Ist meine Maus schwanger? Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung

Zusammenfassung

Hochauflösender Ultraschall kann helfen, Experimente zu rationalisieren, die zeitgesteuerte trächtige Mäuse erfordern, indem er den Zustand der Schwangerschaft, das Gestationsalter und die Schwangerschaftsverluste bestimmt. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Methoden zur Beurteilung von Mäuseschwangerschaften sowie potenziellen Fallstricken (Bildartefakte) zu veranschaulichen, die eine Schwangerschaft nachahmen können.

Zusammenfassung

Die Maus ist das Säugetiertiermodell der Wahl für viele menschliche Krankheiten und biologische Prozesse. Die Entwicklungsbiologie erfordert oft gestufte trächtige Mäuse, um sich entwickelnde Prozesse zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen. Darüber hinaus erfordert eine optimale und effiziente Zucht von Modellmäusen eine Beurteilung der zeitlich geregelten Schwangerschaften. Am häufigsten werden Mäuse über Nacht gepaart und das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens wird bestimmt; Der positive prädiktive Wert dieser Technik ist jedoch suboptimal, und man muss warten, um zu wissen, ob die Maus wirklich schwanger ist. Die hochauflösende Ultraschall-Biomikroskopie ist ein effektives und effizientes Werkzeug für die Bildgebung: 1) Ob eine Maus schwanger ist; 2) Welches Gestationsstadium die Maus erreicht hat; und 3) Ob intrauterine Verluste vorliegen. Neben den Embryonen und Föten muss der Prüfer auch häufige Artefakte in der Bauchhöhle erkennen, um diese nicht mit einer graviden Gebärmutter zu verwechseln. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Bildgebung sowie illustrative Beispiele.

Einleitung

Die Maus ist das bevorzugte Säugetiermodell für viele menschliche Krankheiten und biologische Prozesse^1,2,3,4. Die Forschung in der Entwicklungsbiologie erfordert oft gestufte trächtige Mäuse, um sich entwickelnde Prozesse zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen^5,6,7,8. Darüber hinaus erfordert eine optimale und effektive Züchtung von Modellmäusen eine Bewertung von zeitlich geregelten Schwangerschaften, insbesondere wenn die Forscher die Auswirkungen einer Genmutation auf die Entwicklung untersuchen. Typischerweise paaren Forscher heterozygote Mäuse über Nacht, suchen am nächsten Morgen früh nach einem Vaginalpfropfen und hoffen, dass eine Schwangerschaft folgt⁹. Die Bestimmung des intrauterinen Verlustes beginnt typischerweise mit der Überprüfung eines neugeborenen Wurfes auf Mendelsche Verhältnisse von Genotypen, arbeitet dann rückwärts, indem schwangere Mäuse in verschiedenen Gestationsstadien geopfert und die Embryonen wiederhergestellt werden. Forscher können Gewichtszunahme als Metrik einer positiven Schwangerschaft^{bestimmen 10,11}; Insbesondere bei gentechnisch veränderten Mäusen können die Würfe jedoch sehr klein sein und anschließend resorbiert werden, wenn ein intrauteriner Verlust auftritt, aufgrund dessen die Gewichtszunahme möglicherweise nicht offensichtlich ist (besonders früh in der Schwangerschaft, ~ E6,5-8,5). Eine Maus kann fälschlicherweise schwanger erscheinen, zum Beispiel aufgrund eines gutartigen Bauchtumors. Im Wesentlichen arbeitet man "blind".

Die hochauflösende Ultraschall-Biomikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung der graviden Gebärmutter und der Entwicklung von Mausembryonen^{12,13,14,15,16}. Obwohl wir zunächst Methoden zur Beurteilung der kardiovaskulären Physiologie embryonaler Mäuse entwickelt hatten^16,17, erkannten wir den Nutzen dieser Bildgebungsmodalität, um unsere Mauszucht zu rationalisieren. Insbesondere mussten wir nicht mehr warten, um zu "sehen", ob eine Maus schwanger war, entweder aufgrund der offensichtlichen Gewichtszunahme oder der Geburt eines Wurfes; Wir konnten den graviden Zustand bestimmen und Mäuse schnell wieder paaren, wenn der Damm nicht schwanger war. Darüber hinaus konnten intrauterine Verluste auch leicht abgebildet werden, und eine Zeitachse des Verlustes konnte bestimmt werden, ohne die Maus zu opfern (siehe Abbildung 1 für ein Schema). Zeit, wertvolle Modellmäuse und Geld können so eingespart werden.

Protokoll

Alle Schritte in diesem Protokoll folgen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, der von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde und vom Institutional Animal Care and Use Committee der New York University Grossman School of Medicine genehmigt wurde.

1. Paarung von Mäusen für zeitliche Schwangerschaften

1. Paaren Sie die entsprechende weibliche Maus (normalerweise eine Heterozygote) in einem Käfig mit der entsprechenden männlichen Maus (normalerweise eine Heterozygote) für die Paarung über Nacht.
2. Trennen Sie die Mäuse am nächsten Morgen. Alternativ können Sie die weiblichen und männlichen Mäuse kontinuierlich vermähnen und so die Chancen auf eine Schwangerschaft erhöhen.
   HINWEIS: Eine genau getakten Schwangerschaft kann jedoch mit der Alternative nicht gewährleistet werden, und das Staging von Mausembryonen durch Ultraschall ist nicht klar, insbesondere wenn der Krankheitsprozess zu einer intrauterinen Wachstumsverzögerung führt. Wenn angenommen wird, dass die Embryonen, die die Genvariante tragen, klein sind, suchen Sie nach den größeren Wildtyp-Littermaten, um das Gestationsalter zu messen.
   1. Optional: Suchen Sie nach dem Vaginalpfropfen. Wenn kein Vaginalpfropfen vorhanden ist, wurde die weibliche Maus nicht gepaart. Wenn es einen Vaginalpfropfen gibt, ist es immer noch wahrscheinlich, dass die weibliche Maus nicht schwanger wird.
3. Zeit am Tag nach der Paarung über Nacht als E0.5.
4. Führen Sie eine Bildgebung bei E6.5–E.8.5 durch, um die Schwangerschaft zu bestimmen, und paaren Sie die Mäuse wieder, wenn die Maus nicht schwanger ist (siehe Schritt 1.1).
   HINWEIS: In diesem Stadium ist die weibliche Mutter nicht offensichtlich schwanger für das Auge; Daher ermöglicht die Ultraschallbildgebung eine frühzeitige Bestimmung und Wiederpaarung.

2. Anästhesie und Vorbereitung der Maus

1. Legen Sie die trächtige Maus in die Anästhesie-Induktionskammer.
2. Mischen Sie Isofluran mit Raumluft oder medizinischem Sauerstoff in einer Konzentration von 2% bis 3% bei einer Durchflussrate von 1 l / min, um eine Sedierung der schwangeren Maus in der Induktionskammer zu induzieren.
   HINWEIS: Sedierung tritt typischerweise innerhalb von 1-2 Minuten auf. Die Maus wird still liegen und ihre Atmung wird sich verlangsamt haben.
3. Übertragen Sie die Maus schnell auf die Imaging-Plattform. Die Bildgebungsplattform verfügt in der Regel auch über Heizelemente, die dazu beitragen können, die Maus warm zu halten.
4. Legen Sie die Nase der Maus in den anästhetischen Nasenkon.
5. Leiten Sie das Isofluran/Sauerstoff-Gemisch schnell zum Nasenkon der Bildgebungsplattform um. Isofluran bei 2%–3% bei 1 L/min Durchfluss halten.
6. Bestimmen Sie den Grad der Sedierung durch Pfotenklemme, Hornhautreflex, Atmungsniveau und jede Bewegung.
   HINWEIS: Der Hornhautreflex kann zunächst durch Auftragen einer feuchtigkeitsspendenden Salbe auf die Augen bestimmt werden, um zu verhindern, dass sie austrocknen, während die Maus betäubt wird (die Maus schließt ihre Augen nicht).
7. Wenn die Maus in Rückenlage (auf dem Rücken) liegt, kleben Sie die Pfoten an die Elektrokardiogramm-Pads (EKG) der Bildgebungsplattform.
   HINWEIS: Für diese Art der Bildgebung ist jedoch kein EKG erforderlich.
8. Entfernen Sie das Fell wie folgt aus dem Bauch der schwangeren Mutter:
   1. Befeuchten Sie das Bauchfell gründlich mit 70% Ethanol, auch bis zu den Seitenrändern. Nicht so viel auftragen, dass es zu einem Abfluss auf die Plattform kommt.
      HINWEIS: Ethanol wirkt besser als Rasierschmiermittel als Wasser.
   2. Verwenden Sie die Rasierklinge, um den Bauch vorsichtig zu rasieren. Achten Sie darauf, die Brustwarzen nicht zu schneiden.
   3. Wischen Sie das rasierte Fell mit Gaze oder einigen Tüchern vom Bauch ab.
   4. Alternativ können Sie eine Enthaarungscreme verwenden, nachdem Sie die Pelzscher verwendet haben, um den größten Teil des Fells zu entfernen.

3. Transabdominale Bildgebung der (vermutlich) trächtigen Maus

1. Nachdem der Bauch rasiert wurde, reduzieren Sie das Isofluran auf 1% bis 1,5% und halten Sie immer noch eine Durchflussrate von 1 l / min aufrecht. Überwachen Sie den Grad der Sedierung durch das Niveau der Atmung und alle Bewegungen sowie Pfotenklemme und / oder Hornhautreflex.
   HINWEIS: Die Herzfrequenz der betäubten Maus beträgt in der Regel 400-500 / min, abhängig von der Kerntemperatur (rektal). Zum Zwecke einer schnellen Schwangerschaftsprüfung die Maus nicht auf eine physiologische Kerntemperatur erwärmen; Die Herzfrequenz liegt näher bei 400-450 / min, kann aber mit einem unregelmäßigen Rhythmus weiter sinken, wenn die Maus bei längerer Bildgebung kalt wird.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Atmungen in Tiefe und Regelmäßigkeit mäßig sind, nicht unregelmäßig oder agonal (Keuchen: tief, langsam und unberechenbar, mit tiefen Interkostal- und Subkostal-Retraktionen).
      HINWEIS: Die Atemfrequenz der nicht beatmeten, betäubten Maus beträgt typischerweise 60-100 / min. Siehe https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html und https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
2. Tragen Sie Ultraschallgel (akustische Kopplung) großzügig auf den Bauch auf.
3. Platzieren Sie den Bildwandler auf dem Bauch, um ihn in einer horizontalen Ebene auszurichten: Richten Sie die Sonde aus, um eine Links-Rechts-Ausrichtung auf dem Bildgebungssystem zu erhalten; Der "Punkt" oder Grat, der auf der Seite der bildgebenden Sonde angezeigt wird, sollte nach rechts gerichtet sein.
   HINWEIS: Wenn Sie die Bildgebungssonde nach rechts verschieben, sollte das entsprechende Bild auf dem Ultraschallsystem nach rechts verschoben werden (stellen Sie sich vor, Sie schauen vom Schwanz der Maus "nach oben" - die Rechte der Maus wird auf dem Monitor belassen).
   1. Verwenden Sie in der Regel die Wandlerhalterung und das Schienenmanipulatorsystem des Bildgebungssystems. Hier wurde die "Freihand" -Bildgebung verwendet, bei der der Bildaufnehmer in der Hand gehalten wird (zwei Hände sind stabiler als eine) und die schnellere Bewegungen um den Bauch herum ermöglicht. Diese Bewegungen, wie im Folgenden beschrieben, umfassen sowohl rotationale als auch translationale Bewegungen. Dies erfordert jedoch mehr Übung.
4. Identifizieren Sie die Blase auf dem Bildschirm (Video 1).
5. Scannen Sie kaudal aus der Blase, identifizieren Sie die Vagina. Dann scannen Sie langsam und sanft in eine Schädelrichtung, identifizieren Sie die Verzweigung der Vagina in das linke und rechte Uterushorn (Abbildung 2; Video 1).
6. Beginnen Sie die Untersuchung der Gebärmutter (linkes und rechtes Uterushorn)¹³ (Abbildung 3; Video 2).
   HINWEIS: Bis zur Mitte der Schwangerschaft (E10.5 oder E11.5) werden die Mausembryonen entlang der rechten und linken Peripherie positioniert. Wenn sie wachsen, drehen sich die distaleren Teile der Gebärmutter und ihre entsprechenden Embryonen nach außen und nach innen. Wenn die Embryonen weiter wachsen (E15.5 und später, im Allgemeinen), werden die Mausföten fast zufällig in verschiedene Richtungen positioniert, und es wird schwierig, einen Uterus von proximal bis distal zu "verfolgen".
   1. Scannen Sie schnell, um zu überprüfen, ob eine Maus schwanger ist oder nicht. Diese schnelle Methode erfordert nur die Erkennung einer graviden Gebärmutter und Mausembryonen.
   2. Alternativ nehmen Sie sich zusätzliche Zeit, um die Embryonen (lebend, tot, resorbiert) in jedem Uterushorn aufzuzählen.
      HINWEIS: Im Allgemeinen zeigt ein lebender Embryo verschiedene Organe wie Herz, Gliedmaßen, Kopf mit Ventrikeln und Augen. Ein toter Embryo nimmt ein homogenes, "matschiges" Aussehen an, es sei denn, er ist gerade tot. Resorbierte Embryonen haben einen punktgenen echogenen Fleck in der Mitte einer gravid aussehenden Gebärmutter (Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8).
   3. Um festzustellen, ob ein Embryo wirklich lebt, suchen Sie nach dem Herzschlag und / oder Blutfluss.
      HINWEIS: Die Farb-Doppler-Flusskartierung kann bei der Bestimmung des Blutflusses sowohl im Embryo als auch in der Nabelschnur helfen. Im Allgemeinen kann dies auf Embryonen angewendet werden, die älter als E8.5 sind.
   4. Erkennen Sie potenzielle Artefakte, die eine gravidierte Gebärmutter nachahmen können (Abbildung 9, Abbildung 10). Da Darmgas und andere Ultraschall-"Schatten" -Artefakte Segmente des Uterushorns verdecken können, führen Sie die Bildgebung von mehreren Aussichtspunkten aus durch, um eine angemessene Visualisierung der Gebärmutter zu gewährleisten.
7. Nachdem die Umfrage abgeschlossen ist, wischen Sie das Gel mit Gaze oder Tüchern vom Bauch ab. Versuchen Sie, so viel wie möglich zu entfernen, da das Gel dazu neigt, die Maus abzukühlen.
8. Entklopfen Sie die Pfoten und entfernen Sie die Maus aus dem anästhetischen Nasenkon.
9. Bewegen Sie die Maus vorsichtig zurück in ihren Käfig. Sie sollte aufwachen und sich innerhalb einer Minute oder so bewegen.
   HINWEIS: Genetisch veränderte Mäuse können etwas länger brauchen, um sich von der Anästhesie zu erholen und müssen genauer beobachtet werden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht es einem Forscher, sicher festzustellen, ob eine Maus schwanger ist, auch in den frühen Stadien, und festzustellen, ob es offensichtliche pränatale embryonale oder fetale Verluste gibt, ohne die schwangere Mutter opfern zu müssen. Dieses Protokoll ist besonders nützlich bei der Züchtung gentechnisch veränderter Mäuse; Typischerweise führen heterozygote x heterozygote Kreuzungen, um homozygote Nachkommen hervorzubringen, zu einem Versagen der richtigen Entwicklung, was zu pränataler L...

Diskussion

Der wichtigste erste Schritt bei der Bildgebung besteht darin, die Vagina zu identifizieren und dann die Verzweigung des Uterushorns nach links und rechts zu bestimmen. Durch die Befolgung jedes Uterushorns ist es weniger wahrscheinlich, dass der Imager Schleifen des Darms als Gebärmutter falsch identifiziert. Darüber hinaus ist es wichtig, die Variationen im Aussehen des Darms (mit / ohne Fäkalien) zu verstehen, um diese von der Gebärmutter zu unterscheiden; Gelegentlich können fäkale "Kugeln" in Darmschleifen ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel