étudient les effets d’une mutation génétique sur le développement. Typiquement, les enquêteurs accouplent des souris hétérozygotes pendant la nuit, cherchent un bouchon vaginal tôt le lendemain matin et espèrent qu’une grossesse s’ensuit⁹. La détermination de la perte intra-utérine commence généralement par la vérification d’une portée néonatale pour les ratios mendéliens de génotypes, puis par le travail à l’envers en sacrifiant des souris gravides à divers stades gestationnels et en récupérant les embryons. Les investigateurs peuvent déterminer la prise de poids comme mesure d’une grossesse positive^10,11; cependant, en particulier avec les souris génétiquement modifiées, les portées peuvent être très petites et par la suite résorbées lorsqu’il y a perte intra-utérine en raison de laquelle le gain de poids peut ne pas être évident (en particulier au début de la grossesse, ~ E6,5-8,5). Une souris peut sembler faussement enceinte en raison, par exemple, d’une tumeur abdominale bénigne. En substance, on travaille « aveugle ».

La biomicroscopie ultrasonore à haute résolution permet la visualisation directe de l’utérus gravide et le développement d’embryons de souris^{12,13,14,15,16.} Bien que nous ayons initialement développé des méthodes pour évaluer la physiologie cardiovasculaire embryonnaire de la souris^16,17,nous avons reconnu l’utilité de cette modalité d’imagerie pour rationaliser notre élevage de souris. Plus précisément, nous n’avions plus à attendre pour « voir » si une souris était enceinte, en fonction du gain de poids évident ou de la livraison d’une portée; nous pourrions déterminer l’état gravide et réapprisser rapidement les souris si la mère n’était pas enceinte. De plus, les pertes intra-utérines pourraient également être facilement iées, et une chronologie des pertes pourrait être déterminée sans sacrifier la souris (voir la figure 1 pour un schéma). Du temps, des souris modèles précieuses et des fonds peuvent ainsi être économisés.

Protocole

Toutes les étapes de ce protocole suivent le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par les National Institutes of Health et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de la Grossman School of Medicine de l’Université de New York.

1. Accouplement de souris pour des grossesses chronométrées

1. Associez la souris femelle appropriée (habituellement un hétérozygote) dans une cage avec la souris mâle appropriée (habituellement un hétérozygote) pour l’accouplement de nuit.
2. Séparez les souris le lendemain matin. Alternativement, accouplez continuellement les souris femelles et mâles, augmentant ainsi les chances de grossesse.
   REMARQUE: Cependant, une grossesse chronométré avec précision ne peut pas être assurée avec l’alternative, et la stadification des embryons de souris par ultrasons n’est pas claire, en particulier lorsque le processus de la maladie entraîne un retard de croissance intra-utérin. Si l’on suppose que les embryons porteurs de la variante du gène sont petits, recherchez les plus gros compagnons de litière de type sauvage pour évaluer l’âge gestationnel.
   1. Facultatif : Recherchez le bouchon vaginal. S’il n’y a pas de bouchon vaginal, la souris femelle n’a pas été accouplée. S’il y a un bouchon vaginal, il est toujours probable que la souris femelle ne devienne pas enceinte.
3. Heure du lendemain de l’accouplement de nuit comme E0.5.
4. Effectuer une imagerie à E6.5–E.8.5 pour déterminer la grossesse, et ré-accoupler les souris si la souris n’est pas enceinte (voir étape 1.1).
   REMARQUE: À ce stade, la mère femelle n’est pas manifestement enceinte à l’œil; par conséquent, l’imagerie par ultrasons permet une détermination précoce et un ré-accouplement.

2. Anesthésie et préparation de la souris

1. Placez la souris gravide dans la chambre d’induction anesthésique.
2. Mélanger l’isoflurane avec de l’air de pièce ou de l’oxygène médical, à une concentration de 2% à 3% à un débit de 1 L/min pour induire la sédation de la souris gravide dans la chambre d’induction.
   REMARQUE : La sédation se produit généralement dans les 1 à 2 minutes. La souris sera immobile et sa respiration aura ralenti.
3. Transférez rapidement la souris sur la plate-forme d’imagerie. La plate-forme d’imagerie comporte généralement des éléments chauffants, ce qui peut aider à garder la souris au chaud.
4. Placez le nez de la souris dans le cône de nez anesthésique.
5. Réacheminez rapidement le mélange isoflurane/oxygène vers le nosecone de la plate-forme d’imagerie. Maintenir l’isoflurane à 2 % –3 % à un débit de 1 L/min.
6. Déterminer le niveau de sédation par pincement de la patte, réflexe cornéen, niveau de respiration et tout mouvement.
   REMARQUE: Le réflexe cornéen peut être déterminé initialement en appliquant une pommade hydratante sur les yeux pour les empêcher de se dessécher pendant que la souris est anesthésiée (la souris ne ferme pas les yeux).
7. Avec la souris couchée sur le dos (sur le dos), collez les pattes sur les coussinets d’électrocardiogramme (ECG) de la plateforme d’imagerie.
   REMARQUE: Cependant, un ECG n’est pas nécessaire pour ce type d’imagerie.
8. Retirez la fourrure de l’abdomen de la mère enceinte comme suit:
   1. Mouillez soigneusement la fourrure abdominale avec de l’éthanol à 70%, y compris jusqu’aux bords latéraux. Ne vous appliquez pas tellement qu’il y a ruissellement sur la plate-forme.
      REMARQUE: L’éthanol fonctionne mieux comme lubrifiant de rasage que l’eau.
   2. Utilisez la lame de rasoir pour raser soigneusement l’abdomen. Veillez à ne pas couper les mamelons.
   3. Essuyez la fourrure rasée de l’abdomen avec de la gaze ou des lingettes.
   4. Vous pouvez également utiliser une crème dépilatoire après avoir utilisé les tondeuses à fourrure pour enlever la majeure partie de la fourrure.

3. Imagerie transabdominale de la souris enceinte (présumée)

1. Une fois l’abdomen rasé, réduire l’isoflurane à 1% à 1,5%, tout en maintenant un débit de 1 L/min. Surveiller le niveau de sédation par le niveau de respiration et les mouvements ainsi que le pincement des pattes et /ou le réflexe cornéen.
   REMARQUE: La fréquence cardiaque de la souris anesthésiée sera généralement de 400 à 500 / min, en fonction de la température centrale (rectale). Aux fins d’un contrôle de grossesse rapide, ne réchauffez pas la souris à une température centrale physiologique; la fréquence cardiaque sera plus proche de 400–450/min, mais peut baisser davantage avec un rythme irrégulier si la souris devient froide avec une imagerie prolongée.
   1. Il est important de s’assurer que les respirations sont modérées en profondeur et en régularité, non erratiques ou agonales (haletant: profond, lent et erratique, avec des rétrations intercostales et subcostales profondes).
      REMARQUE : La fréquence respiratoire de la souris anesthésiée non ventilée sera généralement de 60 à 100/min. Voir https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html et https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
2. Appliquez généreusement du gel à ultrasons (couplage acoustique) sur l’abdomen.
3. Placer le transducteur d’imagerie sur l’abdomen pour l’orienter dans un plan horizontal: orienter la sonde pour obtenir une orientation gauche-droite sur le système d’imagerie; le « point » ou la crête indiqué sur le côté de la sonde d’imagerie doit être orienté vers la droite.
   Remarque : le glissement de la sonde d’imagerie vers la droite de la souris doit décaler l’image correspondante sur le système à ultrasons vers la droite de la souris (imaginez regarder « vers le haut » de la queue de la souris , la droite de la souris sera laissée sur le moniteur).
   1. En règle générale, utilisez le support de transducteur et le système de manipulation de rail du système d’imagerie. Ici, l’imagerie « main libre » a été utilisée dans laquelle le transducteur d’imagerie est tenu à la main (deux mains sont plus stables qu’une) et qui permet des mouvements plus rapides autour de l’abdomen. Ces mouvements, comme nous le décriras ci-dessous, comprennent à la fois les mouvements de rotation et les mouvements de translation. Cependant, cela nécessite plus de pratique.
4. Identifiez la vessie à l’écran( Vidéo 1).
5. Balayage caudale de la vessie, identifier le vagin. Ensuite, en balayant lentement et en douceur dans une direction crânienne, identifier la bifurcation du vagin dans les cornes utérines gauche et droite (Figure 2; Vidéo 1).
6. Commencer l’étude de l’utérus (cornes utérines gauche et droite)¹³ (Figure 3; Vidéo 2).
   REMARQUE: Jusqu’à mi-gestation (E10.5 ou E11.5), les embryons de souris seront positionnés le long des périphéries droite et gauche. Au fur et à mesure qu’ils grandissent, les parties les plus distales de l’utérus et leurs embryons correspondants se tournent vers l’extérieur et vers l’arrière. Au fur et à mesure que les embryons grandissent (E15.5 et plus tard, généralement), les fœtus de souris seront positionnés presque au hasard dans diverses directions, et il devient difficile de « suivre » un utérus de proximal à distal.
   1. Scannez rapidement simplement pour vérifier si une souris est enceinte ou non. Cette méthode rapide ne nécessite que la reconnaissance d’un utérus gravide et d’embryons de souris.
   2. Sinon, prenez plus de temps pour énumérer les embryons (vivants, morts, résorbés) dans chaque corne utérine.
      REMARQUE: En général, un embryon vivant présentera des organes distincts tels qu’un cœur, des membres, une tête avec des ventricules et des yeux. Un embryon mort prend une apparence homogène et « pâteuse », à moins qu’il ne soit juste mort. Les embryons résorbés ont une tache échogénique précise au milieu d’un utérus d’aspect gravide(figure 4, figure 5, figure 6, figure 7, figure 8).
   3. Pour déterminer si un embryon est vraiment vivant, recherchez le rythme cardiaque et/ou le flux sanguin.
      REMARQUE: La cartographie du flux Doppler de couleur peut aider à déterminer la présence du flux sanguin, à la fois dans l’embryon et dans le cordon ombilical. En général, cela peut être appliqué à des embryons plus âgés que E8.5.
   4. Reconnaître les artefacts potentiels qui peuvent imiter un utérus gravide( Figure 9, Figure 10). En outre, comme les gaz intestinaux et d’autres artefacts d'« ombre » d’ultrason peuvent obscurcir des segments de la corne utérine, exécutez l’imagerie de plusieurs points de vue pour assurer une visualisation adéquate de l’utérus.
7. Une fois l’enquête terminée, essuyez le gel de l’abdomen avec de la gaze ou des lingettes. Essayez d’enlever autant que possible que le gel a tendance à refroidir la souris vers le bas.
8. Décocez les pattes et retirez la souris du cône de nez anesthésique.
9. Déplacez doucement la souris dans sa cage. Elle devrait se réveiller et commencer à se déplacer dans une minute ou deux.
   REMARQUE: Les souris génétiquement modifiées peuvent prendre un peu plus de temps à récupérer de l’anesthésie et doivent être surveillées de plus près.

Résultats

Ce protocole permettra à un investigateur de déterminer en toute confiance si une souris est enceinte, y compris pendant les premiers stades et de déterminer s’il y a des pertes embryonnaires ou fœtales prénatales évidentes sans avoir à sacrifier la mère enceinte. Ce protocole est particulièrement utile lors de l’élevage de souris génétiquement modifiées; typiquement, les croisements hétérozygotes x hétérozygotes pour produire la progéniture homozygote mènent à l’échec du développement appropr...

Discussion

La première étape la plus importante de l’imagerie consiste à identifier le vagin, puis à déterminer la bifurcation de la corne utérine à gauche et à droite. En suivant chaque corne utérine, l’imageur est moins susceptible de mal identifier les boucles de l’intestin comme l’utérus. De plus, il est important de comprendre les variations de l’apparence de l’intestin (avec/sans matières fécales) pour les distinguer de l’utérus; à l’occasion, les « boules » fécales dans les boucles intestinal...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel