在金属阳离子存在下有限的蛋白水解和凝胶电泳：血清白蛋白中 Au（III） 结合发光结构域

摘要

我们提出了一种研究牛血清白蛋白 （BSA） 中 Au（III） 结合结构域的方案。

摘要

所提出的协议的目的是确定 BSA 中 Au（III） 结合的结构域。BSA-Au（III） 化合物表现出紫外 （UV） 可激发的红色发光 （λ_em = 640 nm），与芳香族残基产生的先天紫外/蓝色荧光相比，具有不寻常的斯托克斯位移。红光复合物在 pH 10 以上的高碱性条件下形成，需要蛋白质内部发生构象变化。此外，在 BSA 中保存 Cys-Cys 二硫键是获得这种红色发光的必要条件。为了了解这种发光的机制，阐明形成发光团的 Au（III） 结合位点是必不可少的。评估发光团形成位点的一种简单方法是 （1） 通过酶消化可预测地碎裂蛋白质，（2） 将获得的片段与 Au（III） 反应，然后 （3） 进行凝胶电泳以观察分离良好的片段条带并分析凝胶内的红色发光。然而，由于碱性条件和与金属阳离子的反应，必须应用新的有限蛋白水解技术和凝胶电泳条件。特别是，凝胶电泳中金属阳离子的存在会使条带分离在技术上变得困难。我们分步骤描述了这个新协议，以识别 BSA 中形成红色发光团的金属结合域。因此，该方案可用于分析在金属阳离子存在下必须保持非变性或部分变性状态的蛋白质片段。由于大多数蛋白质需要金属阳离子才能发挥作用，因此通常需要对金属结合蛋白质进行分析，这在文献中依赖于 X 射线晶体学。另一方面，该方法可用于补充剂，以研究蛋白质与金属阳离子的相互作用，而无需蛋白质结晶，并且在所需的 pH 条件下。

引言

通过在强碱性条件 （pH > 10） 下反应获得的牛血清白蛋白 ^1,2,3 （BSA）-金 （Au） 复合物已知表现出紫外线可激发的红色发光 （λ_em = 640 nm）^4,5,6,7。已经提出和研究了这种化合物的许多应用，包括传感^8,9,10成像11,12,13和纳米医学14,15,16。然而，发光的机制尚不完全清楚。确定 BSA 中 Au（III） 结合的位置和发光团的形成是一个重要的步骤。

最近已经阐明，BSA 的 pH 控制动态构象变化，然后 Au（III） 与 Cys-Cys 二硫键结合，是产生红色发光⁴ 所必需的。为了进一步了解这种发光的机制，阐明形成发光团的 Au（III） 结合位点是必不可少的。评估发光团形成位点的一种简单方法是通过酶消化将 BSA-Au 化合物碎裂，并分析每个片段的发光。然而，由于碱性条件和金属阳离子的存在，需要新的蛋白水解和凝胶电泳方案。

我们采用有限的酶促蛋白水解作为蛋白质片段制备的方法，同时保留 Cys-Cys 二硫键。在常规蛋白水解中，需要裂解所有二硫键和蛋白质线性化（通过变性剂，如二硫苏糖醇和尿素，以及加热）。在此，我们展示了 Cys-Cys 键保留蛋白水解，并评估与 Au（III） 反应后获得的片段及其发光。我们用胰蛋白酶来消化酶，就是一个具体的例子。

该方案通常描述了在金属阳离子存在下蛋白质和片段的凝胶电泳。由于大多数蛋白质需要金属阳离子才能发挥作用^17,18，因此通常需要分析金属结合的蛋白质，这在文献中依赖于 X 射线晶体学。BSA 及其片段的结构对于非中性 pH 构象（包括 pH > 10）尚不清楚。因此，Au（III） 配位的结构细节不能单独通过凝胶电泳来分析。另一方面，这种方法可用于补充剂，以研究蛋白质与金属阳离子的相互作用，而无需蛋白质结晶，这在所需的功能 pH 条件下可能无法实现。金属阳离子的存在会导致凝胶条带出现明显的“拖尾”。本文的重点是克服这一技术难题，并提出一种方案来最大限度地减少金属诱导的条带拖尾。

研究方案

1. BSA-Au 复合物片段的合成

1. 将 5 mg BSA 溶于 1 mL 含有 50 mM Tris-HCl 和 50 mM NaCl（pH 值为 8.0）的 HPLC 级水中，装在 5 mL 样品瓶中。
2. 将 2 mg 胰蛋白酶溶解在 1 mL 新鲜制备的 HPLC 水溶液中，该溶液含有 50 mM Tris-HCl 和 50 mM NaCl，pH 值为 8.0。
3. 将 BSA 反应瓶置于 37 °C 水浴中，并使用磁力搅拌器以 750 rpm 的速度剧烈搅拌。
4. 搅拌开始后，立即向溶液中加入 50 μL 新鲜制备的胰蛋白酶。
   注：与常规的酶消化反应相反，不应向溶液中添加十二烷基硫酸钠 （SDS）、二硫苏糖醇 （DDT） 或尿素。此外，不应进行温度退火。由于这种有限的蛋白水解，Cys-Cys 二硫键将保持完整，只有表面可接近的无规则线圈片段会被酶切割。
5. 将 Au（III） 氯化物（氯金酸）溶解在 1 mL HPLC 级水中，浓度为 750 μM。
6. 在反应瓶中加入氯金酸溶液，得到 1：10 的 BSA：Au 摩尔比。
7. 使用磁力搅拌器在 37 °C 和 750 rpm 下搅拌混合物 2 分钟。
8. 向反应瓶中加入 100 μL 1 M NaOH，使 pH 值达到 12.5。
   注：反应的高碱性条件应诱导红色发光复合物的形成并淬灭胰蛋白酶的酶活性。
9. 在 37 °C 下以 750 rpm 的速度剧烈搅拌混合物 2 小时。
   注：最终产品立即使用，无需进一步纯化。

2. 通过有限蛋白水解对 BSA-Au 复合物片段进行凝胶电泳

1. 使用去离子水冲洗预制的 4-12% 梯度 Bis-Tris 凝胶，并置于凝胶电泳槽中。
2. 从浓缩储备液中制备 500 mL MES 电泳缓冲液，用去离子水稀释。
3. 通过在 20% 甘油溶液中将样品稀释至 1 μg 蛋白质/μL 来制备每个孔泳道。这种稀释使 pH 值从 12.5 降低到 ~8。
   注：样品缓冲液中未使用 SDS、DTT 或尿素。此外，不应对样品进行温度退火。
4. 向凝胶的每个泳道中加入 10 μL 每种样品溶液。
5. 在 150 V 的恒定电压下电泳 1 小时。
6. 电泳凝胶后，从石膏中取出凝胶，用去离子水冲洗 3 次，每次 1 分钟，以去除电泳缓冲液。
7. 将凝胶储存在 200 mL 去离子水中，并立即使用凝胶成像系统测量凝胶内荧光。
8. 在 200 mL 以下溶液中制备含有 200 mg 考马斯亮蓝的新鲜染色溶液：甲醇、乙酸和水，体积比为 50：10：40。
9. 在 200 mL 染色溶液中轻轻摇动洗涤凝胶 30 分钟。
10. 将甲醇、乙酸和水以甲醇：乙酸：水 = 50：10：40 的体积比混合，制备新鲜的脱色溶液。
11. 在 100 mL 脱色溶液中轻轻搅拌，洗涤凝胶 1 小时。
12. 重复上述步骤4次，最后将固定的凝胶去离子水储存在室温下。

3. 通过有限蛋白水解分析 BSA-Au 复合物片段

1. 检查 BSA 的氨基酸序列并准备一张表格，假设 Cys-Cys 键保留（有限的蛋白水解），这些片段可以通过酶消化获得。在胰蛋白酶消化的情况下（表 1），切割位置是 Lys 和 Arg 的 C 端，但后面跟着 Pro。解释由于胰蛋白酶切割位置的模糊性而导致的片段分子量的小误差。
   注：分析 BSA 的氨基酸序列，从此步骤获得的预期极限胰蛋白酶片段为：[A]（7.3 kDa，残基 1 - 64）;[B]（5.9 kDa，残基 65 - 114）;[C]（20.1 ~ 22.4 kDa，残基 115/117 - 294/312）;[D] （21.3 ~ 23.4 kDa，残基 295/313 - 499）;和 [E]（9.5 kDa，残基 500 - 583）。胰蛋白酶切割位置的歧义是由 Cys 连接的单元之外的线段引起的。对于 BSA，残基 107 - 114 （0.9 kDa） 和残基 295 - 312 （2.1 kDa） 可以作为 Cys-Cys 键连接片段的 N 端或 C 端部分出现。
2. 确定这些预期片段中表面暴露的 Cys 的位置。对于胰蛋白酶消化的 BSA，唯一表面暴露的 Cys34 是片段 [A]。
3. 准备以凝胶电泳条带形式观察到的分子量列表，低于 ~66 kDa（BSA 的分子量）。
   注：对于胰蛋白酶消化，观察到的凝胶电泳条带为：条带 （1） = 未消化的 BSA;条带 （2） ~50 kDa;条带 （3） ~44 kDa;条带 （4） ~42 kDa;条带 （5） ~36 kDa;条带 （6） ~32 kDa;条带 （7） ~26 kDa;条带 （8） ~21 kDa;条带 （9） ~15 kDa;条带 （10） ~12 kDa;条带 （11） ~10 kDa;和带 （12） ~8 kDa。
4. 通过连续添加预期的 BSA 片段，重建凝胶中观察到的分子量列表。对于胰蛋白酶，片段 [A] 可以通过表面暴露的 Cys 残基形成 [A]-[A] 二聚体。

结果

观察到的 12 个凝胶条带是从 5 个预期的 BSA 片段 [A] - [E] 独特重建的（图 1）。结果与文献一致，其中保留了包括 α 螺旋和 β 链在内的二级结构 19,20,21,22,23。波段 （1） = [ABCDE]（未?...

讨论

本方案的目的是鉴定 BSA-Au 复合物中的红色发光团形成结构域。我们采用有限的胰蛋白酶蛋白水解来获得 BSA 片段，同时保留产生红色发光所必需的 Cys-Cys 键。我们优化了在 Au（III） 存在下进行蛋白水解和电泳的条件。相同的原理可以广泛应用于在金属阳离子存在下片段化蛋白质的凝胶分析。

我们进行了多次优化，以便能够分析 BSA-Au 片段及其凝胶内...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Azure Biosystems C400 gel imaging system	Azure Biosystems	C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
Glycerol, >99.0%	Sigma-Aldrich	G5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein Gel	Thermo Fisher	NP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	NP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)	Sigma-Aldrich	T1426