JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол исследования связывающего домена Au(III) в бычьем сывороточном альбумине (БСА).

Аннотация

Целью представленных протоколов является определение домена связывания Au(III) в BSA. Соединение BSA-Au(III) демонстрирует возбуждаемую ультрафиолетовым (УФ) красную люминесценцию (λem = 640 нм) с необычными сдвигами Стокса по сравнению с врожденной УФ/синей флуоресценцией, возникающей из ароматических остатков. Красно-люминесцентные комплексы образуются в условиях высокой щелочи выше pH 10 и для этого требуется изменение конформации внутри белка. Кроме того, для получения этой красной люминесценции необходимо сохранение дисульфидных связей Cys-Cys в БСА. Чтобы понять механизм этой люминесценции, необходимо выяснить сайт связывания Au(III), образующий люминофор. Простой способ оценки люминофоробразующего сайта состоит в том, чтобы (1) предсказуемо фрагментировать белок путем ферментативного расщепления, (2) ререагировать полученных фрагментов с Au(III), затем (3) проводить гель-электрофорез для наблюдения за хорошо разделенными полосами фрагментов и анализировать внутригелеобразную красную люминесценцию. Однако из-за щелочных условий и реакции с катионами металлов необходимо применять новые методы ограниченного протеолиза и условия гель-электрофореза. В частности, присутствие катионов металлов в гель-электрофорезе может сделать разделение полос технически сложным. Мы описываем этот новый протокол в рамках этапов идентификации связывающего домена металла с красным люминофором в BSA. Таким образом, данный протокол может быть применен для анализа фрагментов белка, которые должны оставаться в неденатурированном или частично денатурированном состоянии в присутствии катионов металлов. Поскольку большинство белков нуждаются в катионах металлов для функционирования, часто требуется анализ белков, связанных с металлами, который в литературе опирается на рентгеновскую кристаллографию. Этот метод, с другой стороны, может быть использован в качестве дополнения для изучения взаимодействий белков с катионами металлов без необходимости кристаллизации белка и при желаемом состоянии pH.

Введение

Известно, что комплексы бычьего сывороточного альбумина 1,2,3 (BSA)-золота (Au), полученные в результате реакций в высокощелочных условиях (рН > 10), проявляют УФ-возбуждаемую красную люминесценцию (λem = 640 нм)4,5,6,7. Было предложено и исследовано множество применений этого соединения, включая зондирование,8,9,10 визуализацию 11,12,13 и наномедицину 14,15,16. Однако механизм люминесценции до конца не изучен. Важным шагом является определение места связывания Au(III) и образования люминофора в БСА.

Недавно было выяснено, что контролируемое pH динамическое изменение конформационного изменения BSA с последующим связыванием Au(III) с дисульфидной связью Cys-Cys необходимо для получения красной люминесценции4. Для того, чтобы получить более глубокое понимание механизма этой люминесценции, необходимо выяснить сайт связывания Au(III), образующий люминофор. Простым способом оценки люминофоробразующего сайта является фрагментация соединения BSA-Au путем ферментативного расщепления и анализ каждого фрагмента на люминесценцию. Однако из-за щелочных условий и наличия катионов металлов необходимы новые протоколы протеолиза и гель-электрофореза.

В качестве метода получения белковых фрагментов мы использовали ограниченный ферментативный протеолиз с сохранением дисульфидных связей Cys-Cys. При традиционном протеолизе необходимо расщепление всех дисульфидных связей и линеаризация белка (с помощью денатурирующих агентов, таких как дитиотреитол и мочевина, а также тепла). В данной работе мы демонстрируем протеолиз, сохраняющий связь Cys-Cys, и оцениваем полученные фрагменты и их люминесценцию после реакции с Au(III). В качестве конкретного примера мы используем трипсин для пищеварительного фермента.

Протокол в общих чертах описывает гель-электрофорез белков и фрагментов в присутствии катионов металлов. Поскольку большинство белков нуждаются в катионах металлов для функционирования17,18, часто требуется анализ белков, связанных с металлами, который в литературе опирается на рентгеновскую кристаллографию. Структуры БСА и их фрагменты не известны на предмет ненейтральной конформации рН, в том числе при рН > 10. Таким образом, структурные детали координации Au(III) не могут быть проанализированы только с помощью гель-электрофореза. Этот метод, с другой стороны, может быть использован в качестве дополнения для изучения взаимодействий белков с катионами металлов без необходимости кристаллизации белка, которая может оказаться невозможной при желаемом функциональном состоянии pH. Присутствие катионов металлов может вызвать значительное «размазывание» гелевых полос. Основное внимание в данной статье уделяется преодолению этой технической трудности и представлению протокола для минимизации размазывания полос, вызванного металлом.

протокол

1. Синтез фрагментов комплекса БСА-Au

  1. Растворите 5 мг BSA в 1 мл воды класса ВЭЖХ, содержащей 50 мМ Tris-HCl и 50 мМ NaCl с pH 8,0 во флаконе объемом 5 мл.
  2. Растворите 2 мг трипсина в 1 мл свежеприготовленного раствора воды ВЭЖХ, содержащей 50 мМ Tris-HCl и 50 мМ NaCl с pH 8,0.
  3. Поместите реакционный флакон с БСА на водяную баню при температуре 37 °C и энергично перемешайте при 750 об/мин с помощью магнитной мешалки.
  4. Сразу после начала помешивания добавьте в раствор 50 мкл свежеприготовленного трипсина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В раствор не следует добавлять додецилсульфат натрия (SDS), дитиотреитол (ДДТ) или мочевину, в отличие от обычных реакций ферментного расщепления. Также не следует проводить температурный отжиг. Благодаря этому ограниченному протеолизу дисульфидные связи Cys-Cys будут сохраняться нетронутыми, и только доступные на поверхности случайные сегменты катушки будут расщеплены ферментом.
  5. Растворите хлорид Au(III) (хлорауриновую кислоту) в 1 мл воды класса ВЭЖХ до концентрации 750 мкМ.
  6. В реакционный флакон добавьте раствор хлорауриновой кислоты, чтобы получить молярное соотношение BSA:Au 1:10.
  7. Перемешивайте смесь в течение 2 минут при температуре 37 °C и 750 об/мин с помощью магнитной мешалки.
  8. Добавьте 100 мкл 1 М NaOH в реакционный флакон для достижения pH 12,5.
    Примечание: Высокощелочные условия реакции должны вызывать образование красного люминесцентного комплекса и гасить ферментативную активность трипсина.
  9. Энергично перемешивайте смесь при 750 об/мин в течение 2 часов при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный продукт использовался сразу без дополнительной очистки.

2. Гель-электрофорез фрагментов комплекса BSA-Au методом ограниченного протеолиза

  1. Промойте предварительно отлитый гель Bis-Tris с градиентом 4-12% с помощью деионизированной воды и поместите в резервуар для гелевого электрофореза.
  2. Приготовьте 500 мл проточного буферного раствора MES из концентрированного исходного раствора, разбавив деионизированной водой.
  3. Подготовьте для каждой луночной дорожки, разбавив образцы до 1 мкг белка/мкл в 20% растворе глицерина. Это разбавление доводит pH от 12,5 до ~8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В буфере для проб не используются SDS, DTT или мочевина. Кроме того, не следует проводить температурный отжиг образцов.
  4. Добавьте по 10 мкл каждого раствора образца в каждую полосу геля.
  5. Запустите гель в течение 1 часа при постоянном напряжении 150 В.
  6. После запуска геля снимите гель с гипса и промойте 3 раза по 1 минуте каждый раз с использованием деионизированной воды для удаления бегущего буфера.
  7. Храните гель в 200 мл деионизированной воды и немедленно измеряйте флуоресценцию в геле с помощью системы визуализации геля.
  8. Приготовьте свежий раствор для окрашивания, содержащий 200 мг Coomassie Brilliant Blue в 200 мл следующего раствора: метанол, уксусная кислота и вода в объемном соотношении 50:10:40.
  9. Смойте гель в 200 мл раствора для окрашивания в течение 30 минут, используя мягкое покачивание.
  10. Приготовьте свежий раствор для удаления пятен, смешав метанол, уксусную кислоту и воду в объемном соотношении метанол:уксусная кислота:вода = 50:10:40.
  11. Промойте гель в 100 мл раствора для удаления пятен в течение 1 часа, осторожно помешивая.
  12. Повторите вышеописанную процедуру 4 раза и окончательно храните зафиксированный гель деионизированной водой при комнатной температуре.

3. Анализ фрагментов комплекса BSA-Au методом ограниченного протеолиза

  1. Изучите аминокислотную последовательность BSA и подготовьте таблицу ожидаемых фрагментов, которые могут быть получены путем ферментативного расщепления, при условии сохранения связи Cys-Cys (ограниченный протеолиз). В случае расщепления трипсина (Таблица 1) места разреза являются С-концом Lys и Arg, за исключением Pro. Учитывайте небольшие ошибки в молекулярной массе фрагментов, возникающие из-за неоднозначности мест триптических разрезов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируя аминокислотную последовательность BSA, ожидаемые ограниченные триптические фрагменты, полученные на этой стадии, следующие: [A] (7,3 кДа, остатки 1 - 64); [B] (5,9 кДа, остатки 65 - 114); [С] (20,1 ~ 22,4 кДа, остатки 115/117 - 294/312); [D] (21,3 ~ 23,4 кДа, остатки 295/313 - 499); и [E] (9,5 кДа, остатки 500 - 583). Неоднозначность в местах триптического разреза возникает из-за сегментов за пределами единиц, подключенных к Cys. Для BSA остатки 107 - 114 (0,9 кДа) и остатки 295 - 312 (2,1 кДа) могут проявляться как N- или C-конечная часть фрагмента, связанного с Cys-Cys.
  2. Определите местоположение (места) обнаженных на поверхности Cys в этих ожидаемых фрагментах. Для БСА, расщепленного трипсином, единственный поверхностно экспонированный Cys34 находится в фрагменте [А].
  3. Подготовьте список молекулярных масс, наблюдаемых в виде полос гель-электрофореза, ниже ~66 кДа (молекулярная масса BSA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расщепления трипсина наблюдаемые полосы гель-электрофореза следующие: Band(1) = непереваренный BSA; Полоса (2) ~50 кДа; Полоса (3) ~44 кДа; Полоса (4) ~42 кДа; Полоса (5) ~36 кДа; Полоса (6) ~32 кДа; Полоса(7) ~26 кДа; Полоса (8) ~21 кДа; Полоса (9) ~15 кДа; Полоса (10) ~12 кДа; Полоса (11) ~10 кДа; и Band(12) ~8 кДа.
  4. Реконструируйте список наблюдаемых молекулярных масс в геле путем последовательного добавления ожидаемых фрагментов BSA. Для трипсина фрагмент [A] может образовывать димер [A]-[A] через обнаженный на поверхности остаток Cys.

Результаты

Наблюдаемые двенадцать гелевых полос были однозначно реконструированы из пяти ожидаемых фрагментов БСА [A] - [E] (рис. 1). Полученные результаты согласуются с литературными данными, в которых вторичные структуры, включая α-спир...

Обсуждение

Целью настоящего протокола являлась идентификация краснолюминофоробразующего домена в комплексах BSA-Au. Мы использовали ограниченный триптический протеолиз для получения фрагментов BSA, сохраняя при этом связи Cys-Cys, необходимые для получения красной люминесценции. О?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

S.E. выражает признательность за поддержку со стороны Фонда PhRMA, Фонда исследований лейкемии и Национальных институтов здравоохранения (NIH R15GM129678).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium bicarbonate, 99.5%Sigma-Aldrich9830
Azure Biosystems C400 gel imaging systemAzure Biosystems C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%Sigma-AldrichA5611
Glycerol, >99.0%Sigma-AldrichG5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%Sigma-Aldrich520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein GelThermo FisherNP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)Thermo FisherNP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%Sigma-AldrichS7653
Sodium hydroxide, >98.0%Sigma-AldrichS8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)Sigma-Aldrich10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)Sigma-AldrichT1426

Ссылки

  1. Majorek, K. A., et al. Structural and immunologic characterization of bovine, horse, and rabbit serum albumins. Molecular Immunology. 52, 174-182 (2012).
  2. Peters, T. . All About Albumin. , (1996).
  3. Peters, T. Serum albumin. Advances in Protein Chemistry. 37, 161-245 (1985).
  4. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational change-induced fluorescence of bovine serum albumin-gold complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  5. Dixon, J. M., Egusa, S. Kinetics of the fluorophore formation in bovine serum albumin-gold complexes. The Journal of Physical Chemistry C. 123, 10094-10100 (2019).
  6. Dixon, J. M., Tomida, J., Egusa, S. Identifying the red-luminophore-forming domain in serum albumin-gold complexes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11, 3345-3349 (2020).
  7. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-directed synthesis of highly fluorescent gold nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  8. Chen, L. -. Y., Wang, C. -. W., Yuan, Z., Chang, H. -. T. Fluorescent gold nanoclusters: Recent advances in sensing and imaging. Analitycal Chemistry. 87, 216-229 (2015).
  9. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Review. 112, 2739-2779 (2012).
  10. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical Review. 104, 293-346 (2004).
  11. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of gold nanoparticles in cancer nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  12. Dorsey, J. F., et al. Gold nanoparticles in radiation research: potential applications for imaging and radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  13. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for biomedical imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  14. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles: interesting optical properties and recent applications in cancer diagnostics and therapy. Nanomedicine. 2, 681-693 (2007).
  15. Doane, T. L., Burda, C. The unique role of nanoparticles in nanomedicine: imaging, drug delivery and therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885-2911 (2012).
  16. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand exchange on gold nanoparticles for drug delivery and enhanced therapeutic index evaluated in acute myeloid leukemia models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853-861 (2014).
  17. Dupont, C. L., Butcher, A., Valas, R. E., Bourne, P. E., Caetano-Anollés, G. History of biological metal utilization inferred through phylogenomic analysis of protein structures. Proceedings of the National Academy of Science. 107, 10567-10572 (2010).
  18. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 13, 1205-1218 (2008).
  19. King, T. P. Limited pepsin digestion of bovine plasma albumin. Archives of Biochemistry and Biophysiscs. 156, 509-520 (1973).
  20. King, T. P., Spencer, M. Structural studies and organic ligand-binding properties of bovine plasma albumin. Journal of Biological Chemistry. 245, 6134-6148 (1970).
  21. Reed, R. G., Feldhoff, R. C., Clute, O. L., Peters, T. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Conformation and ligand binding. Biochemistry. 14, 4578-4583 (1975).
  22. Peters, T., Feldhoff, R. C. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of tryptic fragments. Biochemistry. 14, 3384-3391 (1975).
  23. Kazanov, M. D., et al. Structural determinants of limited proteolysis. Journal of Proteome Research. 10, 3642-3651 (2011).
  24. Ortiz, M. L., Calero, M., Fernandez Patron, C., Patron, C. F., Castellanos, L., Mendez, E. Imidazole-SDS-Zn reverse staining of proteins in gels containing or not SDS and microsequence of individual unmodified electroblotted proteins. FEBS Letters. 296, 300-304 (1992).
  25. Lee, C., Levin, A., Branton, D. Copper staining: A five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 166, 308-312 (1987).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Au IIIBSA Au III

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены