Proteólisis limitada y electroforesis en gel en presencia de cationes metálicos: dominio luminiscente de unión a Au(III) en albúminas séricas

Resumen

Presentamos un protocolo para el estudio del dominio de unión de Au(III) en albúmina sérica bovina (BSA).

Resumen

El propósito de los protocolos presentados es determinar el dominio de la unión de Au(III) en BSA. El compuesto BSA-Au(III) exhibe luminiscencia roja excitable por ultravioleta (UV) (λ_em = 640 nm), con cambios de Stokes inusuales en comparación con la fluorescencia UV/azul innata que surge de los residuos aromáticos. Los complejos luminiscentes rojos se forman en condiciones altamente alcalinas por encima de pH 10 y requieren un cambio de conformación dentro de la proteína para que ocurra. Además, es necesaria la preservación de los enlaces disulfuro Cys-Cys en BSA para obtener esta luminiscencia roja. Para comprender el mecanismo de esta luminiscencia, es esencial la elucidación del sitio de unión de Au(III) formador de luminóforos. Una forma fácil de evaluar el sitio formador de luminóforos sería (1) fragmentar de manera predecible la proteína por digestión enzimática, (2) reaccionar los fragmentos obtenidos con Au (III), luego (3) realizar electroforesis en gel para observar las bandas de fragmentos bien separadas y analizar la luminiscencia roja en gel. Sin embargo, debido a las condiciones alcalinas y a la reacción con cationes metálicos, se deben aplicar nuevas técnicas de proteólisis limitada y condiciones de electroforesis en gel. En particular, la presencia de cationes metálicos en la electroforesis en gel puede dificultar técnicamente las separaciones de bandas. Describimos este nuevo protocolo en pasos para identificar el dominio de unión de metales formadores de luminóforos rojos en BSA. Por lo tanto, este protocolo se puede aplicar para analizar fragmentos de proteínas que deben permanecer en un estado no desnaturalizado o parcialmente desnaturalizado, en presencia de cationes metálicos. Debido a que la mayoría de las proteínas necesitan cationes metálicos para funcionar, a menudo se desean análisis de proteínas unidas a metales, que se han basado en la cristalografía de rayos X en la literatura. Este método, por otro lado, podría usarse en suplementos para estudiar las interacciones de las proteínas con cationes metálicos sin requerir la cristalización de la proteína y en una condición de pH deseada.

Introducción

Se sabe que los complejos de albúmina ^1,2,3 (BSA)-oro (Au) en suero bovino, obtenidos por reacciones en condiciones altamente alcalinas (pH > 10), exhiben luminiscencia roja excitable por UV (λ_em = 640 nm)^4,5,6,7. Se han propuesto e investigado numerosas aplicaciones de este compuesto, entre ellas la detección8,9,10, la imagen 11,12,13 y la nanomedicina 14,15,16. Sin embargo, el mecanismo de la luminiscencia no se comprende completamente. La identificación de la ubicación de la unión de Au(III) y la formación de luminóforos en BSA es un paso importante.

Recientemente se ha dilucidado que el cambio de conformación dinámica controlado por pH de BSA, seguido de una unión de Au(III) a un enlace disulfuro Cys-Cys, es necesario para producir la luminiscencia roja⁴. Con el fin de obtener más información sobre el mecanismo de esta luminiscencia, es esencial la elucidación del sitio de unión de Au(III) formador de luminóforos. Una forma fácil de evaluar el sitio formador de luminóforos es fragmentar el compuesto BSA-Au por digestión enzimática y analizar cada fragmento para determinar la luminiscencia. Sin embargo, debido a las condiciones alcalinas y a la presencia de cationes metálicos, se necesitan nuevos protocolos de proteólisis y electroforesis en gel.

Empleamos la proteólisis enzimática limitada como método de preparación de fragmentos de proteínas, preservando los enlaces disulfuro Cys-Cys. En la proteólisis convencional, es necesario el escisión de todos los enlaces disulfuro y la linealización de una proteína (mediante agentes desnaturalizantes como el ditiotreitol y la urea, así como calor). En este trabajo, demostramos una proteólisis que preserva el enlace Cys-Cys y evaluamos los fragmentos obtenidos y su luminiscencia después de la reacción con Au(III). Usamos tripsina para la enzima digestiva, como un ejemplo concreto.

El protocolo describe generalmente la electroforesis en gel de proteínas y fragmentos en presencia de cationes metálicos. Debido a que la mayoría de las proteínas necesitan cationes metálicos para funcionar^17,18, a menudo se desean análisis de proteínas unidas a metales, que se han basado en la cristalografía de rayos X en la literatura. Las estructuras de BSA, y sus fragmentos, no se conocen por conformaciones de pH no neutro, incluso a pH > 10. Por lo tanto, los detalles estructurales de la coordinación de Au(III) no pueden analizarse solo mediante electroforesis en gel. Este método, por otro lado, podría usarse en suplementos para estudiar las interacciones de las proteínas con cationes metálicos sin requerir la cristalización de la proteína, lo que puede no ser posible en una condición de pH funcional deseada. La presencia de cationes metálicos puede causar un "manchado" significativo de las bandas de gel. El objetivo de este trabajo es superar esta dificultad técnica y presentar un protocolo para minimizar el frotis de banda inducido por metales.

Protocolo

1. Síntesis de fragmentos complejos BSA-Au

1. Disuelva 5 mg de BSA en 1 mL de agua de grado HPLC que contenga 50 mM de Tris-HCl y 50 mM de NaCl con un pH de 8.0 en un vial de 5 mL.
2. Disuelva 2 mg de tripsina en 1 mL de una solución recién preparada de agua de HPLC que contenga 50 mM de Tris-HCl y 50 mM de NaCl con un pH de 8,0.
3. Coloque el vial de reacción de BSA en un baño de agua a 37 °C y agite vigorosamente a 750 rpm con un agitador magnético.
4. Inmediatamente después de comenzar a agitar, agregue 50 μL de tripsina recién preparada a la solución.
   NOTA: No se debe agregar dodecil sulfato de sodio (SDS), ditiotreitol (DDT) o urea a la solución, a diferencia de las reacciones convencionales de digestión enzimática. Además, no se debe realizar un recocido a temperatura. Debido a esta proteólisis limitada, los enlaces disulfuro Cys-Cys se mantendrán intactos y solo los segmentos de bobina aleatorios accesibles en la superficie serán escindidos por la enzima.
5. Disuelva el cloruro de Au(III) (ácido cloroáurico) en 1 mL de agua de grado HPLC a una concentración de 750 μM.
6. En el vial de reacción, agregue la solución de ácido cloroáurico para obtener una relación molar BSA:Au resultante de 1:10.
7. Agitar la mezcla durante 2 minutos a 37 °C y a 750 rpm con un agitador magnético.
8. Añada 100 μL de NaOH 1 M al vial de reacción para alcanzar un pH de 12,5.
   NOTA: Las condiciones altamente alcalinas de la reacción deberían inducir la formación del complejo luminiscente rojo y apagar la actividad enzimática de la tripsina.
9. Agitar enérgicamente la mezcla a 750 rpm durante 2 horas a 37 °C.
   NOTA: El producto final se utilizó inmediatamente sin más purificación.

2. Electroforesis en gel de fragmentos del complejo BSA-Au por proteólisis limitada

1. Enjuague un gel Bis-Tris prefabricado con un gradiente de 4-12% con agua desionizada y colóquelo en un tanque de electroforesis de gel.
2. Prepare 500 mL de solución tampón de funcionamiento MES a partir de una solución madre concentrada, diluyendo con agua desionizada.
3. Prepárese para cada carril de pocillos diluyendo las muestras a 1 μg de proteína/μL en una solución de glicerol al 20%. Esta dilución lleva el pH de 12,5 a ~8.
   NOTA: No se utiliza SDS, DTT ni urea en el tampón de muestra. Además, no se debe realizar el recocido a temperatura de las muestras.
4. Agregue 10 μL de cada solución de muestra a cada carril del gel.
5. Haga funcionar el gel durante 1 hora a un voltaje constante de 150 V.
6. Después de ejecutar el gel, retire el gel del yeso y enjuague 3 veces durante 1 minuto cada una con agua desionizada para eliminar el tampón corriente.
7. Almacene el gel en 200 ml de agua desionizada y mida inmediatamente la fluorescencia en gel, utilizando un sistema de imágenes de gel.
8. Prepare una solución de tinción fresca que contenga 200 mg de Coomassie Brilliant Blue en 200 ml de la siguiente solución: metanol, ácido acético y agua en una proporción de volumen de 50:10:40.
9. Lave el gel en 200 ml de solución para tintar durante 30 minutos con un balanceo suave.
10. Prepare una solución desmanchante fresca mezclando metanol, ácido acético y agua en una proporción de volumen de metanol:ácido acético:agua = 50:10:40.
11. Lave el gel en 100 ml de solución antimanchas durante 1 hora agitando suavemente.
12. Repita el procedimiento anterior 4 veces y finalmente almacene el agua desionizada de gel fijo a temperatura ambiente.

3. Análisis de fragmentos del complejo BSA-Au mediante proteólisis limitada

1. Examinar la secuencia de aminoácidos de BSA y preparar una tabla de fragmentos esperados que se pueden obtener por digestión enzimática, asumiendo la preservación del enlace Cys-Cys (proteólisis limitada). En el caso de la digestión con tripsina (Tabla 1), las ubicaciones de corte son C-terminales de Lys y Arg, excepto seguidas de Pro. Tenga en cuenta los pequeños errores en los pesos moleculares de los fragmentos, derivados de la ambigüedad en las ubicaciones de corte tríptico.
   NOTA: Analizando la secuencia de aminoácidos de BSA, los fragmentos trípticos limitados esperados obtenidos de este paso son: [A] (7,3 kDa, residuos 1 - 64); [B] (5,9 kDa, residuos 65 - 114); [C] (20,1 ~ 22,4 kDa, residuos 115/117 - 294/312); [D] (21,3 ~ 23,4 kDa, residuos 295/313 - 499); y [E] (9,5 kDa, residuos 500 - 583). La ambigüedad en las ubicaciones de corte tríptico es el resultado de segmentos fuera de las unidades conectadas por Cys. Para BSA, los residuos 107 - 114 (0,9 kDa) y los residuos 295 - 312 (2,1 kDa) pueden aparecer como la parte N-terminal o C-terminal de un fragmento conectado por enlace Cys-Cys.
2. Identifique la(s) ubicación(es) de Cys expuesta a la superficie en estos fragmentos esperados. En el caso de la BSA digerida con tripsina, el único Cys34 expuesto a la superficie se encuentra en el fragmento [A].
3. Prepare la lista de pesos moleculares observados como bandas de electroforesis en gel, por debajo de ~ 66 kDa (peso molecular de BSA).
   NOTA: Para la digestión con tripsina, las bandas de electroforesis en gel observadas son: Band(1) = BSA no digerido; Banda (2) ~50 kDa; Banda (3) ~44 kDa; Banda (4) ~42 kDa; Banda (5) ~36 kDa; Banda (6) ~32 kDa; Banda (7) ~26 kDa; Banda (8) ~21 kDa; Banda (9) ~ 15 kDa; Banda (10) ~ 12 kDa; Banda (11) ~ 10 kDa; y Banda(12) ~8 kDa.
4. Reconstruya la lista de los pesos moleculares observados en el gel, mediante las adiciones secuenciales de los fragmentos de BSA esperados. En el caso de la tripsina, el fragmento [A] puede formar un dímero [A]-[A] a través del residuo Cys expuesto a la superficie.

Resultados

Las doce bandas de gel observadas se reconstruyeron de forma única a partir de los cinco fragmentos de BSA esperados [A] - [E] (Figura 1). Los resultados fueron consistentes con la literatura, en la que se conservan las estructuras secundarias, incluyendo α-hélices y β-hebras 19,20,21,22,23.

Discusión

El propósito del presente protocolo fue identificar el dominio formador de luminóforos rojos en complejos BSA-Au. Empleamos proteólisis tríptica limitada para obtener los fragmentos de BSA, al tiempo que preservamos los enlaces Cys-Cys que son necesarios para producir la luminiscencia roja. Optimizamos las condiciones para la proteólisis y la electroforesis en presencia de Au(III). Los mismos principios se pueden aplicar ampliamente a los análisis en gel de proteínas fragmentadas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Azure Biosystems C400 gel imaging system	Azure Biosystems	C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
Glycerol, >99.0%	Sigma-Aldrich	G5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein Gel	Thermo Fisher	NP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	NP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)	Sigma-Aldrich	T1426