Proteólise Limitada e Eletroforese em Gel na Presença de Cátions Metálicos: Domínio Luminescente de Ligação a Au(III) em Albuminas Séricas

Resumo

Apresentamos um protocolo para estudo do domínio de ligação de Au(III) em albumina de soro bovino (BSA).

Resumo

O objetivo dos protocolos apresentados é determinar o domínio da ligação de Au(III) na BSA. O composto BSA-Au(III) exibe luminescência vermelha excitável por ultravioleta (UV) (λ_em = 640 nm), com deslocamentos de Stokes incomuns em comparação com a fluorescência UV/azul inata decorrente dos resíduos aromáticos. Os complexos vermelho-luminescentes são formados em condições altamente alcalinas acima de pH 10 e requerem uma mudança de conformação dentro da proteína para ocorrer. Além disso, a preservação das ligações dissulfeto Cys-Cys na BSA é necessária para obter essa luminescência vermelha. Para entender o mecanismo dessa luminescência, a elucidação do sítio de ligação do Au (III) formador de luminóforo é essencial. Uma maneira fácil de avaliar o local de formação do luminóforo seria (1) fragmentar previsivelmente a proteína por digestão enzimática, (2) reagir os fragmentos obtidos com Au (III) e, em seguida, (3) realizar eletroforese em gel para observar as bandas de fragmentos bem separadas e analisar a luminescência vermelha no gel. No entanto, devido às condições alcalinas e à reação com cátions metálicos, novas técnicas limitadas de proteólise e condições de eletroforese em gel devem ser aplicadas. Particularmente, a presença de cátions metálicos na eletroforese em gel pode dificultar tecnicamente as separações das bandas. Descrevemos este novo protocolo em etapas para identificar o domínio de ligação de metal formador de luminóforo vermelho na BSA. Este protocolo pode, portanto, ser aplicado para a análise de fragmentos de proteínas que devem permanecer em um estado não desnaturado ou parcialmente desnaturado, na presença de cátions metálicos. Como a maioria das proteínas precisa de cátions metálicos para funcionar, análises de proteínas ligadas a metais são frequentemente desejadas, que se baseiam na cristalografia de raios-x na literatura. Este método, por outro lado, pode ser usado em suplemento para estudar as interações de proteínas com cátions metálicos sem exigir a cristalização da proteína e em uma condição de pH desejada.

Introdução

Sabe-se que os complexos albumina ^1,2,3 (BSA)-ouro (Au) do soro bovino, obtidos por reações em condições altamente alcalinas (pH > 10), exibem luminescência vermelha excitável por UV (λ_em = 640 nm)^4,5,6,7. Numerosas aplicações deste composto foram propostas e investigadas, incluindo sensoriamento,8,9,10 imagens 11,12,13 e nanomedicina 14,15,16. No entanto, o mecanismo da luminescência não é totalmente compreendido. Identificar a localização da ligação de Au (III) e a formação de luminóforos na BSA é um passo importante.

Foi recentemente elucidado que a mudança de conformação dinâmica controlada por pH da BSA, seguida por uma ligação de Au (III) a uma ligação dissulfeto Cys-Cys, é necessária para produzir a luminescência vermelha⁴. Para obter mais informações sobre o mecanismo dessa luminescência, a elucidação do local de ligação do Au (III) formador de luminóforo é essencial. Uma maneira fácil de avaliar o local de formação do luminóforo é fragmentar o composto BSA-Au por digestão enzimática e analisar cada fragmento quanto à luminescência. No entanto, devido às condições alcalinas e à presença de cátions metálicos, novos protocolos de proteólise e eletroforese em gel são necessários.

Empregamos proteólise enzimática limitada como método de preparação de fragmentos de proteínas, preservando as ligações dissulfeto Cys-Cys. Na proteólise convencional, é necessária a clivagem de todas as ligações dissulfeto e a linearização de uma proteína (por agentes desnaturantes como ditiotreitol e uréia, além de calor). Aqui, demonstramos uma proteólise preservadora da ligação Cys-Cys e avaliamos os fragmentos obtidos e sua luminescência após a reação com Au(III). Usamos tripsina para a enzima digestiva, como um exemplo concreto.

O protocolo geralmente descreve a eletroforese em gel de proteínas e fragmentos na presença de cátions metálicos. Como a maioria das proteínas precisa de cátions metálicos para funcionar^17,18, análises de proteínas ligadas a metais são frequentemente desejadas, as quais têm se baseado na cristalografia de raios-x na literatura. As estruturas de BSA e seus fragmentos não são conhecidas por conformações de pH não neutro, inclusive em pH > 10. Portanto, os detalhes estruturais da coordenação de Au(III) não podem ser analisados apenas por eletroforese em gel. Este método, por outro lado, pode ser usado em suplemento para estudar as interações de proteínas com cátions metálicos sem exigir a cristalização da proteína, o que pode não ser possível em uma condição de pH funcional desejada. A presença de cátions metálicos pode causar "manchas" significativas das bandas de gel. O foco deste trabalho é superar essa dificuldade técnica e apresentar um protocolo para minimizar o smearing de bandas induzido por metais.

Protocolo

1. Síntese de fragmentos do complexo BSA-Au

1. Dissolva 5 mg de BSA em 1 mL de água de grau HPLC contendo 50 mM de Tris-HCl e 50 mM de NaCl com um pH de 8,0 em um frasco de 5 mL.
2. Dissolver 2 mg de tripsina em 1 ml de uma solução de água HPLC recentemente preparada contendo 50 mM de Tris-HCl e 50 mM de NaCl com um pH de 8,0.
3. Colocar o frasco de reação de BSA em banho-maria a 37 °C e agitar vigorosamente a 750 rpm usando um agitador magnético.
4. Imediatamente após o início da agitação, adicione 50 μL da tripsina recém-preparada à solução.
   NOTA: Nenhum dodecil sulfato de sódio (SDS), ditiotreitol (DDT) ou uréia deve ser adicionado à solução, ao contrário das reações convencionais de digestão enzimática. Além disso, nenhum recozimento de temperatura deve ser realizado. Devido a essa proteólise limitada, as ligações dissulfeto Cys-Cys serão mantidas intactas e apenas segmentos de bobina aleatórios acessíveis à superfície serão clivados pela enzima.
5. Dissolver o cloreto de Au(III) (ácido cloroáurico) em 1 ml de água de qualidade HPLC até uma concentração de 750 μM.
6. No frasco para injetáveis de reação, adicione a solução de ácido cloroáurico para obter uma relação molar BSA:Au resultante de 1:10.
7. Agitar a mistura durante 2 minutos a 37 °C e a 750 rpm com um agitador magnético.
8. Adicione 100 μL de NaOH 1 M ao frasco de reação para obter um pH de 12,5.
   NOTA: As condições altamente alcalinas da reação devem induzir a formação do complexo luminescente vermelho e extinguir a atividade enzimática da tripsina.
9. Agitar vigorosamente a mistura a 750 rpm durante 2 horas a 37 °C.
   NOTA: O produto final foi usado imediatamente sem purificação adicional.

2. Eletroforese em gel de fragmentos do complexo BSA-Au por proteólise limitada

1. Enxágue um gel Bis-Tris pré-moldado com gradiente de 4-12% usando água deionizada e coloque em um tanque de eletroforese em gel.
2. Prepare 500 mL de solução tampão MES a partir de uma solução de estoque concentrada, diluindo com água deionizada.
3. Prepare-se para cada pista de poço diluindo as amostras para 1 μg de proteína / μL em uma solução de glicerol a 20%. Essa diluição traz o pH de 12,5 para ~ 8.
   NOTA: Nenhum SDS, DTT ou ureia é usado no buffer de amostra. Além disso, o recozimento por temperatura das amostras não deve ser realizado.
4. Adicione 10 μL de cada solução de amostra a cada faixa do gel.
5. Execute o gel por 1 hora a uma tensão constante de 150 V.
6. Depois de passar o gel, remova o gel do gesso e enxágue 3 vezes por 1 minuto cada usando água deionizada para remover o tampão de corrida.
7. Armazene o gel em 200 mL de água deionizada e meça imediatamente a fluorescência no gel, usando um sistema de imagem em gel.
8. Prepare uma solução de coloração fresca contendo 200 mg de Coomassie Brilliant Blue em 200 mL da seguinte solução: metanol, ácido acético e água na proporção de volume de 50:10:40.
9. Lave o gel em 200 mL de solução de coloração por 30 minutos usando um balanço suave.
10. Prepare uma solução de descoloração fresca misturando metanol, ácido acético e água em uma proporção de volume de metanol: ácido acético: água = 50:10:40.
11. Lave o gel em 100 mL de solução descolorante por 1 hora mexendo suavemente.
12. Repita o procedimento acima 4 vezes e, finalmente, armazene a água deionizada em gel fixo à temperatura ambiente.

3. Análise de fragmentos do complexo BSA-Au por proteólise limitada

1. Examine a sequência de aminoácidos da BSA e prepare uma tabela de fragmentos esperados que podem ser obtidos por digestão enzimática, assumindo a preservação da ligação Cys-Cys (proteólise limitada). No caso da digestão de tripsina (Tabela 1), os locais de corte são o terminal C de Lys e Arg, exceto seguidos por Pro. Considere os pequenos erros nos pesos moleculares dos fragmentos, decorrentes da ambigüidade nos locais de corte tríptico.
   NOTA: Analisando a sequência de aminoácidos da BSA, os fragmentos trípticos limitados esperados obtidos nesta etapa são: [A] (7,3 kDa, resíduos 1 - 64); [B] (5,9 kDa, resíduos 65 - 114); [C] (20,1 ~ 22,4 kDa, resíduos 115/117 - 294/312); [D] (21,3 ~ 23,4 kDa, resíduos 295/313 - 499); e [E] (9,5 kDa, resíduos 500 - 583). A ambigüidade nos locais de corte tríptico resulta de segmentos fora das unidades conectadas por Cys. Para BSA, os resíduos 107 - 114 (0,9 kDa) e os resíduos 295 - 312 (2,1 kDa) podem aparecer como a parte terminal N ou C de um fragmento conectado à ligação Cys-Cys.
2. Identifique a localização (ões) do Cys exposto à superfície nesses fragmentos esperados. Para BSA digerida por tripsina, o único Cys34 exposto à superfície está no fragmento [A].
3. Preparar a lista dos pesos moleculares observados como bandas de electroforese em gel, abaixo de ~66 kDa (peso molecular do BSA).
   NOTA: Para a digestão da tripsina, as bandas de eletroforese em gel observadas são: Banda(1) = BSA não digerida; Banda (2) ~ 50 kDa; Banda (3) ~ 44 kDa; Banda (4) ~ 42 kDa; Banda (5) ~ 36 kDa; Banda (6) ~ 32 kDa; Banda (7) ~ 26 kDa; Banda (8) ~ 21 kDa; Banda (9) ~ 15 kDa; Banda (10) ~ 12 kDa; Banda (11) ~ 10 kDa; e Banda (12) ~ 8 kDa.
4. Reconstruir a lista dos pesos moleculares observados no gel, pelas adições sequenciais dos fragmentos de BSA esperados. Para a tripsina, o fragmento [A] pode formar dímero [A]-[A] através do resíduo de Cys exposto à superfície.

Resultados

As doze bandas de gel observadas foram reconstruídas exclusivamente a partir dos cinco fragmentos de BSA esperados [A] - [E] (Figura 1). Os resultados foram consistentes com a literatura, na qual as estruturas secundárias, incluindo α-hélices e fitas β, estão preservadas 19,20,21,22,23.

Discussão

O objetivo do presente protocolo foi identificar o domínio formador de vermelho-luminóforo em complexos BSA-Au. Empregamos proteólise tríptica limitada para obter os fragmentos de BSA, preservando as ligações Cys-Cys necessárias para produzir a luminescência vermelha. Otimizamos as condições para proteólise e eletroforese na presença de Au(III). Os mesmos princípios podem ser amplamente aplicados às análises em gel de proteínas fragmentadas na presença de cátions metál...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Azure Biosystems C400 gel imaging system	Azure Biosystems	C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
Glycerol, >99.0%	Sigma-Aldrich	G5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein Gel	Thermo Fisher	NP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	NP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)	Sigma-Aldrich	T1426