Eingeschränkte Proteolyse und Gelelektrophorese in Gegenwart von Metallkationen: Au(III)-bindende lumineszierende Domäne in Serumalbuminen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Untersuchung der Bindungsdomäne von Au(III) in Rinderserumalbumin (BSA) vor.

Zusammenfassung

Der Zweck der vorgestellten Protokolle ist es, die Domäne der Au(III)-Bindung in BSA zu bestimmen. Die BSA-Au(III)-Verbindung weist eine ultraviolett (UV)-erregbare rote Lumineszenz (λ_em = 640 nm) auf, mit ungewöhnlichen Stokes-Verschiebungen im Vergleich zur angeborenen UV/blauen Fluoreszenz, die aus den aromatischen Resten entsteht. Rot-lumineszierende Komplexe werden unter stark alkalischen Bedingungen über pH 10 gebildet und erfordern eine Konformationsänderung innerhalb des Proteins, um zu erfolgen. Darüber hinaus ist die Konservierung von Cys-Cys-Disulfidbindungen in BSA notwendig, um diese rote Lumineszenz zu erhalten. Um den Mechanismus dieser Lumineszenz zu verstehen, ist die Aufklärung der luminophorbildenden Au(III)-Bindungsstelle unerlässlich. Ein einfacher Weg, die Luminophor-bildende Stelle zu beurteilen, wäre (1) das Protein vorhersagbar durch enzymatischen Verdau zu fragmentieren, (2) die erhaltenen Fragmente mit Au(III) zu reagieren und dann (3) eine Gelelektrophorese durchzuführen, um die gut getrennten Fragmentbanden zu beobachten und die rote Lumineszenz im Gel zu analysieren. Aufgrund der alkalischen Bedingungen und der Reaktion mit Metallkationen müssen jedoch neue, eingeschränkte Proteolysetechniken und Gelelektrophoresebedingungen angewendet werden. Insbesondere das Vorhandensein von Metallkationen in der Gelelektrophorese kann die Bandentrennungen technisch erschweren. Wir beschreiben dieses neue Protokoll in Schritten, um die rot-luminophorbildende Metallbindungsdomäne in BSA zu identifizieren. Dieses Protokoll kann somit für die Analyse von Proteinfragmenten angewendet werden, die in Gegenwart von Metallkationen in einem nicht denaturierten oder teilweise denaturierten Zustand verbleiben müssen. Da die meisten Proteine Metallkationen benötigen, um zu funktionieren, sind Analysen von metallgebundenen Proteinen oft gewünscht, die sich in der Literatur auf die Röntgenkristallographie gestützt haben. Andererseits könnte diese Methode ergänzend verwendet werden, um die Wechselwirkungen von Proteinen mit Metallkationen zu untersuchen, ohne dass die Proteinkristallisation erforderlich ist und bei einem gewünschten pH-Zustand.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Rinderserumalbumin ^1,2,3 (BSA)-Gold (Au)-Komplexe, die durch Reaktionen unter stark alkalischen Bedingungen (pH > 10) erhalten werden, eine UV-erregbare rote Lumineszenz (λ_em = 640 ^nm) aufweisen4,5,6,7. Zahlreiche Anwendungen dieser Verbindung wurden vorgeschlagen und untersucht, darunter Sensorik, ^8,9,10, Bildgebung 11,12,13 und Nanomedizin 14,15,16. Der Mechanismus der Lumineszenz ist jedoch nicht vollständig verstanden. Die Identifizierung des Ortes der Au(III)-Bindung und der Luminophorbildung in BSA ist ein wichtiger Schritt.

Kürzlich wurde aufgeklärt, dass eine pH-kontrollierte dynamische Konformationsänderung von BSA, gefolgt von einer Au(III)-Bindung an eine Cys-Cys-Disulfidbindung, notwendig ist, um die rote Lumineszenz⁴ zu erhalten. Um weitere Einblicke in den Mechanismus dieser Lumineszenz zu gewinnen, ist die Aufklärung der luminophorbildenden Au(III)-Bindungsstelle unerlässlich. Eine einfache Methode zur Beurteilung der Luminophor-bildenden Stelle besteht darin, die BSA-Au-Verbindung durch enzymatischen Verdau zu fragmentieren und jedes Fragment auf seine Lumineszenz hin zu analysieren. Aufgrund der alkalischen Bedingungen und des Vorhandenseins von Metallkationen sind jedoch neue Proteolyse- und Gelelektrophoreseprotokolle erforderlich.

Wir verwendeten eine begrenzte enzymatische Proteolyse als Methode zur Herstellung von Proteinfragmenten, während die Cys-Cys-Disulfidbindungen erhalten blieben. Bei der konventionellen Proteolyse ist die Spaltung aller Disulfidbindungen und die Linearisierung eines Proteins (durch Denaturierungsmittel wie Dithiothreitol und Harnstoff sowie Wärme) notwendig. In dieser Arbeit demonstrieren wir eine Cys-Cys-Bindungs-erhaltende Proteolyse und bewerten die erhaltenen Fragmente und deren Lumineszenz nach der Reaktion mit Au(III). Als konkretes Beispiel verwenden wir Trypsin für das Verdauungsenzym.

Das Protokoll beschreibt im Allgemeinen die Gelelektrophorese von Proteinen und Fragmenten in Gegenwart von Metallkationen. Da die Mehrzahl der Proteine Metallkationen benötigt, um zu funktionieren^17,18, sind Analysen von metallgebundenen Proteinen oft wünschenswert, die sich in der Literatur auf die Röntgenkristallographie gestützt haben. Strukturen von BSA und ihre Fragmente sind nicht für nicht-neutrale pH-Konformationen bekannt, auch nicht bei pH > 10. Daher können die strukturellen Details der Au(III)-Koordination nicht allein durch Gelelektrophorese analysiert werden. Andererseits könnte diese Methode ergänzend verwendet werden, um die Wechselwirkungen von Proteinen mit Metallkationen zu untersuchen, ohne dass eine Proteinkristallisation erforderlich ist, die bei einer gewünschten funktionellen pH-Bedingung möglicherweise nicht möglich ist. Das Vorhandensein von Metallkationen kann zu einem erheblichen "Verschmieren" der Gelbanden führen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt darauf, diese technische Schwierigkeit zu überwinden und ein Protokoll zur Minimierung des metallinduzierten Bandenverschmierens vorzustellen.

Protokoll

1. Synthese von BSA-Au-Komplexfragmenten

1. Lösen Sie 5 mg BSA in 1 ml Wasser in HPLC-Qualität, das 50 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl mit einem pH-Wert von 8,0 enthält, in einer 5-ml-Durchstechflasche.
2. Löse 2 mg Trypsin in 1 ml einer frisch zubereiteten HPLC-Wasserlösung, die 50 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl mit einem pH-Wert von 8,0 enthält.
3. Stellen Sie das Reaktionsgefäß mit BSA in ein 37 °C heißes Wasserbad und rühren Sie mit einem Magnetrührer bei 750 U/min kräftig um.
4. Unmittelbar nach Beginn des Rührens werden 50 μl des frisch zubereiteten Trypsins in die Lösung gegeben.
   HINWEIS: Im Gegensatz zu den herkömmlichen Enzymaufschlussreaktionen sollte der Lösung kein Natriumdodecylsulfat (SDS), Dithiothreitol (DDT) oder Harnstoff zugesetzt werden. Es sollte auch kein Temperaturglühen durchgeführt werden. Aufgrund dieser begrenzten Proteolyse bleiben Cys-Cys-Disulfidbindungen intakt und nur oberflächlich zugängliche zufällige Spulensegmente werden vom Enzym gespalten.
5. Lösen Sie Au(III)-chlorid (Chloraurensäure) in 1 ml Wasser in HPLC-Qualität auf eine Konzentration von 750 μM.
6. Geben Sie die Chloraurinsäurelösung in das Reaktionsgefäß, um ein BSA:Au-Molverhältnis von 1:10 zu erhalten.
7. Die Mischung 2 Minuten lang bei 37 °C und bei 750 U/min mit einem Magnetrührer umrühren.
8. Geben Sie 100 μl 1 M NaOH in das Reaktionsgefäß, um einen pH-Wert von 12,5 zu erreichen.
   HINWEIS: Die hochalkalischen Bedingungen der Reaktion sollten die Bildung des roten Lumineszenzkomplexes induzieren und die enzymatische Aktivität von Trypsin unterdrücken.
9. Rühren Sie die Mischung 2 Stunden lang bei 37 °C bei 750 U/min kräftig um.
   HINWEIS: Das Endprodukt wurde sofort ohne weitere Reinigung verwendet.

2. Gelelektrophorese von BSA-Au-Komplexfragmenten durch begrenzte Proteolyse

1. Spülen Sie ein vorgegossenes Bis-Tris-Gel mit 4-12 % Gradient mit deionisiertem Wasser ab und geben Sie es in einen Gelelektrophoresetank.
2. Bereiten Sie 500 ml MES-Pufferlösung aus einer konzentrierten Stammlösung vor und verdünnen Sie sie mit deionisiertem Wasser.
3. Bereiten Sie sich auf jede Well-Lane vor, indem Sie die Proben auf 1 μg Protein/μl in einer 20%igen Glycerinlösung verdünnen. Diese Verdünnung bringt den pH-Wert von 12,5 auf ~8.
   HINWEIS: Im Probenpuffer wird kein SDS, DTT oder Harnstoff verwendet. Darüber hinaus sollte kein Temperaturglühen von Proben durchgeführt werden.
4. Geben Sie 10 μl jeder Probenlösung in jede Spur des Gels.
5. Lassen Sie das Gel 1 Stunde lang bei einer konstanten Spannung von 150 V laufen.
6. Nachdem Sie das Gel laufen lassen, nehmen Sie das Gel aus dem Gips und spülen Sie es 3 Mal für jeweils 1 Minute mit deionisiertem Wasser aus, um den laufenden Puffer zu entfernen.
7. Lagern Sie das Gel in 200 ml entionisiertem Wasser und messen Sie sofort die In-Gel-Fluoreszenz mit einem Gel-Imaging-System.
8. Bereiten Sie eine frische Färbelösung vor, die 200 mg Coomassie Brilliant Blue in 200 ml der folgenden Lösung enthält: Methanol, Essigsäure und Wasser in einem Volumenverhältnis von 50:10:40.
9. Waschen Sie das Gel 30 Minuten lang in 200 ml Fleckenlösung unter leichtem Schaukeln.
10. Bereiten Sie eine frische Entfärbungslösung vor, indem Sie Methanol, Essigsäure und Wasser in einem Volumenverhältnis von Methanol:Essigsäure:Wasser = 50:10:40 mischen.
11. Waschen Sie das Gel 1 Stunde lang in 100 ml Entfärbungslösung unter leichtem Rühren.
12. Wiederholen Sie den obigen Vorgang 4 Mal und lagern Sie schließlich das deionisierte Wasser mit festem Gel bei Raumtemperatur.

3. Analyse von BSA-Au-Komplexfragmenten durch eingeschränkte Proteolyse

1. Untersuchen Sie die Aminosäuresequenz von BSA und erstellen Sie eine Tabelle der erwarteten Fragmente, die durch enzymatischen Verdau erhalten werden können, unter der Annahme, dass die Cys-Cys-Bindung erhalten bleibt (begrenzte Proteolyse). Im Falle des Trypsinaufschlusses (Tabelle 1) sind die Schnittstellen der C-Terminus von Lys und Arg, mit der Ausnahme, dass Pro gefolgt wird. Berücksichtigen Sie die kleinen Fehler in den Molekulargewichten der Fragmente, die sich aus der Mehrdeutigkeit der tryptischen Schnittstellen ergeben.
   HINWEIS: Bei der Analyse der Aminosäuresequenz von BSA werden folgende begrenzte tryptische Fragmente aus diesem Schritt erwartet: [A] (7,3 kDa, Reste 1 - 64); [B] (5,9 kDa, Reste 65 - 114); [C] (20,1 ~ 22,4 kDa, Rückstände 115/117 - 294/312); [D] (21,3 ~ 23,4 kDa, Rückstände 295/313 - 499); und [E] (9,5 kDa, Reste 500 - 583). Mehrdeutigkeiten in tryptischen Schnittpositionen resultieren aus Segmenten außerhalb der Cys-verbundenen Einheiten. Für BSA können die Reste 107 - 114 (0,9 kDa) und die Reste 295 - 312 (2,1 kDa) als N- oder C-terminus-Teil eines Cys-Cys-gebundenen Fragments erscheinen.
2. Identifizieren Sie die Position(en) von oberflächenexponierten Cys in diesen erwarteten Fragmenten. Für Trypsin-verdautes BSA befindet sich das einzige oberflächenexponierte Cys34 im Fragment [A].
3. Erstellen Sie die Liste der Molekulargewichte, die als Gelelektrophoresebanden unter ~66 kDa (Molekulargewicht von BSA) beobachtet wurden.
   HINWEIS: Für den Trypsinverdau sind die beobachteten Gelelektrophoresebanden: Band(1) = unverdautes BSA; Band(2) ~50 kDa; Band(3) ~44 kDa; Band(4) ~42 kDa; Band(5) ~36 kDa; Band(6) ~32 kDa; Band(7) ~26 kDa; Band(8) ~21 kDa; Band(9) ~15 kDa; Band(10) ~12 kDa; Band(11) ~10 kDa; und Band(12) ~8 kDa.
4. Rekonstruieren Sie die Liste der beobachteten Molekulargewichte im Gel durch die sequentiellen Additionen der erwarteten BSA-Fragmente. Für Trypsin kann das Fragment [A] durch den oberflächenexponierten Cys-Rest ein [A]-[A]-Dimer bilden.

Ergebnisse

Die beobachteten zwölf Gelbanden wurden eindeutig aus den fünf erwarteten BSA-Fragmenten [A] - [E] rekonstruiert (Abbildung 1). Die Ergebnisse stimmten mit der Literatur überein, in der die Sekundärstrukturen einschließlich α-Helices und β-Strängen erhalten sind 19,20,21,22,23.

Diskussion

Der Zweck des vorliegenden Protokolls bestand darin, die rot-luminophorbildende Domäne in BSA-Au-Komplexen zu identifizieren. Wir setzten eine begrenzte tryptische Proteolyse ein, um die BSA-Fragmente zu erhalten, während die Cys-Cys-Bindungen, die für die Erzeugung der roten Lumineszenz notwendig sind, erhalten blieben. Wir optimierten die Bedingungen für die Proteolyse und Elektrophorese in Gegenwart von Au(III). Die gleichen Prinzipien können weitgehend auf die Gelanalyse von fra...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Azure Biosystems C400 gel imaging system	Azure Biosystems	C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
Glycerol, >99.0%	Sigma-Aldrich	G5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein Gel	Thermo Fisher	NP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	NP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)	Sigma-Aldrich	T1426