Proteolisi limitata ed elettroforesi su gel in presenza di cationi metallici: dominio luminescente legante l'Au(III) nelle albumine sieriche

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per lo studio del dominio di legame di Au(III) nell'albumina sierica bovina (BSA).

Abstract

Lo scopo dei protocolli presentati è quello di determinare il dominio del legame Au(III) in BSA. Il composto BSA-Au(III) mostra una luminescenza rossa eccitabile ai raggi ultravioletti (UV) (λ_em = 640 nm), con insoliti spostamenti di Stokes rispetto alla fluorescenza UV/blu innata derivante dai residui aromatici. I complessi rosso-luminescenti si formano in condizioni altamente alcaline al di sopra del pH 10 e richiedono un cambiamento di conformazione all'interno della proteina per verificarsi. Inoltre, per ottenere questa luminescenza rossa, è necessaria la conservazione dei legami disolfuro Cys-Cys nella BSA. Per comprendere il meccanismo di questa luminescenza, è essenziale chiarire il sito di legame dell'Au(III) che forma la luminoforo. Un modo semplice per valutare il sito di formazione del luminoforo sarebbe quello di (1) frammentare prevedibilmente la proteina mediante digestione enzimatica, (2) far reagire i frammenti ottenuti con Au(III), quindi (3) eseguire l'elettroforesi su gel per osservare le bande di frammenti ben separate e analizzare la luminescenza rossa in gel. Tuttavia, a causa delle condizioni alcaline e della reazione con i cationi metallici, è necessario applicare nuove tecniche di proteolisi limitate e condizioni di elettroforesi su gel. In particolare, la presenza di cationi metallici nell'elettroforesi su gel può rendere tecnicamente difficili le separazioni delle bande. Descriviamo questo nuovo protocollo in passaggi per identificare il dominio di legame del metallo che forma il luminocuro rosso in BSA. Questo protocollo può quindi essere applicato per l'analisi di frammenti proteici che devono rimanere in uno stato non denaturato o parzialmente denaturato, in presenza di cationi metallici. Poiché la maggior parte delle proteine ha bisogno di cationi metallici per funzionare, sono spesso desiderate analisi delle proteine legate ai metalli, che in letteratura si sono basate sulla cristallografia a raggi X. Questo metodo, d'altra parte, potrebbe essere utilizzato in integrazione per studiare le interazioni delle proteine con i cationi metallici senza richiedere la cristallizzazione delle proteine e ad una condizione di pH desiderata.

Introduzione

I complessi ^1,2,3 (BSA)-oro (Au) del siero bovino, ottenuti mediante reazioni in condizioni altamente alcaline (pH > 10), sono noti per mostrare luminescenza rossa eccitabile ai raggi UV (λ_em = 640 nm)^4,5,6,7. Numerose applicazioni di questo composto sono state proposte e studiate, tra cui il rilevamento, ^{l'imaging 8,9,10} 11,12,13 e la nanomedicina 14,15,16. Tuttavia, il meccanismo della luminescenza non è completamente compreso. Identificare la posizione del legame Au(III) e la formazione di luminofori nella BSA è un passo importante.

E' stato recentemente chiarito che il cambiamento di conformazione dinamica controllata dal pH di BSA, seguito da un legame Au(III) a un legame disolfuro Cys-Cys, è necessario per produrre la luminescenza rossa⁴. Al fine di ottenere ulteriori informazioni sul meccanismo di questa luminescenza, è essenziale chiarire il sito di legame dell'Au(III) che forma la luminoforo. Un modo semplice per valutare il sito di formazione della luminofora è frammentare il composto BSA-Au mediante digestione enzimatica e analizzare ogni frammento per la luminescenza. Tuttavia, a causa delle condizioni alcaline e della presenza di cationi metallici, sono necessari nuovi protocolli di proteolisi ed elettroforesi su gel.

Abbiamo impiegato una proteolisi enzimatica limitata come metodo di preparazione di frammenti proteici, preservando i legami disolfuro Cys-Cys. Nella proteolisi convenzionale, è necessaria la scissione di tutti i legami disolfuro e la linearizzazione di una proteina (da agenti denaturanti come il ditiotreitolo e l'urea, così come il calore). In questo articolo, dimostriamo una proteolisi con conservazione del legame Cys-Cys e valutiamo i frammenti ottenuti e la loro luminescenza dopo la reazione con Au(III). Usiamo la tripsina per l'enzima digestivo, come esempio concreto.

Il protocollo descrive generalmente l'elettroforesi su gel di proteine e frammenti in presenza di cationi metallici. Poiché la maggior parte delle proteine ha bisogno di cationi metallici per funzionare^17,18, sono spesso desiderate analisi di proteine legate ai metalli, che in letteratura si sono basate sulla cristallografia a raggi X. Le strutture di BSA e i loro frammenti non sono noti per conformazioni di pH non neutro, anche a pH > 10. Pertanto, i dettagli strutturali della coordinazione Au(III) non possono essere analizzati mediante la sola elettroforesi su gel. Questo metodo, d'altra parte, potrebbe essere utilizzato in aggiunta per studiare le interazioni delle proteine con i cationi metallici senza richiedere la cristallizzazione delle proteine, che potrebbe non essere possibile in una condizione di pH funzionale desiderata. La presenza di cationi metallici può causare una significativa "sbavatura" delle bande di gel. L'obiettivo di questo articolo è quello di superare questa difficoltà tecnica e di presentare un protocollo per minimizzare lo striscio di banda indotto dal metallo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Sintesi di frammenti del complesso BSA-Au

1. Sciogliere 5 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado HPLC contenente 50 mM di Tris-HCl e 50 mM di NaCl con un pH di 8,0 in un flaconcino da 5 mL.
2. Sciogliere 2 mg di tripsina in 1 mL di una soluzione di acqua HPLC appena preparata contenente 50 mM di Tris-HCl e 50 mM di NaCl con un pH di 8,0.
3. Porre il flaconcino di reazione di BSA in un bagnomaria a 37 °C e agitare energicamente a 750 giri/min utilizzando un agitatore magnetico.
4. Subito dopo l'inizio dell'agitazione, aggiungere alla soluzione 50 μl della tripsina appena preparata.
   NOTA: Non aggiungere alla soluzione dodecil solfato di sodio (SDS), ditiotreitolo (DDT) o urea, a differenza delle reazioni convenzionali di digestione enzimatica. Inoltre, non deve essere eseguita alcuna ricottura termica. A causa di questa proteolisi limitata, i legami disolfuro Cys-Cys saranno mantenuti intatti e solo i segmenti casuali della bobina accessibili in superficie saranno tagliati dall'enzima.
5. Sciogliere il cloruro Au(III) (acido cloroaurico) in 1 mL di acqua di grado HPLC a una concentrazione di 750 μM.
6. Nella fiala di reazione, aggiungere la soluzione di acido cloroaurico per ottenere un rapporto molare BSA:Au risultante di 1:10.
7. Mescolare la miscela per 2 minuti a 37 °C e a 750 giri/min utilizzando un agitatore magnetico.
8. Aggiungere 100 μl di NaOH 1 M alla fiala di reazione per ottenere un pH di 12,5.
   NOTA: Le condizioni di elevata alcalinità della reazione dovrebbero indurre la formazione del complesso luminescente rosso e spegnere l'attività enzimatica della tripsina.
9. Mescolare energicamente il composto a 750 giri/min per 2 ore a 37 °C.
   NOTA: Il prodotto finale è stato utilizzato immediatamente senza ulteriore purificazione.

2. Elettroforesi su gel di frammenti del complesso BSA-Au mediante proteolisi limitata

1. Sciacquare un gel Bis-Tris prefabbricato con gradiente 4-12% utilizzando acqua deionizzata e metterlo in una vasca per elettroforesi su gel.
2. Preparare 500 mL di soluzione tampone corrente MES da una soluzione madre concentrata, diluendo con acqua deionizzata.
3. Preparare ogni corsia di pozzetti diluendo i campioni a 1 μg di proteine/μL in una soluzione di glicerolo al 20%. Questa diluizione porta il pH da 12,5 a ~8.
   NOTA: Nel tampone del campione non viene utilizzata alcuna SDS, DTT o urea. Inoltre, la ricottura a temperatura dei campioni non deve essere eseguita.
4. Aggiungere 10 μl di ciascuna soluzione campione a ciascuna corsia del gel.
5. Far funzionare il gel per 1 ora a una tensione costante di 150 V.
6. Dopo aver eseguito il gel, rimuovere il gel dal gesso e risciacquare 3 volte per 1 minuto ciascuna utilizzando acqua deionizzata per rimuovere il tampone di scorrimento.
7. Conservare il gel in 200 ml di acqua deionizzata e misurare immediatamente la fluorescenza all'interno del gel, utilizzando un sistema di imaging su gel.
8. Preparare una soluzione colorante fresca contenente 200 mg di Coomassie Brilliant Blue in 200 mL della seguente soluzione: metanolo, acido acetico e acqua con un rapporto in volume di 50:10:40.
9. Lavare il gel in 200 ml di soluzione colorante per 30 minuti con un leggero dondolo.
10. Preparare una soluzione decolorante fresca mescolando metanolo, acido acetico e acqua a un rapporto in volume di metanolo:acido acetico:acqua = 50:10:40.
11. Lavare il gel in 100 ml di soluzione decolorante per 1 ora agitando delicatamente.
12. Ripetere la procedura di cui sopra 4 volte e infine conservare l'acqua deionizzata in gel fisso a temperatura ambiente.

3. Analisi di frammenti del complesso BSA-Au mediante proteolisi limitata

1. Esaminare la sequenza amminoacidica della BSA e preparare una tabella dei frammenti attesi che possono essere ottenuti mediante digestione enzimatica, assumendo la conservazione del legame Cys-Cys (proteolisi limitata). Nel caso della digestione della tripsina (Tabella 1), le posizioni di taglio sono C-terminale di Lys e Arg, tranne che seguite da Pro. Tenete conto dei piccoli errori nei pesi molecolari dei frammenti, derivanti dall'ambiguità nelle posizioni di taglio triptico.
   NOTA: Analizzando la sequenza amminoacidica di BSA, i frammenti triptici limitati attesi ottenuti da questo passaggio sono: [A] (7.3 kDa, residui 1 - 64); [B] (5,9 kDa, residui 65 - 114); [C] (20,1 ~ 22,4 kDa, residui 115/117 - 294/312); [D] (21,3 ~ 23,4 kDa, residui 295/313 - 499); e [E] (9,5 kDa, residui 500 - 583). L'ambiguità nelle posizioni dei tagli trittici deriva da segmenti esterni alle unità connesse a Cys. Per BSA, i residui 107 - 114 (0,9 kDa) e i residui 295 - 312 (2,1 kDa) possono apparire come parte N-terminale o C-terminale di un frammento connesso al legame Cys-Cys.
2. Identificare la posizione o le posizioni dei Cys esposti in superficie in questi frammenti previsti. Per la BSA digerita con tripsina, l'unica Cys34 esposta in superficie è nel frammento [A].
3. Preparare l'elenco dei pesi molecolari osservati come bande di elettroforesi su gel, inferiori a ~66 kDa (peso molecolare di BSA).
   NOTA: Per la digestione della tripsina, le bande di elettroforesi su gel osservate sono: Band(1) = BSA non digerito; Banda(2) ~50 kDa; Banda(3) ~44 kDa; Banda(4) ~42 kDa; Banda(5) ~36 kDa; Banda(6) ~32 kDa; Banda(7) ~26 kDa; Banda(8) ~21 kDa; Banda(9) ~15 kDa; Banda(10) ~12 kDa; Banda(11) ~10 kDa; e Banda(12) ~8 kDa.
4. Ricostruire l'elenco dei pesi molecolari osservati nel gel, mediante l'aggiunta sequenziale dei frammenti BSA attesi. Per la tripsina, il frammento [A] può formare dimero [A]-[A] attraverso il residuo Cys esposto in superficie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Le dodici bande di gel osservate sono state ricostruite in modo univoco dai cinque frammenti BSA attesi [A] - [E] (Figura 1). I risultati sono stati coerenti con la letteratura, in cui le strutture secondarie tra cui α-eliche e β-filamenti sono conservate 19,20,21,22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Lo scopo del presente protocollo è stato quello di identificare il dominio di formazione del rosso-luminocuro nei complessi BSA-Au. Abbiamo impiegato una limitata proteolisi triptica per ottenere i frammenti di BSA, preservando i legami Cys-Cys necessari per produrre la luminescenza rossa. Abbiamo ottimizzato le condizioni per la proteolisi e l'elettroforesi in presenza di Au(III). Gli stessi principi possono essere ampiamente applicati alle analisi su gel di proteine frammentate in pre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Azure Biosystems C400 gel imaging system	Azure Biosystems	C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
Glycerol, >99.0%	Sigma-Aldrich	G5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein Gel	Thermo Fisher	NP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	NP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)	Sigma-Aldrich	T1426