העכבר שלי בהריון? הערכת אולטראסאונד בתדר גבוה

Summary

אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יכול לעזור לייעל ניסויים הדורשים עכברים מתוזמן בהריון על ידי קביעת מצב ההריון, גיל ההיריון, ואובדן הריון. מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי להמחיש שיטות להערכת הריונות העכבר, כמו גם מלכודות פוטנציאליות (חפצי תמונה) שעשויים לחקות הריון.

Abstract

העכבר הוא המודל של בעלי חיים יונקים של בחירה עבור מחלות אנושיות רבות ותהליכים ביולוגיים. ביולוגיה התפתחותית דורשת לעתים קרובות עכברים בהריון מבוים כדי לקבוע תהליכים מתפתחים בנקודות זמן שונות. יתר על כן, רבייה אופטימלית ויעילה של עכברי מודל דורש הערכה של הריונות מתוזמן. בדרך כלל, עכברים הם הזדווגו לילה, ואת נוכחותו של תקע הנרתיק נקבע; עם זאת, הערך החיזוי החיובי של טכניקה זו הוא תת-אופטימלי, וצריך לחכות כדי לדעת אם העכבר באמת בהריון. ביומיקרוסקופיה אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה היא כלי יעיל ויעיל להדמיה: 1) אם עכבר בהריון; 2) לאיזה שלב הריון הגיע העכבר; ו -3) אם יש הפסדים תוך רחמיים. בנוסף לעוברים והעוברים, החוקר חייב גם לזהות חפצים נפוצים בחלל הבטן כדי לא לטעות אלה עבור רחם gravid. מאמר זה מספק פרוטוקול להדמיה יחד עם דוגמאות הממחישות.

Introduction

העכבר הוא המודל היונק המועדף על מחלות אנושיות רבות ותהליכים ביולוגיים^1,2,3,4. מחקר בביולוגיה התפתחותית דורש לעתים קרובות עכברים בהריון מבוים כדי לקבוע תהליכים מתפתחים בנקודות זמן שונות^5,6,7,8. יתר על כן, רבייה אופטימלית ויעילה של עכברי מודל דורשת הערכה של הריונות מתוזמן, במיוחד כאשר החוקרים חוקרים את ההשפעות של מוטציה בגן על ההתפתחות. בדרך כלל, החוקרים להזדווג עכברים הטרוזיגואליים לילה, לחפש תקע הנרתיק מוקדם בבוקר שלמחרת, ולקוות כי הריון מתרחש⁹. קביעת אובדן תוך רחמי בדרך כלל מתחילה בבדיקת המלטה שזה עתה נולדה ליחסי מנדליאן של גנוטיפים, ולאחר מכן עבודה לאחור על ידי הקרבת עכברים בהריון בשלבי הריון שונים, ושחזור העוברים. החוקרים עשויים לקבוע עלייה במשקל כמדד של הריון חיובי^10,11; עם זאת, במיוחד עם עכברים מהונדסים גנטית, המלטה עשויה להיות קטנה מאוד ולאחר מכן resorbed כאשר יש אובדן תוך רחמי בשל אשר העלייה במשקל לא יכול להיות ברור (במיוחד בשלב מוקדם של ההריון, ~ E6.5-8.5). עכבר עשוי להופיע בהריון כוזב עקב, למשל, לגידול שפיר בבטן. בעיקרו של דבר, אחד עובד "עיוור".

ביומיקרוסקופיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה ישירה של הרחם gravid ופיתוח עוברי עכבר^{12,13,14,15,16}. למרות שפיתחנו בתחילה שיטות להערכת פיזיולוגיה לב וכלי דם של עכבר עוברי^16,17, זיהינו את התועלת של מודאליות הדמיה זו כדי לייעל את הרבייה של העכבר שלנו. באופן ספציפי, אנחנו כבר לא צריכים לחכות "לראות" אם עכבר היה בהריון, מבוסס על עלייה במשקל ברור או משלוח של המלטה; אנחנו יכולים לקבוע את מצב gravid ולהזדווג מחדש עכברים במהירות אם הסכר לא היה בהריון. יתר על כן, הפסדים תוך רחמיים יכולים גם להיות בתמונה בקלות, וציר זמן של אובדן יכול להיקבע מבלי להקריב את העכבר (ראה איור 1 עבור סכמטי). זמן, עכברים מודל יקר, וקרנות ולכן ניתן לחסוך.

Protocol

כל השלבים בפרוטוקול זה פועלים בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה גרוסמן באוניברסיטת ניו יורק.

1. הזדווגות של עכברים עבור הריונות מתוזמן

1. שייך את העכבר הנשי המתאים (בדרך כלל הטרוזיגוטה) בכלוב עם העכבר הגברי המתאים (בדרך כלל הטרוזיגוטה) להזדווגות לילה.
2. הפרד את העכברים למחרת בבוקר. לחלופין, ברציפות להזדווג עם העכברים הנשיים והזכריים, ובכך להגדיל את הסיכויים להריון.
   הערה: עם זאת, הריון מתוזמן במדויק לא יכול להיות סמוך ובטוח עם החלופה, ובימוי של עוברי עכבר על ידי אולטרסאונד אינו ברור, במיוחד כאשר תהליך המחלה תוצאות פיגור צמיחה תוך רחמי. אם מניחים שהעוברים הנושאים את וריאנט הגנים קטנים, חפשו את חברי המלטה הגדולים יותר כדי לאמוד את גיל ההיריון.
   1. אופציונלי: חפש את תקע הנרתיק. אם אין תקע נרתיקי, העכבר הנשי לא הזדווג. אם יש תקע בנרתיק, זה עדיין סביר כי העכבר הנשי אינו נכנס להריון.
3. זמן יום לאחר הזדווגות לילה כמו E0.5.
4. בצע הדמיה ב E6.5-E.8.5 כדי לקבוע הריון, ולהזדווג מחדש את העכברים אם העכבר אינו בהריון (ראה שלב 1.1).
   הערה: בשלב זה, הסכר הנשי הוא לא ברור בהריון לעין; לפיכך, הדמיית אולטרסאונד מאפשר נחישות מוקדמת והזדווגות מחדש.

2. הרדמה והכנת עכבר

1. מניחים את העכבר ההרה בתא האינדוקציה ההרדמה.
2. מערבבים isoflurane עם אוויר בחדר או חמצן רפואי, בריכוז של 2%-3% בקצב זרימה של 1 L / min כדי לגרום להרדים את העכבר בהריון בתא האינדוקציה.
   הערה: סם ההיתוך מתרחש בדרך כלל תוך דקה עד 2 דקות. העכבר ישכב בשקט, ונשימתה תאט.
3. העבר במהירות את העכבר לפלטפורמת ההדמיה. פלטפורמת ההדמיה כוללת בדרך כלל גם רכיבי חימום, שיכולים לסייע בשמירה על חום העכבר.
4. מניחים את האף של העכבר לתוך האף ההרדמה.
5. נתב מחדש במהירות את תערובת החמצן/isoflurane לפלטפורמת ההדמיה nosecone. לשמור על isoflurane ב 2%-3% ב 1 L / min זרימה.
6. לקבוע את רמת הסם על ידי קמצוץ כפה, רפלקס הקרנית, רמת הנשימה, וכל תנועה.
   הערה: רפלקס הקרנית יכול להיקבע בתחילה על ידי החלת משחה לחות על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש בזמן שהעכבר מורדם (העכבר אינו עוצם את עיניה).
7. כשהעכבר שוכב על גבו, מדביק את כפות הרגליים לרפידות האלקטרוקרדיוגרמה (EKG) של פלטפורמת ההדמיה.
   הערה: עם זאת, אק"ג אינו נחוץ עבור סוג זה של הדמיה.
8. הסר את הפרווה מהבטן של הסכר ההריוני כדלקמן:
   1. הרטב את פרוות הבטן ביסודיות עם 70% אתנול, כולל עד הקצוות לרוחב. אל תחיל כל כך הרבה שיש בורח על הפלטפורמה.
      הערה: אתנול עובד טוב יותר כחומר סיכה גילוח מאשר מים.
   2. השתמש בסכין הגילוח כדי לגלח בזהירות את הבטן. תיזהר לא לחתוך את הפטמות.
   3. לנגב את הפרווה מגולח את הבטן עם גזה או כמה מגבונים.
   4. לחלופין, השתמש קרם depilatory לאחר שימוש קוצץ פרווה כדי להסיר את רוב הפרווה.

3. הדמיה טרנסבדומינלית של העכבר ההריוני (המשוער)

1. לאחר גילוח הבטן, יש להפחית את הטופוריה ל-1%-1.5%, תוך שמירה על קצב זרימה של 1 ל'/דקה. לפקח על רמת הסיד לפי רמת הנשימה וכל התנועות, כמו גם קמצוץ כפות ו / או רפלקס הקרנית.
   הערה: קצב הלב של העכבר המומר יהיה בדרך כלל 400-500/min, בהתאם לטמפרטורת הליבה (רקטלית). לצורך בדיקת הריון מהירה, אין לחמם את העכבר לטמפרטורת ליבה פיזיולוגית; קצב הלב יהיה קרוב יותר 400-450/min, אבל עשוי לרדת עוד יותר עם קצב לא סדיר אם העכבר להיות קר עם הדמיה ממושכת.
   1. חשוב לציין, ודא כי הנשימה היא מתונה לעומק וסדירה, לא יציב או מייסר (מתנשף: עמוק, איטי, ולא יציב, עם נסיגות intercostal עמוק subcostal).
      הערה: קצב הנשימה של העכבר הלא מאוורר והמ מורדם יהיה בדרך כלל 60-100/min. ראה https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
2. יש למרוח ג'ל אולטרסאונד (צימוד אקוסטי) על הבטן בנדיבות.
3. מניחים את מתמר ההדמיה על הבטן כדי לכוון אותו במישור אופקי: לכוון את החללית כדי להשיג כיוון שמאלי-ימני על מערכת ההדמיה; "נקודה" או רכס המצוין בצד של גשוש ההדמיה צריך להיות פונה ימינה.
   הערה: החלקת גשוש ההדמיה ימינה של העכבר אמורה להעביר את התמונה המתאימה במערכת האולטרסאונד ימינה של העכבר (דמיינו שאתם מסתכלים "למעלה" מזנב העכבר – זכות העכבר תישאר על הצג).
   1. בדרך כלל, השתמש במערכת המתמרים של מערכת ההדמיה ובמערכת המניפולטורים של המסילה. כאן נעשה שימוש בהדמיית "יד חופשית" שבה מתמר ההדמיה מוחזק ביד (שתי ידיים יציבות יותר מאחת) ומאפשר תנועות מהירות יותר סביב הבטן. תנועות אלה, כמתואר להלן, כוללות תנועות סיבוביות ותרגומיות. עם זאת, זה דורש תרגול נוסף.
4. זהה את שלפוחית השתן על המסך (וידאו 1).
5. סריקה caudally בשלפוחית השתן, לזהות את הנרתיק. לאחר מכן, סריקה איטית וחלקה בכיוון גולגולתי, לזהות את bifurcation של הנרתיק לתוך קרני הרחם שמאלה וימינה (איור 2; וידאו 1).
6. התחילו את הסקר של הרחם (קרני הרחם השמאלי והימני)¹³ (איור 3; וידאו 2).
   הערה: עד אמצע ההיריון (E10.5 או E11.5), עוברי העכבר יהיו ממוקמים לאורך הפריפריה הימנית והשמאלית. ככל שהם גדלים, החלקים הדיסטליים יותר של הרחם והעוברים המתאימים שלהם יהפכו כלפי חוץ ואחורי. ככל שהעוברים גדלים עוד יותר (E15.5 ואילך, בדרך כלל), עוברי העכבר ימוקמו כמעט באופן אקראי בכיוונים שונים, ויהיה קשה "לעקוב" אחר רחם מקרובימלי לדיסאלי.
   1. סרוק במהירות פשוט כדי לבדוק אם עכבר בהריון או לא. שיטה מהירה זו דורשת רק הכרה בעוברים של רחם ועכבר.
   2. לחלופין, קח זמן נוסף כדי למנות את העוברים (לחיות, מת, resorbed) בכל קרן הרחם.
      הערה: באופן כללי, עובר חי יציג איברים נפרדים כגון לב, גפיים, ראש עם חדרים ועיניים. עובר מת מקבל מראה הומוגני ו"רגשני", אלא אם כן הוא מת. לעוברים שעברו תפירה חוזרת יש נקודת הד מדויקת באמצע רחם בעל מראה גראביד(איור 4, איור 5, איור 6, איור 7, איור 8).
   3. כדי לקבוע אם עובר באמת בחיים, חפשו את פעימות הלב ו/או זרימת הדם.
      הערה: מיפוי זרימת דופלר צבע יכול לסייע בקביעת נוכחות של זרימת הדם, הן בעובר והן בחבל הטבור. באופן כללי, זה עשוי להיות מיושם על עוברים מעל גיל E8.5.
   4. זהה ממצאים פוטנציאליים שעשויים לחקות רחם גראביד(איור 9, איור 10). בנוסף, כמו גז מעיים וחפצי "צל" אולטרסאונד אחרים עשויים לטשטש קטעים של קרן הרחם, לבצע את ההדמיה מנקודות תצפית מרובות כדי להבטיח הדמיה נאותה של הרחם.
7. לאחר השלמת הסקר, לנגב את הג'ל מהבטן עם גזה או מגבונים. נסה להסיר ככל האפשר כמו ג'ל נוטה לקרר את העכבר למטה.
8. שחרר את כפות הרגליים, והסר את העכבר מההרדמה.
9. תזיז בעדינות את העכבר בחזרה לכלוב שלה. היא צריכה להתעורר ולהתחיל לנוע תוך דקה בערך.
   הערה: עכברים מהונדסים גנטית עשויים להימשך קצת יותר זמן כדי להתאושש מהרדמה ויש להשגיח עליך מקרוב יותר.

תוצאות

פרוטוקול זה יאפשר לחוקר לקבוע בביטחון אם עכבר בהריון, כולל בשלבים המוקדמים ולקבוע אם יש הפסדים עובריים או עובריים ברורים לפני הלידה ללא צורך להקריב את הסכר ההריוני. פרוטוקול זה שימושי במיוחד בעת רבייה עכברים מהונדסים גנטית; בדרך כלל, צלבים הטרוזיגוזיים x הטרוזיגיים להניב צאצאים הומוזיגיי...

Discussion

הצעד הראשון החשוב ביותר בהדמיה הוא לזהות את הנרתיק ולאחר מכן לקבוע את bifurcation של קרן הרחם שמאלה וימינה. על ידי ביצוע כל קרן הרחם, imager סביר פחות לזהות לולאות של המעי כמו הרחם. יתר על כן, הבנת הווריאציות במראה המעי (עם / בלי חומר צואה) חשוב להבדיל בין אלה לרחם; מדי פעם, "כדורים" צואה בלולאות מעיים ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilatory cream
Ethanol, 70%
Fur clippers
Gauze or KimWipes
Isoflurane
Medical oxygen (optional)
Medical tape
Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform)	Fujifilm Visual Sonics	Various	Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe
Razor blade (not a safety razor)
Scale (to weigh mouse)
Ultrasound gel