慢病毒递送的特异性shRNA在内质网应激神经元中的分子调节

摘要

在本研究中，通过使用特定的shRNA敲低PERK途径的两个下游信号成分，即细胞保护性钙调磷酸酶和促凋亡CHOP的表达。相反，这些调节原代皮质神经元在诱导内质网应激后对神经突萎缩的易感性。

摘要

由任何应激条件引起的内质网（ER）内未折叠蛋白质的积累，通过激活专用传感器触发未折叠蛋白质反应（UPR）。普遍定期审议首先试图恢复体内平衡;但如果损伤持续存在，信号传导诱导细胞凋亡。

越来越多的证据表明，持续和未解决的ER压力会导致许多病理状况，包括神经退行性疾病。由于UPR通过在细胞保护和凋亡过程之间切换来控制细胞命运，因此必须了解定义这种转变的事件以及参与其调节的元素。

最近，我们证明了异常的GM2神经节苷脂积累导致ER^{Ca 2+} 含量的消耗，这反过来又激活了UPR传感器之一的PERK（PKR样ER激酶）。此外，PERK信号传导参与GM2积累诱导的神经突萎缩和细胞凋亡。在这方面，我们已经建立了一个实验系统，使我们能够分子调节下游PERK成分的表达，从而改变神经元经历神经炎萎缩的脆弱性。

我们在大鼠皮质神经元培养物中敲低钙调磷酸酶（细胞保护）和CHOP（促凋亡）表达。细胞感染慢病毒递送的特异性shRNA，然后在不同时间用GM2处理，固定并用抗MAP2（微管相关蛋白2）抗体免疫染色。之后，使用荧光显微镜记录细胞图像，并使用公共领域图像处理软件ImageJ评估总神经突生长。抑制这些PERK信号成分的表达显然使得加速或延缓ER应激诱导的神经炎萎缩成为可能。

这种方法可用于ER应激的细胞系统模型，以评估神经元对神经突萎缩的脆弱性。

引言

内质网（ER）应激被定义为任何损害细胞器中蛋白质折叠能力的扰动。ER腔内未折叠蛋白的积累激活转导级联信号，称为未折叠蛋白反应（UPR）。这种复杂的信号通路由三个压力传感器协调:PERK（蛋白激酶RNA [PKR]样ER激酶），IRE1（需要肌醇的酶1）和ATF6（活化转录因子6）。所有人都试图恢复体内平衡。但如果压力持续存在，UPR最终会通过细胞凋亡1诱导细胞^死亡。

PERK 是一种 ER 跨膜蛋白，在 ER 应激下，导致真核起始因子-2 α （eIF2α） 的磷酸化，从而减少全局蛋白质合成，从而减少 ER² 中的蛋白质载量。我们证明了钙调磷酸酶A / B（CNA / B），一种异二聚体Ca²⁺ 磷酸酶，直接结合PERK的胞质结构域，增加其自身磷酸化并显着增强对蛋白质翻译和细胞活力的抑制^3，4。有趣的是，CNA / B在哺乳动物大脑中含量丰富，区分了CN亚基A的两种亚型:α和β。

在持续的ER应激下，PERK信号通路是唯一保持激活的UPR分支，从而介导促生存和凋亡反应。在慢性期，一个主要的下游事件是转录因子CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源^蛋白）的诱导5。慢性ER应激也越来越被认为是包括神经退行性疾病在内的各种病理性疾病的共同^因素6。重要的是要了解UPR如何促进细胞保护信号传导而不是细胞死亡 ⁷。然而，目前对控制这两个普遍定期审议阶段之间过渡的确切机制知之甚少。

最近，我们发现，在培养的神经元中，神经节苷脂GM2积聚在ER膜中并诱导管腔钙耗竭。这反过来又激活了PERK信号传导，其介导神经突萎缩和细胞凋亡 ⁸。在这项研究中，培养神经元中的GM2积聚被用作ER应激诱导的神经突萎缩的细胞系统模型。具体来说，操纵两种PERK因子表达，CN-Aα和CHOP在早期/保护性事件和慢性/凋亡期之间切换转换。为了实现这一目标，相应的基因被沉默;因此，原代皮质神经元培养物感染慢病毒递送的特异性shRNA。蛋白质印迹分析显示，与感染携带混乱shRNA的慢病毒的对照细胞相比，CN-Aα和CHOP表达水平显着降低。在此处理后，神经元经受外源性GM2的不同孵育时间，固定并用抗微管相关蛋白2（MAP2^）抗体9进行免疫染色。使用落射荧光显微镜获得图像。相对于总细胞数评估总神经突生长。

研究方案

动物程序按照国家卫生研究所实验动物护理和使用指南的批准方案进行。进行这项研究的批准由INIMEC-CONICET-UNC的动物护理和伦理委员会（CICUAL）批准（决议号014/2017 B和006/2017 A）。

1. 原代大鼠皮质神经元培养

1. 在CO 2室中用80%CO₂ / 20%O₂的混合物麻醉E18 Wistar怀孕大鼠60秒，然后通过脱臼颈椎进行处死。
2. 在层流罩中执行以下步骤。用镊子#3和直锋利的小弹簧剪刀（材料表）从胚胎中提取脑到细胞培养皿中的Hanks溶液。
3. 在 20 倍放大镜下解剖组织，使用两个细尖镊子 #5 样式，将额叶皮层与脑膜分开。将额叶皮层转移到15mL锥形管中，并在37°C下用3-4mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%）孵育组织15分钟以进行化学消化。
4. 消化后，用 3-4mL Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FCS） 稀释。然后用Ca 2 + / Mg^{2 +}游离Hanks平衡盐溶液和0.1%葡萄糖离心（3000g，5分钟）洗涤3次。
5. 使用 1000 μL 吸头在 DMEM 加 10% FCS（材料表）中上下移液，机械解离组织 10 次。然后将匀浆以100×g离心1分钟，收集上清液并将剩余体积完成至1000μL。
6. 用含有10%FCS，1%青霉素/链霉素和1%必需氨基酸添加剂的2mL DMEM将细胞悬液以520 Cell / mm² 的密度铺在细胞培养皿上（见 材料表）。然后在37°C下在含有5%CO₂ 的潮湿环境中孵育2小时。
   1. 细胞培养皿的有机物去除和聚-L-赖氨酸包衣
      1. 通过将玻璃材料放入反应室中来去除有机物，并加入96%的乙醇以几乎覆盖材料。然后逐滴加入68%（w / v）硝酸，直到开始出现棕绿色气泡。一旦发生这种情况，请部分覆盖容器并让反应继续直到爆炸停止。
         注意:清除气体提取舱下方的有机物，以避免接触有毒气体。
      2. 在聚L-赖氨酸涂层之前，用无菌Mili-Q水冲洗眼镜约十次。然后在使用前将培养杯和培养皿与0.1μg/ μL聚-L-赖氨酸孵育4小时。孵育后，用无菌Mili-Q水冲洗玻璃杯约十次。
7. 为了允许神经细胞分化，用无血清补充剂将培养基更换为无血清神经基础培养基（材料表）。将培养物保持在37°C，5%CO₂ 直到处理。

2. 慢病毒生产

注意:表 1列出了含有靶向CN-Aα亚型或CHOP的3'UTR的序列以及非靶向序列（加扰）的寡核苷酸。

1. 对于退火，使用退火缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5-8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将两个单链寡核苷酸与等摩尔量的互补序列混合。
2. 在95°C下加热2分钟，然后在室温下通过将样品从加热块或水浴转移到台面来缓慢冷却。将所得产物[具有内聚末端的短发夹RNA，（shRNA）]稀释至0.5μM的终浓度，等分并储存在-20°C。
3. 将shRNA插入片段克隆到慢病毒载体pLKO.3G中，GFP作为绿色荧光标记。为此，通过在无菌管中混合以下内容，用 EcoRI 和 PacI 限制性内切酶消化 1 μg 载体:2 μL 10 倍限制性内切酶缓冲液（100 μM 双三丙烷-HCl，pH 6.5，100 mM MgCl₂，1 mg/mL 牛血清白蛋白），1 μL 1 μg/μL pLKO.3G，0.5 μL 10 U/μL ECoRI， 0.5 μL PacI （10 U/μL） 和 16 μL 无菌离子水。
   1. 通过移液轻轻混合。将反应在37°C孵育3-4小时。
      注意:过夜消化通常是不必要的，可能导致DNA降解。
4. 对于连接，混合消化的载体并以3:1的摩尔比插入，并将其与T4连接酶和连接酶缓冲液（制造商提供）在16°C孵育过夜。
   注意:此时连接反应可以储存在4°C直至进一步使用。
5. 通过如下连接反应转化DH5α感受态细胞（材料表）或其他合适的 大肠杆菌 菌株。
   1. 将感受态 大肠杆菌 与连接反应总量混合，在冰上冷却15分钟，将其置于42°C浴中2分钟，然后再次在冰上冷却15分钟。
   2. 将承受热冲击的总体积转移到15 mL管中，并用先前保持在37°C的Luria-Bertani（LB）液体培养基将体积完成至1000μL。 在约330rpm的轨道振荡器中在37°C下摇动细菌90分钟。
   3. 在4°C下以5，000×g离心5分钟，弃去900μL上清液。使用剩余的上清液重悬沉淀。将细菌悬浮液均匀地铺在固体氨苄青霉素 （100 μg/mL） LB 平板上。
   4. 在37°C孵育过夜，然后检查细菌生长。此时，细菌可以在4°C下储存4-5天。
   5. 选择一个菌落转移到装有 10 mL LB 液体培养基和氨苄青霉素 （100 μg/mL） 的 50 mL 管中。在37°C以约330rpm摇动细菌。
   6. 将培养物离心以5，000×g在4°C下沉淀细菌5分钟，弃去上清液并保存细菌沉淀。这可以储存在-20°C。
6. 按照制造商的说明（材料表）使用细菌沉淀中的DNA纯化试剂盒纯化质粒。通过测量 260 nm 处的吸光度并乘以稀释因子来计算 DNA 浓度，使用以下关系:_{260 的 1.0 = 50} μg/mL 纯双链 （ds） DNA。

3.慢病毒感染

注意:在II类层流罩中执行慢病毒生成程序。

1. 转染前24小时，将1-5×10⁶ HEK 293细胞接种到8mL生长培养基中的100mm直径培养皿中，并在37°C，5%CO₂ 下孵育过夜。
2. 将 14 μg pKLO.3G 载体与特定插入片段、10.5 μg 包装质粒 psPAX 和 3.5 μg 包膜质粒 pMD2.G 混合（材料表）。在700μL还原血清培养基（材料表）中稀释45μL质粒转染试剂（材料表），并在室温下孵育5分钟。然后将DNA混合物与稀释的质粒转染试剂混合，轻轻混合，并在室温下孵育20分钟。
3. 同时，更换HEK 293细胞培养物培养皿的新鲜DMEM（转染时70%汇合）。然后逐滴添加整个体积的DNA溶液。轻轻摇晃盘子。转染后无需添加/更换培养基。
4. 将细胞在37°C，5%CO₂ 下孵育48小时-72小时，以使shRNA达到其最佳转导，使用荧光显微镜通过GFP荧光检查。之后，用慢病毒收集培养基并储存在4°C。
5. 用0.45μm尼龙膜过滤病毒上清液。将流出量分装在 1 mL 中。接下来，以17，000×g离心4小时。弃去上清液并保存沉淀。让看不见的颗粒干燥，干燥后储存在-80°C。
   1. 通过通量细胞术进行病毒滴定。在24孔板中接种4 x 10⁵ HEK 293细胞，并在37°C下孵育24小时。然后将病毒颗粒重悬于 200 μL DMEM 培养基中（材料表），并向每个孔中加入 0.05、0.02 和 0.005 μL。
   2. 孵育病毒感染72小时，除去培养基并胰蛋白酶消化（0.05%胰蛋白酶，1mL）3分钟。在 10% FCS 溶液中加入 1 mL DMEM，并以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液并用PBS洗涤沉淀两次。
   3. 用 100 μL PBS 重悬沉淀，并在 PBS 中用 100 μL 2% 多聚甲醛 （PFA） 固定细胞。用通量细胞仪分析细胞并确定GFP荧光细胞的百分比。使用以下公式收集此数据以计算病毒滴定:
      病毒滴定
      

4. 使用抗MAP2抗体对神经节苷脂GM2积累和免疫细胞化学进行应激的原代神经元培养

1. 用靶向CN-Aα或CHOP的3'UTR的特异性shRNA寡核苷酸感染原代皮质神经元培养物（体外15天），并在37°C下用5%CO₂ 孵育1天。
   注意:如果细胞显示高神经突生长，也可以使用体 外 7-8天的原代皮质神经元培养物。
   1. 在乙醇中制备500μM神经节苷脂GM2储备溶液，并将其超声处理1小时。
   2. 将GM2储备溶液以终浓度为2μM的培养皿中加入培养皿中。 允许在37°C下用5%CO₂ 孵育16，24和48小时。
2. 使用一些培养物制备用于蛋白质印迹分析的细胞匀浆（有关抗体规格，请参见 材料表）。
3. 按照步骤 1.4 操作。和 1.5。然后用4%PFA和120mM蔗糖在PBS中在37°C下固定细胞20分钟，然后用PBS洗涤。在湿室中的防滑膜上执行此过程。之后，加入透化溶液（PBS中的0.2%Triton X-100）5分钟，并用PBS洗涤。
   1. 使用在PBS中稀释的5%BSA45分钟以允许封闭，然后与抗MAP2抗体一起孵育，在封闭溶液中以1:800稀释，在4°C下过夜。
   2. 在孵育时间结束时，用PBS洗涤两次，并与二抗（材料表）孵育1小时。然后用PBS清洗细胞，并使用水性封片剂将玻璃杯安装到载玻片上（材料表）。

5.神经突萎缩分析

1. 使用配备CCD相机的落射荧光倒置显微镜，使用20倍空气透镜（NA 0.8）获取图像。使用 ImageJ 插件分析图像。为此，将图片加载到 ImageJ 并通过单击" 处理 |减去背景。
2. 点击 图片 |调整 |阈值 或键入以下键: Ctrl（或 Cmd）+ Shift + T。将弹出一个窗口以调整最小值，从而可以区分路径和 soma 跟踪。单击二进制图像（神经突和体细胞是白色的）。在此图像上，使用手绘选择删除相形图;选定的相马区域再次变为黑色。
3. 选择跟踪，然后单击 "编辑 |选拔 |创建选区。通过单击获得投资回报率 按 Ctrl （或 Cmd）和 T 键并保存它。打开原始图像，然后单击ROI管理器面板并选择之前获得的所属ROI。然后单击原始图像。
4. 在图像上跟踪ROI后，键入Ctrl（ 或Cmd） 和 M 键（分析|测量）。一扇窗户突然打开;复制平均值（任意单位 a.u.）以处理统计分析。
   注意:要获得μm的值，请单击 "分析"|"设置比例。将弹出一个窗口以设置值。请务必添加正确的刻度（"分析"|"设置比例），具体取决于所用显微镜的特性。

结果

在这里，我们解决了沉默两个PERK下游组件是否会影响ER应激细胞模型中UPR的过渡阶段的问题。为了实现这一目标，我们在原代神经元细胞培养物中通过两个特定的shRNA序列（表1）沉默CN-Aα基因和CHOP基因1^天10。通过蛋白质印迹分析表达（图1和图2）。在敲低细胞中观察到ER应激介导的CN-Aα和CHOP增加的明显抑制，...

讨论

我们描述了一种实验系统，该系统能够在神经元细胞模型中对从存活期到凋亡UPR期的过渡进行分子调节。

为了正确分析神经突萎缩，必须获得具有许多长而高度分支过程的原代神经元培养^物9，11。这有助于检查神经元过程延伸，从而可以检测到治疗之间的明显差异。重要的是要注意，如果体外7-8天的原代皮质神经元培养物已经显示...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330