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요약

우리는 소 혈청 알부민(BSA)에서 Au(III)의 결합 도메인을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

제시된 프로토콜의 목적은 BSA에서 Au(III) 결합의 영역을 결정하는 것입니다. BSA-Au(III) 화합물은 방향족 잔류물에서 발생하는 타고난 UV/청색 형광에 비해 특이한 Stokes shift와 함께 자외선(UV)을 자극하는 적색 발광(λem = 640nm)을 나타냅니다. 적색 발광 복합체는 pH 10 이상의 고알칼리성 조건에서 형성되며 단백질 내에서 형태 변화가 발생해야 합니다. 또한, BSA에서 Cys-Cys 이황화 결합의 보존은 이러한 적색 발광을 얻기 위해 필요합니다. 이 발광의 메커니즘을 이해하려면 발광단을 형성하는 Au(III) 결합 부위의 규명이 필수적입니다. 발광단 형성 부위를 평가하는 손쉬운 방법은 (1) 효소 분해를 통해 단백질을 예측 가능하게 단편화하고, (2) 얻어진 단편을 Au(III)와 반응시킨 다음, (3) 겔 전기영동을 수행하여 잘 분리된 단편 띠를 관찰하고 겔 내 적색 발광을 분석하는 것입니다. 그러나 알칼리성 조건 및 금속 양이온과의 반응으로 인해 새로운 제한된 단백질 가수 분해 기술과 겔 전기 영동 조건을 적용해야 합니다. 특히, 겔 전기영동에서 금속 양이온의 존재는 밴드 분리를 기술적으로 어렵게 만들 수 있습니다. 이 새로운 프로토콜은 BSA에서 적색 발광단을 형성하는 금속 결합 도메인을 식별하기 위한 단계로 설명합니다. 따라서 이 프로토콜은 금속 양이온이 있는 상태에서 비변성 또는 부분적으로 변성된 상태로 남아 있어야 하는 단백질 단편을 분석하는 데 적용할 수 있습니다. 대부분의 단백질이 기능하기 위해서는 금속 양이온이 필요하기 때문에 금속 결합 단백질의 분석이 필요한 경우가 많으며, 이는 문헌의 X선 결정학에 의존해 왔습니다. 다른 한편으로는, 이 방법은 단백질 결정화를 요구하지 않고 그리고 원한 PH 상태에 금속 양이온과 단백질의 상호 작용을 공부하기 위하여 보충교재에서 이용될 수 있었습니다.

서문

고 알칼리성 조건 (pH > 10)에서 반응하여 얻은 소 혈청 알부민 1,2,3 (BSA) - 금 (Au) 복합체는 UV 흥분성 적색 발광 (λem = 640 nm) 4,5,6,7을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 이 화합물의 수많은 응용은 감지, 8,9,10, 이미징 11,12,13 및 나노 의학 14,15,16을 포함하여 제안되고 조사되었습니다. 그러나 발광의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. BSA에서 Au(III) 결합의 위치와 발광단 형성을 확인하는 것은 중요한 단계입니다.

적색 발광(red luminescence)을 산출하기 위해서는 BSA의 pH 제어 동적 형태 변화와 Cys-Cys 이황화 결합에 대한 Au(III) 결합이 필요하다는 것이 최근에 밝혀졌습니다4. 이 발광의 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 얻으려면 발광단을 형성하는 Au(III) 결합 부위를 규명하는 것이 필수적입니다. 발광단 형성 부위를 평가하는 쉬운 방법은 효소 분해를 통해 BSA-Au 화합물을 단편화하고 각 단편의 발광을 분석하는 것입니다. 그러나 알칼리성 조건과 금속 양이온의 존재로 인해 새로운 단백질 분해 및 겔 전기영동 프로토콜이 필요합니다.

우리는 단백질 단편 준비 방법으로 제한된 효소 단백질 가수 분해를 사용하면서 Cys-Cys 이황화 결합을 보존했습니다. 기존의 단백질 분해에서는 모든 이황화 결합의 절단과 단백질의 선형화(디티오트레이톨 및 요소와 같은 변성제와 열에 의해)가 필요합니다. 여기에서는 Cys-Cys 결합 보존 단백질 분해를 입증하고 Au(III)와의 반응 후 얻어진 단편과 그 발광을 평가합니다. 구체적인 예로 소화 효소를 위해 트립신을 사용합니다.

프로토콜은 일반적으로 금속 양이온이 있는 상태에서 단백질과 단편의 겔 전기영동을 설명합니다. 단백질의 대다수가 기능하기 위해 금속 양이온을 필요로 하기 때문에17,18, 문헌의 X선 결정학에 의존해 온 금속 결합 단백질의 분석이 종종 필요합니다. BSA의 구조 및 그 단편은 pH > 10을 포함한 비중성 pH 형태에 대해서는 알려져 있지 않습니다. 따라서 Au(III) 배위조건의 구조적 세부 사항은 겔 전기영동만으로는 분석할 수 없습니다. 다른 한편으로는, 이 방법은 단백질 결정화를 요구하지 않고 단백질과 금속 양이온의 상호 작용을 연구하기 위해 보충제에 사용될 수 있으며, 이는 원하는 기능적 pH 조건에서 불가능할 수 있습니다. 금속 양이온의 존재는 겔 밴드의 심각한 "번짐"을 유발할 수 있습니다. 본 논문의 초점은 이러한 기술적 어려움을 극복하고 금속에 의한 밴드 스미어링을 최소화하기 위한 프로토콜을 제시하는 것입니다.

프로토콜

1. BSA-Au 복합 단편의 합성

  1. 5mL 바이알에 50mM Tris-HCl 및 50mM NaCl을 함유한 8.0mM NaCl을 함유한 HPLC 등급 물 5mL에 BSA 5mg을 용해합니다.
  2. pH가 2인 50mM Tris-HCl 및 50mM NaCl을 함유한 갓 준비한 HPLC 물 1mL에 트립신 8.0mg을 용해합니다.
  3. BSA의 반응 바이알을 37°C 수조에 넣고 자석 교반기를 사용하여 750rpm으로 격렬하게 저어줍니다.
  4. 교반이 시작된 직후, 갓 준비한 트립신 50μL를 용액에 첨가합니다.
    참고: 기존의 효소 분해 반응과 달리 도데실황산나트륨(SDS), 디티오트레이톨(DDT) 또는 요소를 용액에 첨가해서는 안 됩니다. 또한 온도 어닐링을 수행해서는 안 됩니다. 이러한 제한된 단백질 분해로 인해 Cys-Cys 이황화 결합은 그대로 유지되고 표면에 접근 가능한 무작위 코일 세그먼트만 효소에 의해 절단됩니다.
  5. Au(III) 염화물(클로로오우르산)을 1mL의 HPLC 등급 물에 750μM의 농도로 용해시킵니다.
  6. 반응 바이알에 chloroauric acid 용액을 첨가하여 1:10의 BSA:Au 몰 비율을 생성합니다.
  7. 자석 교반기를 사용하여 37°C와 750rpm에서 2분 동안 혼합물을 저어줍니다.
  8. 100μL의 1M NaOH를 반응 바이알에 첨가하여 pH 12.5를 달성합니다.
    참고: 반응의 고알칼리성 조건은 적색 발광 복합체의 형성을 유도하고 트립신의 효소 활성을 억제해야 합니다.
  9. 혼합물을 750rpm에서 37°C에서 2시간 동안 격렬하게 저어줍니다.
    참고: 최종 제품은 추가 정제 없이 즉시 사용되었습니다.

2. 한정된 proteolysis에 의하여 BSA-Au 복합물 파편의 젤 전기 이동법

  1. 탈이온수를 사용하여 미리 캐스팅된 4-12% 구배 Bis-Tris 겔을 헹구고 겔 전기영동 탱크에 넣습니다.
  2. 농축된 원액에서 500mL의 MES 러닝 버퍼 용액을 준비하고 탈이온수로 희석합니다.
  3. 20% 글리세롤 용액에서 1μg의 단백질/μL로 샘플을 희석하여 각 웰 레인을 준비합니다. 이 희석은 pH를 12.5에서 ~ 8로 가져옵니다.
    참고: 샘플 버퍼에는 SDS, DTT 또는 요소가 사용되지 않습니다. 또한 샘플의 온도 어닐링을 수행해서는 안 됩니다.
  4. 각 샘플 용액 10μL를 겔의 각 레인에 추가합니다.
  5. 150V의 일정한 전압에서 1시간 동안 젤을 실행합니다.
  6. 젤을 실행한 후 캐스트에서 젤을 제거하고 탈이온수를 사용하여 각각 1분씩 3회 헹구어 흐르는 버퍼를 제거합니다.
  7. 겔을 탈이온수 200mL에 보관하고 겔 이미징 시스템을 사용하여 즉시 겔 내 형광을 측정합니다.
  8. 200mL의 메탄올, 아세트산 및 물 용액 200ml에 Coomassie Brilliant Blue 200mg을 50:10:40의 부피 비율로 포함하는 새로운 염색 용액을 준비합니다.
  9. 200mL의 염색 용액에 젤을 넣고 부드럽게 흔들어 30분 동안 세척합니다.
  10. 메탄올:아세트산:물 = 50:10:40의 부피 비율로 메탄올, 아세트산 및 물을 혼합하여 새로운 염색 제거 용액을 준비합니다.
  11. 100mL의 얼룩 제거 용액에 젤을 넣고 부드럽게 저어주어 1시간 동안 세척합니다.
  12. 위의 절차를 4회 반복하고 마지막으로 고정 겔 탈이온수를 실온에서 보관하십시오.

3. 제한된 단백질 분해에 의한 BSA-Au 복합 단편 분석

  1. BSA의 아미노산 서열을 검사하고 Cys-Cys 결합 보존(제한된 단백질 분해)을 가정하여 효소 분해로 얻을 수 있는 예상 단편 테이블을 준비합니다. 트립신 분해의 경우(표 1), 절단 위치는 Pro를 제외하고는 Lys와 Arg의 C-말단입니다. 트립틱 절단 위치의 모호성으로 인해 발생하는 단편 분자량의 작은 오류를 고려하십시오.
    참고: BSA의 아미노산 서열을 분석하면, 이 단계에서 얻어질 것으로 예상되는 제한된 트립틱 단편은 다음과 같습니다: [A] (7.3 kDa, 잔기 1 - 64); [B] (5.9 kDa, 잔류 65 - 114); [C] (20.1 ~ 22.4 kDa, 잔류 115/117 - 294/312); [D] (21.3 ~ 23.4 kDa, 잔류 295/313 - 499); 및 [E] (9.5 kDa, 잔류 500 - 583). 트립틱 절단 위치의 모호성은 Cys-connected units 외부의 세그먼트에서 발생합니다. BSA의 경우, 잔기 107 - 114 (0.9 kDa) 및 잔기 295 - 312 (2.1 kDa)는 Cys-Cys 결합 연결 단편의 N-말단 또는 C-말단 부분으로 나타날 수 있습니다.
  2. 이러한 예상 단편에서 표면에 노출된 Cys의 위치를 식별합니다. 트립신으로 분해된 BSA의 경우, 표면에 노출된 Cys34는 단편[A]에만 있습니다.
  3. 겔 전기영동 밴드로 관찰된 분자량 목록을 ~66 kDa(BSA의 분자량) 미만으로 준비합니다.
    참고: 트립신 분해를 위해 관찰된 겔 전기영동 밴드는 다음과 같습니다: 밴드(1) = 소화되지 않은 BSA; 밴드 (2) ~ 50kDa; 밴드 (3) ~ 44kDa; 밴드(4) ~42kDa; 밴드(5) ~36kDa; 밴드 (6) ~ 32kDa; 밴드(7) ~26kDa; 밴드(8) ~21kDa; 밴드 (9) ~ 15kDa; 밴드 (10) ~ 12kDa; 밴드 (11) ~ 10 kDa; 및 밴드 (12) ~ 8 kDa.
  4. 예상되는 BSA 단편의 순차적 첨가에 의해 겔에서 관찰된 분자량 목록을 재구성합니다. 트립신의 경우, 단편 [A]는 표면에 노출된 Cys 잔류물을 통해 [A]-[A] 이량체를 형성할 수 있습니다.

결과

관찰된 12개의 겔 띠는 5개의 예상되는 BSA 단편 [A] - [E]에서 고유하게 재구성되었습니다(그림 1). 결과는 α나선과 β가닥을 포함한 2차 구조가 보존된 문헌과 일치했다 19,20,21,22,23. Band(1) = [<...

토론

본 프로토콜의 목적은 BSA-Au 복합체에서 적색 발광단 형성 도메인을 식별하는 것이었습니다. 우리는 적색 발광을 생성하는 데 필요한 Cys-Cys 결합을 보존하면서 BSA 단편을 얻기 위해 제한된 트립틱 단백질 분해를 사용했습니다. 우리는 Au(III)의 존재 하에서 단백질 분해 및 전기영동을 위한 조건을 최적화했습니다. 동일한 원리가 금속 양이온이 존재하는 상태에서 단편화된...

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

S.E.는 PhRMA 재단, 백혈병 연구 재단 및 미국 국립보건원(NIH R15GM129678)의 지원을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium bicarbonate, 99.5%Sigma-Aldrich9830
Azure Biosystems C400 gel imaging systemAzure Biosystems C400
Bovine Serum Albumin (BSA), 96%Sigma-AldrichA5611
Glycerol, >99.0%Sigma-AldrichG5516
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%Sigma-Aldrich520918
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Protein GelThermo FisherNP0321BOX
NuPAGE MES Running Buffer (20X)Thermo FisherNP0002
Sodium Chloride (NaCl), >99.5%Sigma-AldrichS7653
Sodium hydroxide, >98.0%Sigma-AldrichS8045
Tris Hydrochloride (Tris-HCl)Sigma-Aldrich10812846001
Trypsin from Bovine Pancreas (>10,000 BAEE units/mg)Sigma-AldrichT1426

참고문헌

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