Meu rato está grávida? Avaliação de ultrassom de alta frequência

Resumo

O ultrassom de alta resolução pode ajudar a agilizar experimentos que requerem camundongos com tempo cronometrado, determinando o estado da gravidez, idade gestacional e perdas de gravidez. Apresentado aqui é um protocolo para ilustrar métodos para avaliar a gravidez do rato, bem como potenciais armadilhas (artefatos de imagem) que podem imitar a gravidez.

Resumo

O camundongo é o modelo animal mamífero de escolha para muitas doenças humanas e processos biológicos. A biologia do desenvolvimento muitas vezes requer camundongos grávidas em estágio para determinar processos em evolução em vários momentos. Além disso, a melhor e eficiente criação de camundongos modelo requer uma avaliação das gestações cronometrárias. Mais comumente, os ratos são acasalados durante a noite, e a presença de um plugue vaginal é determinada; no entanto, o valor preditivo positivo dessa técnica é subótimo, e é preciso esperar para saber se o rato está realmente grávida. A biomicroscopia de ultrassom de alta resolução é uma ferramenta eficaz e eficiente para a imagem: 1) Se um rato está grávida; 2) Que estágio gestacional o mouse atingiu; e 3) Se há perdas intrauterinas. Além dos embriões e fetos, o pesquisador também deve reconhecer artefatos comuns na cavidade abdominal para não confundi-los com um útero gravido. Este artigo fornece um protocolo para imagens, juntamente com exemplos ilustrativos.

Introdução

O camundongo é o modelo mamífero preferido para muitas doenças humanas e processos biológicos^1,2,3,4. Pesquisas em biologia do desenvolvimento muitas vezes exigem camundongos gestantes em estágio para determinar processos em evolução em vários momentos^5,6,7,8. Além disso, a melhor e eficaz criação de camundongos modelo requer uma avaliação das gestações cronometrárias, particularmente quando os pesquisadores estão estudando os efeitos de uma mutação genética no desenvolvimento. Normalmente, os investigadores acasalam ratos heterozigos durante a noite, procuram um plugue vaginal no início da manhã seguinte e esperam que uma gravidez se aconte^bem. Determinar a perda intrauterina normalmente começa com a verificação de uma ninhada recém-nascida para proporções mendelianas de genótipos, depois trabalhando para trás sacrificando camundongos gestantes em vários estágios gestacionais, e recuperando os embriões. Os pesquisadores podem determinar o ganho de peso como métrica de uma gravidez positiva^10,11; no entanto, especialmente com camundongos geneticamente modificados, as ninhadas podem ser muito pequenas e posteriormente ressordidas quando há perda intrauterina devido à qual o ganho de peso pode não ser óbvio (particularmente no início da gravidez, ~E6.5-8.5). Um rato pode parecer falsamente grávida devido, por exemplo, a um tumor abdominal benigno. Em essência, funciona "cego".

A biomicroscopia de ultrassom de alta resolução permite a visualização direta do útero gravid e o desenvolvimento de embriões de camundongos^{12,13,14,15,16}. Embora tivéssemos inicialmente desenvolvido métodos para avaliar a fisiologia cardiovascular do camundongo embrionário^16,17, reconhecemos a utilidade desta modalidade de imagem para agilizar a criação do nosso camundongo. Especificamente, não tínhamos mais que esperar para "ver" se um rato estava grávida, com base no óbvio ganho de peso ou no parto de uma ninhada; poderíamos determinar o estado gravid e reapreirto de ratos rapidamente se a represa não estivesse grávida. Além disso, perdas intrauterinas também poderiam ser facilmente imagens, e uma linha do tempo de perda poderia ser determinada sem sacrificar o mouse (ver Figura 1 para um esquema). Tempo, ratos modelo valiosos e fundos podem, assim, ser salvos.

Protocolo

Todas as etapas deste protocolo seguem o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina Grossman da Universidade de Nova York.

1. Acasalamento de camundongos para gestações cronometras

1. Emparelhe o rato fêmea apropriado (geralmente um heterozigoto) em uma gaiola com o rato macho apropriado (geralmente um heterozigoto) para acasalamento durante a noite.
2. Separe os ratos na manhã seguinte. Alternativamente, acasalam continuamente os camundongos femininos e machos, aumentando assim as chances de gravidez.
   NOTA: No entanto, uma gravidez com tempo preciso não pode ser garantida com a alternativa, e o estadiamento de embriões de camundongos por ultrassom não é claro, especialmente quando o processo da doença resulta em retardamento do crescimento intrauterino. Se os embriões que carregam a variante genética forem considerados pequenos, procure os maiores companheiros de ninhada selvagens para medir a idade gestacional.
   1. Opcional: Procure o plugue vaginal. Se não há plugue vaginal, o rato fêmea não foi acasalado. Se há um plugue vaginal, ainda é provável que o rato feminino não engravide.
3. Hora do dia após o acasalamento noturno como E0.5.
4. Realize imagens em E6.5-E.8.5 para determinar a gravidez e acasale os camundongos se o rato não estiver grávida (ver passo 1.1).
   NOTA: Nesta fase, a represa feminina não está obviamente grávida aos olhos; portanto, a imagem de ultrassom permite determinação precoce e re-acasalamento.

2. Anestesia e preparação do rato

1. Coloque o rato grávida na câmara de indução anestésico.
2. Misture isoflurane com ar de sala ou oxigênio médico, com uma concentração de 2%-3% a 1 L/min de fluxo para induzir a sedação do camundongo gestante na câmara de indução.
   NOTA: A sedação normalmente ocorre dentro de 1-2 min. O rato estará deitado ainda, e sua respiração terá diminuído.
3. Transfira rapidamente o mouse para a plataforma de imagem. A plataforma de imagem normalmente tem elementos de aquecimento também, o que pode ajudar a manter o mouse aquecido.
4. Coloque o nariz do rato no nariz anestésico.
5. Redirecione rapidamente a mistura isoflurane/oxigênio para o nariz da plataforma de imagem. Mantenha o isoflurane em 2%-3% a 1 L/min de fluxo.
6. Determine o nível de sedação por pinça de pata, reflexo córnea, nível de respiração e qualquer movimento.
   NOTA: O reflexo da córnea pode ser inicialmente determinado aplicando pomada hidratante aos olhos para evitar que eles sequem enquanto o rato é anestesiado (o rato não fecha os olhos).
7. Com o mouse deitado supino (em suas costas), tape as patas nas almofadas de eletrocardiograma (ECG) da plataforma de imagem.
   NOTA: No entanto, um Eletrocardiograma não é necessário para este tipo de imagem.
8. Remova a pele do abdômen da represa grávida da seguinte forma:
   1. Molhe bem a pele abdominal com 70% de etanol, incluindo até as bordas laterais. Não aplique tanto que haja escorrida na plataforma.
      NOTA: O etanol funciona melhor como lubrificante de barbear do que água.
   2. Use a lâmina de barbear para raspar cuidadosamente o abdômen. Tenha cuidado para não cortar os mamilos.
   3. Limpe a pele raspada do abdômen com gaze ou alguns lenços umedecidos.
   4. Alternativamente, use um creme depilatório depois de usar os cortadores de pele para remover a maior parte da pele.

3. Imagem transabdominal do (presumido) rato grávida

1. Depois que o abdômen for raspado, reduza o isoflurane para 1%-1,5%, mantendo ainda uma taxa de fluxo de 1 L/min. Monitore o nível de sedação pelo nível de respiração e quaisquer movimentos, bem como pitada de pata e/ou reflexo corneal.
   NOTA: A frequência cardíaca do mouse anestesiado normalmente será de 400 a 500/min, dependendo da temperatura do núcleo (retal). Para fins de uma rápida verificação de gravidez, não aqueça o camundongo a uma temperatura fisiológica do núcleo; a frequência cardíaca estará mais próxima de 400-450/min, mas pode cair ainda mais com um ritmo irregular caso o rato fique frio com imagens prolongadas.
   1. É importante ressaltar que as respirações são moderadas em profundidade e regularidade, não erráticas ou agonas (ofegante: profunda, lenta e errática, com profundas retrações intercostais e subcostais).
      NOTA: A taxa respiratória do rato não ventilado e anestesiado normalmente será de 60-100/min. Veja https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html e https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
2. Aplique o gel de ultrassom (acoplamento acústico) ao abdômen generosamente.
3. Coloque o transdutor de imagem no abdômen para orientá-lo em um plano horizontal: oriente a sonda para obter uma orientação esquerda-direita no sistema de imagem; o "ponto" ou cume indicado na lateral da sonda de imagem deve estar voltado para a direita.
   NOTA: Deslizar a sonda de imagem para a direita do mouse deve deslocar a imagem correspondente no sistema de ultrassom para a direita do mouse (imagine olhar "para cima" da cauda do mouse — a direita do mouse ficará no monitor).
   1. Normalmente, use o sistema de transmissão do sistema de imagem e o sistema manipulador de trilhos. Aqui, imagens de "mão livre" têm sido usadas em que o transdutor de imagem é portátil (duas mãos são mais firmes que uma) e que permite movimentos mais rápidos ao redor do abdômen. Esses movimentos, como será descrito abaixo, incluem movimentos rotacionais e translacionais. No entanto, isso requer mais prática.
4. Identifique a bexiga na tela(Vídeo 1).
5. Escaneando caudally da bexiga, identificar a vagina. Em seguida, escaneando lentamente e suavemente em uma direção craniana, identificar a bifurcação da vagina nos chifres uterinos esquerdo e direito(Figura 2; Vídeo 1).
6. Iniciar o levantamento do útero (chifres uterinos esquerdo e direito)¹³ (Figura 3; Vídeo 2).
   NOTA: Até a meia gestação (E10.5 ou E11.5), os embriões do rato serão posicionados ao longo das periferias direita e esquerda. À medida que crescem, as porções mais distais do útero e seus embriões correspondentes se transformarão para fora e posteriormente. À medida que os embriões crescem ainda mais (E15,5 e posteriores, geralmente), os fetos do rato serão posicionados quase aleatoriamente em várias direções, e torna-se difícil "rastrear" um útero de proximal a distal.
   1. Escaneie rapidamente simplesmente para verificar se um rato está grávida ou não. Este método rápido requer apenas o reconhecimento de um útero gravid e embriões de camundongos.
   2. Alternativamente, tome tempo extra para enumerar os embriões (vivos, mortos, resorgados) em cada chifre uterino.
      NOTA: Em geral, um embrião vivo exibirá órgãos distintos, como coração, membros, cabeça com ventrículos e olhos. Um embrião morto assume uma aparência homogênea e "mole", a menos que apenas morto. Os embriões resorulados têm uma mancha ecogênica no meio de um útero de aparência gravida(Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8).
   3. Para determinar se um embrião está realmente vivo, procure os batimentos cardíacos e/ou fluxo sanguíneo.
      NOTA: O mapeamento do fluxo doppler de cor pode ajudar na determinação da presença do fluxo sanguíneo, tanto no embrião quanto no cordão umbilical. Em geral, isso pode ser aplicado a embriões com mais de idade que o E8.5.
   4. Reconhecer artefatos potenciais que podem imitar um útero gravi(Figura 9, Figura 10). Além disso, como o gás intestinal e outros artefatos de "sombra" de ultrassom podem obscurecer segmentos do chifre uterino, realizar a imagem a partir de múltiplos pontos de vista para garantir a visualização adequada do útero.
7. Após a conclusão da pesquisa, limpe o gel do abdômen com gaze ou lenços umedecidos. Tente remover o máximo possível, pois o gel tende a esfriar o mouse.
8. Desarpe as patas e remova o rato do nariz anestésico.
9. Mova suavemente o rato de volta para a gaiola dela. Ela deve acordar e começar a se mover dentro de um minuto ou mais.
   NOTA: Camundongos geneticamente modificados podem demorar um pouco mais para se recuperar da anestesia e precisam ser observados mais de perto.

Resultados

Este protocolo permitirá que um investigador determine com confiança se um camundongo está grávida, inclusive durante os estágios iniciais e determinar se há perdas embrionárias ou fetais óbvias sem precisar sacrificar a represa grávida. Este protocolo é especialmente útil ao criar camundongos geneticamente modificados; tipicamente, cruzes heterozigous x heterozigosas para produzir descendentes homozigos leva ao fracasso do desenvolvimento adequado, o que causa letalidade pré-natal. A Fig...

Discussão

O primeiro passo mais importante na imagem é identificar a vagina e, em seguida, determinar a bifurcação do chifre uterino para a esquerda e para a direita. Seguindo cada chifre uterino, o imager é menos propenso a identificar mal os laços do intestino como o útero. Além disso, compreender as variações no aparecimento do intestino (com/sem matéria fecal) é importante para distingui-las do útero; ocasionalmente, "bolas" fecais em laços intestinais podem imitar um útero gravid (grávida). Embora outros autore...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel