내 마우스가 임신? 고주파 초음파 평가

요약

고해상도 초음파는 임신 상태, 임신 연령 및 임신 손실을 결정하여 임신 시간 임신 마우스를 요구하는 실험을 간소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 임신을 모방할 수 있는 잠재적인 함정 (이미지 아티팩트)뿐만 아니라 마우스 임신을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜입니다.

초록

마우스는 많은 인간 질병 및 생물학적 과정에 대한 선택의 포유류 동물 모델입니다. 발달 생물학은 수시로 각종 시점에서 진화하는 프로세스를 결정하기 위하여 단계적 임신 마우스를 요구합니다. 더욱이, 모형 마우스의 최적이고 능률적인 사육은 시간 시간 임신의 평가가 필요합니다. 가장 일반적으로, 마우스는 하룻밤 짝짓기되고, 질 플러그의 존재가 결정된다; 그러나 이 기술의 긍정적 예측 값은 최적이 지 않으며 마우스가 진정으로 임신했는지 알기 위해 기다려야 합니다. 고해상도 초음파 생체 현미경 검사는 이미징을위한 효과적이고 효율적인 도구입니다 : 1) 마우스가 임신했는지 여부; 2) 마우스가 도달 한 임신 단계; 및 3) 자궁 내 손실이 있는지 여부. 배아와 태아 이외에, 조사관은 또한 중력 자궁을 위해 이것을 착각하지 않도록 복강에 있는 일반적인 유물을 인식해야 합니다. 이 문서에서는 예시 예제와 함께 이미징을 위한 프로토콜을 제공합니다.

서문

마우스는 많은 인간 질환 및 생물학적 과정에 바람직한 포유류^{모델1,2,3,4이다.} 발달 생물학 연구는 종종 다양한 시점에서 진화 하는 과정을 결정 하기 위해 단계적 임신 마우스 필요^5,6,7,8. 더욱이, 모형 마우스의 최적이고 효과적인 사육은 특히 조사자가 발달에 유전자 돌연변이의 효력을 공부하는 때, 시간 조정한 임신의 평가가 요구합니다. 전형적으로, 수사관은 하룻밤 사이에 이종수 마우스를 짝짓고, 다음날 아침 일찍 질 플러그를 찾고, 임신이^9가되기를 바란다. 자궁 내 손실을 결정하는 것은 전형이 유전자형의 Mendelian 비율을 위해 신생아 쓰레기를 검사한 다음 다양한 임신 단계에서 임신 한 마우스를 희생하고 배아를 회복하여 거꾸로 작업하는 것으로 시작됩니다. 조사자는 양성 임신의 메트릭으로 체중 증가를 결정할 수 있습니다^10,11; 그러나, 특히 유전자 조작 마우스의 경우, 체중 증가가 분명하지 않을 수 있기 때문에 자궁 내 손실이있을 때 쓰레기는 매우 작고 이후에 resorbed 될 수 있습니다 (특히 임신 초기에, ~E6.5-8.5). 마우스는 양성 복부 종양에 예를 들면, 때문에 거짓 임신으로 나타날 수 있습니다. 본질적으로, 하나는 "블라인드"작동합니다.

고해상도 초음파 생체 현미경 검사는 중력 자궁의 직접 시각화 및 개발 마우스 배아^{(12,13,14,15,16)를}할 수 있습니다. 우리는 처음에 배아 마우스 심혈관 생리학을 평가하는 방법을 개발했지만^16,17,우리는 우리의 마우스 사육을 간소화하기 위해이 이미징 양식의 유용성을 인식. 특히, 우리는 더 이상 마우스가 임신 한 경우 "보기"를 기다릴 필요가 없었다, 명백한 체중 증가 또는 쓰레기의 배달 중 하나에 따라; 우리는 댐이 임신하지 않은 경우 중력 상태를 결정하고 신속하게 마우스를 재메이트 할 수 있습니다. 또한, 자궁 내 손실도 쉽게 이미지화될 수 있으며, 손실 의 타임라인은 마우스를 희생하지 않고 결정할 수 있습니다(회로도 1 참조). 따라서 시간, 귀중한 모델 마우스 및 자금을 절약 할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜의 모든 단계는 건강의 국가 학회에 의해 간행된 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지도를 따르고 뉴욕 대학 그로스만 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 시간 제임신을 위한 마우스의 짝짓기

1. 적절한 여성 마우스(보통 이종고테)를 케이지에 페어링하여 야간 짝짓기용 적절한 수컷 마우스(보통 이테로지고테)를 결합합니다.
2. 다음 아침에 마우스를 분리합니다. 대안적으로, 지속적으로 여성과 남성 마우스를 짝짓기, 따라서 임신의 기회를 증가.
   참고 : 그러나, 정확하게 시간 제 임신은 대안으로 보장 할 수 없으며, 초음파에 의한 마우스 배아의 준비는 명확하지 않다, 특히 질병 과정이 자궁 내 성장 지연을 초래할 때. 유전자 변이체를 운반하는 태아가 작게 가정되는 경우에, 임신 나이를 측정하기 위하여 더 큰 야생형 쓰레기종을 찾아보십시오.
   1. 선택 사항: 질 플러그를 찾습니다. 질 플러그가 없는 경우 여성 마우스가 메이트되지 않았습니다. 질 플러그가있는 경우, 여성 마우스가 임신하지 않을 가능성이 높습니다.
3. E0.5로 하룻밤 짝짓기 후 하루 시간.
4. E6.5-E.8.5에서 이미징을 수행하여 임신을 결정하고 마우스가 임신하지 않은 경우 마우스를 다시 메이트합니다(1.1단계 참조).
   참고 : 이 단계에서 여성 댐은 분명히 눈에 임신하지 않습니다. 따라서 초음파 이미징은 조기 결정과 재 결합을 허용합니다.

2. 마취 및 마우스 준비

1. 임신한 마우스를 마취 유도실에 놓습니다.
2. 실내 공기 또는 의료 용 산소와 이소플루란을 혼합하여 유도 챔버에서 임신 한 마우스의 체연을 유도하기 위해 1 L /min 유량에서 2 %-3 %의 농도로 혼합하십시오.
   참고: 세이션은 일반적으로 1-2분 이내에 발생합니다. 마우스는 가만히 누워있을 것이고, 그녀의 호흡은 느려질 것입니다.
3. 마우스를 이미징 플랫폼으로 빠르게 전송합니다. 이미징 플랫폼에는 일반적으로 가열 요소도 있어 마우스를 따뜻하게 유지하는 데 도움이 됩니다.
4. 마취 제 노콘에 마우스의 코를 놓습니다.
5. 이소플루란/산소 혼합물을 이미징 플랫폼 nosecone으로 신속하게 다시 라우팅합니다. 1 L/min 흐름에서 이소플루란을 2%-3%로 유지합니다.
6. 발 핀치, 각막 반사, 호흡 수준 및 움직임에 의해 포화 수준을 결정합니다.
   참고: 각막 반사는 마우스가 마취되는 동안 건조하지 않도록 눈에 보습 연고를 적용하여 처음에 결정할 수 있습니다 (마우스는 그녀의 눈을 감지 않습니다).
7. 마우스가 supine (뒷면에) 누워있는 경우, 이미징 플랫폼의 심전도 (EKG) 패드에 발을 테이프.
   참고: 그러나 이러한 종류의 이미징에는 EKG가 필요하지 않습니다.
8. 다음과 같이 임신 한 댐의 복부에서 모피를 제거하십시오.
   1. 복부 털을 측면 가장자리까지 포함하여 70 % 에탄올로 철저히 적시십시오. 플랫폼에 런오프가 있을 정도로 많이 적용되지 마십시오.
      참고: 에탄올은 물보다 면도 윤활유로 더 잘 작동합니다.
   2. 면도날을 사용하여 복부를 조심스럽게 면도합니다. 젖꼭지를 자르지 않도록 주의하십시오.
   3. 거즈 또는 일부 와이프와 복부떨어져 면도 모피를 닦아.
   4. 또는 모피 클리퍼를 사용하여 털의 대부분을 제거 한 후 디필 크림을 사용하십시오.

3. 임신 한 마우스 (추정) 임신 한 마우스의 복부 이미징

1. 복부를 면도한 후에도 이소플루란을 1%-1.5%로 줄이면 여전히 1L/min의 유량을 유지합니다. 호흡 및 움직임뿐만 아니라 발 핀치 및 / 또는 각막 반사의 수준에 의해 체형의 수준을 모니터링합니다.
   참고: 마취된 마우스의 심박수는 코어(직장) 온도에 따라 일반적으로 400-500/분입니다. 빠른 임신 검사의 목적을 위해, 생리적 코어 온도로 마우스를 따뜻하게하지 마십시오; 심박수는 400-450/분가까이 있을 것이지만, 마우스가 장시간 이미징으로 차가워지면 불규칙한 리듬으로 더 떨어질 수 있습니다.
   1. 중요한 것은, 호흡이 불규칙하거나 고뇌가 아닌 깊이와 규칙성이 적당하다는 것을 확인하십시오 (깊은, 느리고 불규칙하며 깊은 늑간 및 하위 비용 후퇴).
      참고: 비 환기, 마취 마우스의 호흡 속도는 일반적으로 60-100/분입니다 https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html.
2. 복부에 초음파(음향 커플링) 젤을 넉넉하게 발라주세요.
3. 화상 진찰 변환기를 복부에 배치하여 수평 평면에서 방향을 지정합니다: 이미징 시스템에 좌우 방향을 얻기 위해 프로브를 방향을 지정합니다. 이미징 프로브의 측면에 표시된 "점" 또는 능선은 오른쪽을 향해야 합니다.
   참고: 이미징 프로브를 마우스 오른쪽으로 슬라이딩하려면 초음파 시스템의 해당 이미지를 마우스의 오른쪽으로 이동시켜야 합니다(마우스꼬리에서 "위로"를 보는 것은 마우스의 오른쪽이 모니터에 남아 있는 것으로 상상해 보십시오).
   1. 일반적으로 이미징 시스템의 트랜스듀서 마운트 및 레일 조작기 시스템을 사용합니다. 여기서, "자유 손" 화상 진찰은 화상 진찰 변환기가 핸드 헬드 (두 손이 하나 보다는 안정적입니다) 복부 의 주위에 더 급속한 운동을 허용하는 곳에 이용되었습니다. 이러한 움직임은 아래 설명된 바와 같이 회전 및 번역 움직임을 모두 포함합니다. 그러나, 이것은 더 많은 연습이 필요합니다.
4. 화면의 방광을식별합니다(비디오 1).
5. 방광에서 caudally 스캔, 질을 식별. 그런 다음, 두개골 방향으로 천천히 부드럽게 스캔하고, 왼쪽과 오른쪽 자궁 뿔로 질의 분기를 식별(도 2; 비디오 1).
6. 자궁 (왼쪽 과 오른쪽 자궁 뿔)¹³ (그림 3; 비디오 2).
   참고: 임신 중(E10.5 또는 E11.5)까지 마우스 배아는 오른쪽과 왼쪽 주변을 따라 배치됩니다. 그(것)들이 성장할 때, 자궁과 그들의 상응하는 태아의 더 단종 부분은 바깥쪽과 후방으로 돌것입니다. 배아가 더 증가함에 따라 (E15.5 이상, 일반적으로), 마우스 태아는 다양한 방향으로 거의 무작위로 배치되고 근위에서 탈구로 자궁을 "추적"하기가 어려워집니다.
   1. 마우스가 임신 여부를 확인하기 위해 신속하게 스캔하십시오. 이 급속한 방법은 중력 자궁과 마우스 배아의 인식만 필요합니다.
   2. 또는 각 자궁 경적에서 배아 (살아있는, 죽은, resorbed)를 예포하는 데 여분의 시간을 할애하십시오.
      참고: 일반적으로 살아있는 배아는 심장, 사지, 심실이 있는 머리 및 눈과 같은 뚜렷한 장기를 전시할 것입니다. 죽은 배아는 죽은 채로 죽지 않는 한 균일하고 "무성한" 모습을 취합니다. 수근 배아는 중력보이는 자궁의 중간에 정확히 반향점을 가지게 한다(도4, 도 5, 도 6, 도 7, 도 8).
   3. 배아가 진정으로 살아 있는지 확인하려면 심장 박동 및 /또는 혈류를 찾습니다.
      참고: 컬러 도플러 흐름 매핑은 배아와 탯줄 모두에서 혈류의 존재를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로, 이것은 E8.5 보다 더 오래된 태아에 적용될 수 있습니다.
   4. 중력 자궁을 모방 할 수있는 잠재적 인 유물을 인식(그림 9, 그림 10). 또한, 대장가스와 다른 초음파 "그림자" 유물이 자궁 경적의 세그먼트를 모호하게 할 수 있기 때문에, 여러 유리한 지점에서 이미징을 수행하여 자궁의 적절한 시각화를 보장한다.
7. 조사가 완료되면 거즈 또는 물티슈로 복부에서 젤을 닦아냅니다. 젤이 마우스를 식히는 경향이 있기 때문에 가능한 한 많이 제거하십시오.
8. 발을 테이프해제하고 마취 노콘에서 마우스를 제거합니다.
9. 마우스를 케이지로 부드럽게 옮킨다. 그녀는 일어나서 1 분 정도 이내로 움직이기 시작해야합니다.
   참고: 유전자 변형 마우스는 마취에서 복구하는 데 조금 더 오래 걸릴 수 있으며 더 면밀히 관찰해야합니다.

결과

이 프로토콜은 조사관이 마우스가 임신 한 임신 여부를 자신있게 결정할 수 있게 합니다, 초기 단계 동안을 포함하여 및 임신한 댐을 희생할 필요 없이 명백한 산전 배아 또는 태아 손실이 있는지 여부를 결정하기 위하여. 이 프로토콜은 유전자 조작 된 마우스를 사육 할 때 특히 유용합니다. 전형적으로, 이종수구스 x 이종구스는 동종자 자손을 산출하기 위해 십자가를 지게 하여 산전 치사증을 ?...

토론

이미징의 가장 중요한 첫 번째 단계는 질을 식별한 다음 왼쪽과 오른쪽으로 자궁 뿔의 분기를 결정하는 것입니다. 각 자궁 경적을 따라, 이미저는 자궁으로 창자의 루프를 잘못 식별 할 가능성이 적습니다. 더욱이, 창자의 외관에 있는 변이를 이해하는 것은 (대변 의 유무에 관계없이) 자궁에서 이들을 구별하는 것이 중요합니다; 때때로, 배설물 "공" 창 자 루프에 중력을 모방할 수 있습니다 (임신)...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel