Il mio topo è incinta? Valutazione ecografico ad alta frequenza

Riepilogo

Gli ultrasuoni ad alta risoluzione possono aiutare a semplificare gli esperimenti che richiedono topi in gravidanza a tempo determinando lo stato di gravidanza, l'età gestazionale e le perdite di gravidanza. Presentato qui è un protocollo per illustrare i metodi per valutare le gravidanze del mouse e potenziali insidie (artefatti dell'immagine) che possono imitare la gravidanza.

Abstract

Il topo è il modello animale di mammiferi preferito per molte malattie umane e processi biologici. La biologia dello sviluppo richiede spesso topi in gravidanza a fasi per determinare i processi in evoluzione in vari punti di tempo. Inoltre, l'allevamento ottimale ed efficiente dei topi modello richiede una valutazione delle gravidanze a tempo. Più comunemente, i topi vengono accoppiati durante la notte e viene determinata la presenza di una spina vaginale; tuttavia, il valore predittivo positivo di questa tecnica è non ottimale e bisogna aspettare per sapere se il topo è veramente incinta. La biomicroscopia ad ultrasuoni ad alta risoluzione è uno strumento efficace ed efficiente per l'imaging: 1) Se un topo è incinta; 2) Quale stadio gestazionale ha raggiunto il topo; e 3) Se ci sono perdite intrauterina. Oltre agli embrioni e ai feti, l'investigatore deve anche riconoscere artefatti comuni nella cavità addominale in modo da non scambiarli per un utero gravide. Questo articolo fornisce un protocollo per l'imaging insieme ad esempi illustrativi.

Introduzione

Il topo è il modello di mammifero preferito per molte malattie umane e processi^{biologici 1,2,3,4}. La ricerca in biologia dello sviluppo richiede spesso topi in gravidanza a fasi per determinare i processi in evoluzione in vari^{punti di tempo 5,6,7,8}. Inoltre, l'allevamento ottimale ed efficace di topi modello richiede una valutazione delle gravidanze a tempo, in particolare quando gli investigatori stanno studiando gli effetti di una mutazione genica sullo sviluppo. In genere, gli investigatori accoppiano topi eterozigoti durante la notte, cercano una spina vaginale la mattina successiva e sperano che ne suscida^{una gravidanza 9}. Determinare la perdita intrauterina inizia in genere con il controllo di una cucciolata appena nata per i rapporti mendeliani dei genotipi, quindi lavorando all'indietro sacrificando i topi gravidi in varie fasi gestazionali e recuperando gli embrioni. Gli investigatori possono determinare l'aumento di peso come metrica di una gravidanza^{positiva 10,11}; tuttavia, specialmente con topi geneticamente modificati, le cucciolate possono essere molto piccole e successivamente riassorbiti quando c'è perdita intrauterina a causa della quale l'aumento di peso potrebbe non essere ovvio (in particolare all'inizio della gravidanza, ~ E6.5-8.5). Un topo può apparire falsamente incinta a causa, ad esempio, di un tumore addominale benigno. In sostanza, si lavora "ciechi".

La biomicroscopia ad ultrasuoni ad alta risoluzione consente la visualizzazione diretta dell'utero gravidato e lo sviluppo di embrioni di^{topo 12,13,14,15,16}. Sebbene inizialmente avessimo sviluppato metodi per valutare la fisiologia cardiovascolare del topo embrionale^16,17, abbiamo riconosciuto l'utilità di questa modalità di imaging per semplificare il nostro allevamento di topi. In particolare, non abbiamo più dovuto aspettare di "vedere" se un topo era incinta, in base all'ovvio aumento di peso o alla consegna di una cucciolata; potremmo determinare lo stato gravid e ri-accoppiare rapidamente i topi se la diga non era incinta. Inoltre, le perdite intrauterina potrebbero anche essere facilmente individuate e una sequenza temporale di perdita potrebbe essere determinata senza sacrificare il mouse (vedi figura 1 per uno schema). Il tempo, i topi modello preziosi e i fondi possono quindi essere risparmiati.

Protocollo

Tutte le fasi di questo protocollo seguono la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Grossman School of Medicine della New York University.

1. Accoppiamento di topi per gravidanze a tempo

1. Abbina il topo femmina appropriato (di solito un eterozigote) in una gabbia con il topo maschio appropriato (di solito un eterozigote) per l'accoppiamento notturno.
2. Separare i topi la mattina successiva. In alternativa, accoppia continuamente i topi femmine e maschi, aumentando così le possibilità di gravidanza.
   NOTA: Tuttavia, una gravidanza accuratamente programmata non può essere garantita con l'alternativa e la stadiazione degli embrioni di topo tramite ultrasuoni non è chiara, specialmente quando il processo della malattia provoca un ritardo della crescita intrauterina. Se si presume che gli embrioni che trasportano la variante genica siano piccoli, cerca i più grandi littermate di tipo selvatico per misurare l'età gestazionale.
   1. Facoltativo: cerca la spina vaginale. Se non c'è una spina vaginale, il topo femmina non è stato accoppiato. Se c'è una spina vaginale, è ancora probabile che il topo femmina non diventi incinta.
3. Ora il giorno dopo l'accoppiamento notturno come E0.5.
4. Eseguire l'imaging su E6.5–E.8.5 per determinare la gravidanza e ri-accoppiare i topi se il topo non è incinta (vedere il passaggio 1.1).
   NOTA: In questa fase, la diga femminile non è ovviamente incinta all'occhio; pertanto, l'imaging ad ultrasuoni consente la determinazione precoce e il riascoscimento.

2. Anestesia e preparazione del topo

1. Posizionare il topo incinta nella camera di induzione anestetica.
2. Mescolare l'isoflurane con aria ambiente o ossigeno medico, ad una concentrazione del 2%-3% a una portata di 1 L/min per indurre la sedazione del topo incinta nella camera di induzione.
   NOTA: La sedazione avviene tipicamente entro 1-2 minuti. Il topo giace fermo e il suo respiro avrà rallentato.
3. Trasferire rapidamente il mouse sulla piattaforma di imaging. La piattaforma di imaging in genere ha anche elementi riscaldanti, che possono aiutare a mantenere caldo il mouse.
4. Posizionare il naso del topo nel cono anestetico.
5. Ritrasstradare rapidamente la miscela isoflurane/ossigeno al nosecone della piattaforma di imaging. Mantenere l'isoflurane al 2%-3% a 1 L/min di flusso.
6. Determina il livello di sedazione per pizzico di zampa, riflesso corneale, livello di respirazione e qualsiasi movimento.
   NOTA: Il riflesso corneale può essere inizialmente determinato applicando un unguento idratante agli occhi per evitare che si asciughino mentre il topo viene anestetizzato (il mouse non chiude gli occhi).
7. Con il mouse sdraiato supina (sulla schiena), rastremi le zampe sui cuscinetti elettrocardiogramma (EKG) della piattaforma di imaging.
   NOTA: Tuttavia, un elettrocardiogramma non è necessario per questo tipo di imaging.
8. Rimuovere la pelliccia dall'addome della diga incinta come segue:
   1. Bagnare accuratamente la pelliccia addominale con il 70% di etanolo, anche fino ai bordi laterali. Non applicare così tanto che c'è il de-de-off sulla piattaforma.
      NOTA: L'etanolo funziona meglio come lubrificante da barba che come acqua.
   2. Utilizzare la lama del rasoio per radere accuratamente l'addome. Fare attenzione a non tagliare i capezzoli.
   3. Pulire la pelliccia rasata dall'addome con garza o alcune salviette.
   4. In alternativa, utilizzare una crema depilatoria dopo aver usato le tosaerba per rimuovere la maggior parte della pelliccia.

3. Imaging transabdominale del (presunto) topo incinta

1. Dopo che l'addome è stato rasato, ridurre l'isoflurane all'1%-1,5%, mantenendo comunque una portata di 1 L/min. Monitorare il livello di sedazione in base al livello di respirazione e agli eventuali movimenti, nonché al pizzico di zampa e / o riflesso corneale.
   NOTA: La frequenza cardiaca del mouse anestetizzato sarà in genere di 400-500/min, a seconda della temperatura del nucleo (rettale). Ai fini di un rapido controllo della gravidanza, non riscaldare il topo a una temperatura interna fisiologica; la frequenza cardiaca sarà più vicina a 400-450/min, ma potrebbe scendere ulteriormente con un ritmo irregolare se il topo si raffredda con immagini prolungate.
   1. È importante sottolineare che le respirazioni siano moderate in profondità e regolarità, non irregolari o agonali (ansimando: profonde, lente ed irregolari, con profonde retrazioni intercostali e sottocostali).
      NOTA: La frequenza respiratoria del topo anestetizzato non ventilato sarà in genere di 60-100/https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html min.
2. Applicare generosamente il gel ad ultrasuoni (accoppiamento acustico) sull'addome.
3. Posizionare il trasduttore di imaging sull'addome per orientarlo su un piano orizzontale: orientare la sonda per ottenere un orientamento sinistro-destro sul sistema di imaging; il "punto" o la cresta indicata sul lato della sonda di imaging deve essere rivolto a destra.
   NOTA: lo scorrimento della sonda di imaging verso destra del mouse dovrebbe spostare l'immagine corrispondente sul sistema ad ultrasuoni a destra del mouse (immagina di guardare "verso l'alto" dalla coda del mouse: la destra del mouse verrà lasciata sul monitor).
   1. In genere, utilizzare il sistema di montaggio trasduttore e il sistema di manipolatore ferroviario del sistema di imaging. Qui, è stata utilizzata l'imaging "mano libera" in cui il trasduttore di imaging è tenuto a mano (due mani sono più stabili di una) e che consente movimenti più rapidi intorno all'addome. Questi movimenti, come verrà delineato di seguito, includono sia movimenti rotazionali che traslazionali. Tuttavia, ciò richiede più pratica.
4. Identificare la vescica sullo schermo (Video 1).
5. Scansionando caudally dalla vescica, identificare la vagina. Quindi, scansionando lentamente e senza intoppi in una direzione cranica, identificare la biforcazione della vagina nelle corna uterine sinistra e destra (Figura 2; Video 1).
6. Iniziare l'indagine sull'utero (corna uterine sinistra e destra)¹³ (Figura 3; Video 2).
   NOTA: Fino alla gestazione media (E10.5 o E11.5), gli embrioni di topo saranno posizionati lungo le periferie destra e sinistra. Man mano che crescono, le porzioni più distali dell'utero e i loro embrioni corrispondenti si trasformeranno verso l'esterno e posteriormente. Man mano che gli embrioni crescono ulteriormente (E15.5 e versioni successive, in generale), i feti del topo saranno posizionati quasi casualmente in varie direzioni e diventa difficile "tracciare" un utero dal prossimale al distale.
   1. Scansiona rapidamente semplicemente per verificare se un topo è incinta o meno. Questo metodo rapido richiede solo il riconoscimento di un utero gravid e di embrioni di topo.
   2. In alternativa, prenditi del tempo extra per enumerare gli embrioni (vivi, morti, riassorbiti) in ogni corno uterino.
      NOTA: In generale, un embrione vivo esporrà organi distinti come un cuore, arti, testa con ventricoli e occhi. Un embrione morto assume un aspetto omogeneo e "mondo" a meno che non sia morto. Gli embrioni riassorbiti hanno un punto ecogenico millimetro nel mezzo di un utero dall'aspetto gravid(Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8).
   3. Per determinare se un embrione è veramente vivo, cercare il battito cardiaco e / o il flusso sanguigno.
      NOTA: La mappatura del flusso Doppler di colore può aiutare a determinare la presenza di flusso sanguigno, sia nell'embrione che nel cordone ombelicale. In generale, questo può essere applicato agli embrioni di età superiore all'E8.5.
   4. Riconoscere potenziali artefatti che possono imitare un utero gravid (Figura 9, Figura 10). Inoltre, poiché il gas intestinale e altri artefatti "ombra" ad ultrasuoni possono oscurare segmenti del corno uterino, eseguire l'imaging da più punti panoramici per garantire un'adeguata visualizzazione dell'utero.
7. Al termine dell'indagine, pulire il gel dall'addome con garza o salviette. Cerca di rimuovere il più possibile poiché il gel tende a raffreddare il mouse verso il basso.
8. Scoltare le zampe e rimuovere il mouse dal cono del naso anestetico.
9. Spostare delicatamente il mouse di nuovo nella sua gabbia. Dovrebbe svegliarsi e iniziare a muoversi nel giro di circa un minuto.
   NOTA: I topi geneticamente modificati possono richiedere un po 'più di tempo per riprendersi dall'anestesia e devono essere osservati più da vicino.

Risultati

Questo protocollo consentirà a uno sperimentatore di determinare con sicurezza se un topo è incinta, anche durante le prime fasi e di determinare se ci sono evidenti perdite embrionali o fetali prenatali senza dover sacrificare la diga incinta. Questo protocollo è particolarmente utile quando si allevano topi geneticamente modificati; tipicamente, le croci eterozigoti x eterozigoti per produrre prole omozigota portano al fallimento di uno sviluppo adeguato, che causa letalità prenatale. La figura...

Discussione

Il primo passo più importante nell'imaging è identificare la vagina e quindi determinare la biforcazione del corno uterino a sinistra e a destra. Seguendo ogni corno uterino, è meno probabile che l'imager identifichi erroneamente i loop dell'intestino come utero. Inoltre, comprendere le variazioni nell'aspetto dell'intestino (con /senza materia fecale) è importante per distinguerli dall'utero; occasionalmente, le "palle" fecali negli anelli intestinali possono imitare un utero gravide (incinta). Sebbene altri autori ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel